Name: 鳥類胚性内耳神経における聴覚繊維の選択的なトレース (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 学ぶ 鳥類胚の聴覚繊維選択的トレース法。微小解剖と蛍光色素注入により、音響神経節から中枢神経系への軸索投射を可視化し、聴覚経路の発生機構を解明する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

著者らは、初期胚発生時にひよこ内耳の解剖学上の専門知識のためのイメージング技術と博士ドリス·ウーとの提案と支援博士キャンディHsieh氏に感謝したいと思います。この作品は、NSF、IOS-0642346、NIH T32-DC010775、NIH T32-GM008620、NIHのR01-DC010796、とDOE GAANN P200A120165によってサポートされていました。

1。以下解剖ツールおよび試薬を準備<ul><li>連続して95％Oを流し込んで、人工脳脊髄液（130mMのNaCl、3mMのKClを、1.2mMのKH 2 PO 4、20mMのNaHCO 3を 、3 mMのHEPES、10mMグルコース、2mMのCaCl 2、1.3mMのMgSO 4を ACSF）室温で2/5％CO 2で 。点滴は、2月3日ふたに穴を開けた500ml広口ナルゲン瓶に記入してください。タンクは瓶のふたの穴に通しACSFを貫通ガラスステムバブラーにチューブで接続されます。液体の約1/3に達するが、リムの上に飛散引き起こすのに十分な説得力がありません泡の一定のストリームを取得するために圧力を調整します。互いから、ガス流の乱れから、個々のサンプルを分離するナルゲン瓶に沈める5ミリリットルガラスバイアル（最大6）。 ACSFは、どの組織のインキュベーションの前に少なくとも20分間酸素化されるべきである。 </li><li>小さなシリコーン解剖皿（35ミリメートル×10小さな六角形のポリスチレンに配置された2つの解剖ピン付きシルガード弾性体キットを使用してmmペトリコーティング）（47ミリメートルの下）ボートの重量を量る。 </li><li>二つ精密チップ·鉗子、1湾曲先端鉗子、50mlビーカー、および組織廃棄用のコンテナ。 </li><li>ガラスマイクロピペット（1.2外径/ 0.9 ID）の先端の開口は約20から50程度に分割して0.4パーセントと6.25パーセント·ソリューションのトリトンX-100、PBS中におけるローダミンデキストランアミン（RDA、MW = 3000、Invitrogen社製）を充填した引っ張ら。マイクロマニピュレーターにpicospritzerして安定化する細かいチューブで取り付けます。 </li></ul> 2。顕微解剖E8 4,5で乳頭基部を明らかにする<ol><li>湾曲したピンセットで、ボートの重量を量る内にシリコーン被覆解剖皿に直接頭を置いて、ちょうど脳幹下E8胚を切った。 </li><li>興味のある側の耳が少し見えるように位置腹望むヘッドは、解剖のピンを使って、頭がわずかに背側に傾けて、CEから10から30度を指しているNTER（ 図2A）。すぐにピンと頭を固定します。二国間のトレースは、中心0度ヘッド、または両側がアクセスできるように、完全な腹ビューを希望する場合は。左側がアクセスしやすいように同様に、左サイド注入のために、中心から-30度〜-10で頭部を固定します。 </li><li> 50ミリリットルのビーカーを使用して、完全に組織を浸漬、皿に酸素化ACSFの30ミリリットルを転送します。 </li><li>そっとつかんで、精密チップ·鉗子を用いて下顎ダウンはがし、次に興味のある側に下瞼を削除します。 </li><li>残りの口蓋と食道を含め、上層の血管組織を削除します。これらの軟部組織が剥がれ、その表面に独特の椎骨動脈と軟骨頭蓋の開発の滑らかな表面を明らかにする必要があります。この時点では、特徴的な白いotoconial質量が見えるはずです。 </li><li>に残したまま、慎重に外尿道口、顎関節の軟骨、中耳の周りの​​皮膚を切開NERの耳無傷。そっとこれらの軟骨構造を切り取るために鉗子を使用しています。 </li><li>椎骨動脈を外し、細かい鉗子のヒントと穏やかな弧を描く動きを用いて血液をプール。血がビューと凝固がインジェクションピペットの開口部を塞ぐことが見えにくくなる場合があります。 </li><li>隣接感覚上皮（乳頭基部）と聴神経節と蝸牛管は軟骨頭蓋6の直下に位置し、前方の近くの最も遠位の先端（頂点）で、腹側内耳から延びる細長い指状の突起として可視化することができる正中線5。視覚化するのを助けることができる蝸牛管（ 図2B）の頂点に解離および/ ​​またはotolithic石灰（白）から少量の血液プーリング（赤）があるかもしれません。頂点にlagenar黄斑ですが、感覚パッチは前庭機能7,8であると思った。 </li></ol> 3。 CN VIII聴覚繊維の選択的標識<ol><li&gt;蝸牛管と乳頭基部領域における胚の表面付近インジェクションピペットを置きます。 </li><li>最初はゆっくり穿刺頭蓋にマイクロピペットを下げます。この頭蓋領域は、周辺地域よりも薄く、小さい力が浸透している必要があります。マイクロピペットは現在、蝸牛管の内側になければなりません。オプション：トレース染料の小さな注射は乳頭基部を視覚化するのを助けるためにここで行うことができます。 </li><li>マイクロピペットの位置を変更せずに、単に侵害それまで蝸牛管（ 図1）の深い境界線を下げ続けている。ここに注射を行うと前庭つぼが置かれている最も近位チップを除く、乳頭基部（ 図2C、2D）の長さ方向に沿って複数の地域で繰り返す。 10から30 psiの間に設定picospritzerで、いくつかの注射が行われます。注入された色素の流体の体積は変化し、所望の標識の程度に依存する。各注射は蛍光色素ラをもたらすべきである約200のbeledスポット- 400μmの直径（ 図2D）。 </li><li>注入が完了すると、脳幹上記サンプルを横断すると、継続的に95％O 2/5％CO 2下で灌流さACSFのコンテナ内に小さな瓶に尾部を配置するためにホールピペットを使用する鉗子を使用しています。 </li><li>各胚については、目的の中央トレースの距離に応じて、移染のために20-30分を許可します。 </li><li>組織を除去し、組織学的切片の準備をします。ここに示す例では、組織は4％パラホルムアルデヒド（1X PBS中）を一晩一晩、30％スクロース（1X PBS中）に浸漬されている。 </li></ol> 4。対比と分析<ol><li>対比は、解剖学的位置に向きをオブザーバを助けるだけでなく、関心のある特定の領域を識別するのに便利です。この製剤における有効対比を強くリットルニューロフィラメント免疫標識（ 図1、図3B、3E）であり、abelsは、軸索と中枢神経の軸索路の区分を可能にします。 </li><li>予測はrostrocaudal軸に沿って数百ミクロン以上を拡張することができますように分析は、標識された地域全体で行うべきである。基本的な分析のいくつかの例は以下のとおりです。ターゲットエラーレート、タイミングおよび/または投影パターンの発散の変化。 RDA-標識軸索は、高解像度（ 図3A、3D）と末梢および中枢神経系において可視化される。 </li></ol>

<ol><li>Groves, A. K., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+sound+in+space%3A+the+regulation+of+inner+ear+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning.</a> Development. 139, 245-257 (2012).</li>
<li>Pflieger, J. F., Cabana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vestibular+primary+afferents+and+the+vestibulospinal+projections+in+the+developing+and+adult+opossum%2C+Monodelphis+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica.</a> Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).</li>
<li>Molea, D., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+topography+of+nucleus+magnocellularis+innervation+by+the+cochlear+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Timing and topography of nucleus magnocellularis innervation by the cochlear ganglion.</a> The Journal of Comparative Neurology. 466, 577-591 (2003).</li>
<li>Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+atlas+of+the+gross+anatomy+of+the+developing+inner+ear+of+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken.</a> The Journal of Comparative Neurology. 368, 620-630 (1996).</li>
<li>Brigande, J. V., Kiernan, A. E., Gao, X., Iten, L. E., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+pattern+formation+in+the+inner+ear%3A+do+compartment+boundaries+play+a+role%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of pattern formation in the inner ear: do compartment boundaries play a role.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11700-11706 (1073).</li>
<li>Bellairs, R., Osmond, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBellairs%2C+R+%22The+atlas+of+chick+development%22">The atlas of chick development</a>. , 2nd Edn, Elsevier. (2005).</li>
<li>Manley, G. A., Haeseler, C., Brix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+patterns+and+spontaneous+activity+of+afferent+fibres+to+the+lagenar+macula+and+apical+basilar+papilla+of+the+chick%27s+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Innervation patterns and spontaneous activity of afferent fibres to the lagenar macula and apical basilar papilla of the chick's cochlea.</a> Hearing Research. 56, 211-226 (1991).</li>
<li>Code, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efferent+neurons+to+the+macular+lagena+in+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Efferent neurons to the macular lagena in the embryonic chick.</a> Hearing Research. 82, 26-30 (1995).</li>
<li>Maklad, A., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+vestibular+afferent+projections+into+the+hindbrain+and+their+central+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Development of vestibular afferent projections into the hindbrain and their central targets.</a> Brain Research Bulletin. 60, 497-510 (2003).</li>
<li>Rubel, E. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+system+development%3A+primary+auditory+neurons+and+their+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Auditory system development: primary auditory neurons and their targets.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).</li>
<li>Satoh, T., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+analysis+of+inner+ear+cells+using+genomic+tags+for+clonal+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lineage analysis of inner ear cells using genomic tags for clonal identification.</a> Methods Mol. Biol. 493, 47-63 (2009).</li>
<li>Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+morphogenesis+of+the+vertebrate+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51, 521-533 (2007).</li>
<li>Appler, J. M., Goodrich, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+the+ear+to+the+brain%3A+Molecular+mechanisms+of+auditory+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Connecting the ear to the brain: Molecular mechanisms of auditory circuit assembly.</a> Progress in Neurobiology. 93, 488-508 (2011).</li>
<li>Bulankina, A. V., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuit+development+in+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Neural circuit development in the mammalian cochlea.</a> Physiology (Bethesda). 27, 100-112 (2012).</li>
<li>Fekete, D. M., Campero, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axon guidance in the inner ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51, 549-556 (2007).</li>
<li>Momose-Sato, Y., Glover, J. C., Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+functional+synaptic+connections+in+the+auditory+system+visualized+with+optical+recording%3A+afferent-evoked+activity+is+present+from+early+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Development of functional synaptic connections in the auditory system visualized with optical recording: afferent-evoked activity is present from early stages.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 1949-1962 (2006).</li>
<li>Marrs, G. S., Spirou, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+assembly+of+auditory+circuits%3A+spiral+ganglion+and+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem.</a> The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).</li>
<li>Milo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+the+function+of+the+transcription+factor+gata3+during+development+of+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear.</a> PloS One. 4, e7144(2009).</li>
<li>Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bHLH+genes+in+ear+development+and+evolution%3A+revisiting+a+10-year-old+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).</li>
<li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurod1+regulates+survival+and+formation+of+connections+in+mouse+ear+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain.</a> Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).</li>
<li>Huang, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brn3a+is+a+transcriptional+regulator+of+soma+size%2C+target+field+innervation+and+axon+pathfinding+of+inner+ear+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons.</a> Development. 128, 2421-2432 (2001).</li>
<li>Jones, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Gata3+transcription+factor+in+the+acoustic+ganglion+of+the+developing+avian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).</li>
<li>Lu, C. C., Appler, J. M., Houseman, E. A., Goodrich, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+profiling+of+spiral+ganglion+neurons+reveals+insights+into+auditory+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Developmental profiling of spiral ganglion neurons reveals insights into auditory circuit assembly.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 10903-10918 (2011).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されていません。

VIIIth神経の早期開発の研究があるため、複数の別個の神経節から生じる胚軸索を識別するのに難しさの一部に限られていた。いくつかの研究は、初期の開発中に、聴覚と前庭感覚細胞と神経節細胞の運命を導く分子シグナル、5,11,12を検討されているが、中枢神経支配を規制するプロセスがまだ決定されています。レスがプライマリ核に投射する中央のプロセスについてはほとんど知られていないのに対し、音響神経節細胞突起のレポートは、通常、感覚上皮13から15に周辺プロセスについて説明します。胚発生時の中央に突出する第VIII因子の細分の研究では、哺乳類の組織切片17にニワトリ胚後脳16またはカルシウムイメージングでは、このような光学録音のように、頻繁に電気生理学的であるが、神経回路の完了前に実行することはできません。ラベルへの免疫学的マーカーの使用ひよこVIIIth神経における聴覚軸索は現在可能ではありません。転写因子の異なるグループが前庭ニューロン18から23対聴覚との相関が発見されましたが、これらの因子の発現は、軸索から除...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>ポリスチレンは皿を計量</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 02-202-101 </td><td></td></tr><tr><td>シャーレ、35 X 10ミリメートル</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 50820644 </td><td>シリコーン解剖皿を作るために使用</td></tr><tr><td>シルガードシリコーンエラストマーキット</td><td>ワールド·精密機器</td><td> SYLG184 </td><td>コー​​トペトリは、解剖皿を作る</td></tr><tr><td>解剖ピン</td><td>さまざまな</td><td></td><td>解剖時に所定の位置に胚を保持</td></tr><tr><td> NACL </td><td>さまざまな</td><td></td><td> ACSFレシピの一部</td></tr><tr><td> KClを</td><td>さまざまな</td><td></td><td> ACSFレシピの一部</TD&gt; </tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td>さまざまな</td><td></td><td> ACSFレシピの一部</td></tr><tr><td> NaHCO 3を </td><td>さまざまな</td><td></td><td> ACSFレシピの一部</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>さまざまな</td><td></td><td> ACSFレシピの一部</td></tr><tr><td> CaCl 2を </td><td>さまざまな</td><td></td><td> ACSFレシピの一部</td></tr><tr><td> MgSO 4を </td><td>さまざまな</td><td></td><td> ACSFレシピの一部</td></tr><tr><td> ACSF用のコンテナ。蓋付き透明広口ナルゲン瓶、500ミリリットル（16オンス）を示唆している。 </td><td> CPLabSafety </td><td> QP-PLC-03717 </td><td>液体浸透するガラスbublingステム用蓋の上部の穴の開口部をドリル</td></tr><tr><td>空の5ミリリットルのガラスバイアルまたは同等の透明バイアル</td><td>アメリカの製薬パートナーズ株式会社</td><td> 6332300105 </td><tD&gt;互いにおよびバブリングストリームからサンプルを別々に保管するACSFのインキュベーション中に使用</td></tr><tr><td>バブラーにチューブで接続されたcarbogenのタンク（95％O 2/5％CO 2）で</td><td>さまざまな</td><td></td><td> ACSFへの注入用ガラス幹バブラーに管によってアタッチ</td></tr><tr><td>ガラス幹バブラー</td><td>さまざまな</td><td></td><td> ACSFにcarbogenを注入する</td></tr><tr><td>先の曲がった鉗子</td><td>ワールド·精密機器</td><td> 501008 </td><td>卵から胚の頭部を削除するには</td></tr><tr><td>二つ精密チップ·鉗子</td><td>ワールド·精密機器</td><td> 501985 </td><td>顕微解剖用</td></tr><tr><td> 50mlビーカー</td><td>さまざまな</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ローダミンデキストランアミン（RDA） </td><td>インビトロジェン</td><td>さまざまな</td><td>蛍光軸索トレーサー</td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td> ICNバイオメディカル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩は、（1×PBS）、緩衝生理食塩水</td><td>さまざまな</td><td></td><td>標準的な実験用試薬</td></tr><tr><td>薄壁ガラスキャピラリー、外径1.2、0.9番号4 &quot;（100mm）の長さ</td><td>ワールド·精密機器</td><td> TW120F-4 </td><td> RDAを使用したロード。各キャピラリーは、2枚のガラスマイクロピペットを作る</td></tr><tr><td>ニードル/ピペットプラー</td><td>デビッドKopfはインスツルメンツ</td><td>モデル720 </td><td>使用される設定：熱16.4、ソレノイド2.2 </td></tr><tr><td> Picospritzer </td><td>パーカー計装用</td><td>さまざまな</td><td>ガラスマイクロピペットを微管によって取り付け</td></tr><tr><td>極微操作装置</td><td>ナリシゲ</td><td>さまざまな</td><td></td></tr><tr><td>蛍光と解剖顕微鏡</td><td>さまざまな</td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> 4％パラホルムアルデヒド</td><td>さまざまな</td><td></td><td>標準的な実験用試薬</td></tr><tr><td>抗ニューロフィラメント抗体、オプション</td><td>ミリポア</td><td> AB1991 </td><td>メーカーが推奨する組織学的なプロトコルに従ってください</td></tr><tr><td>クライオスタットとセクショニングの関連材料</td><td>ライカ</td><td>さまざまな</td><td></td></tr><tr><td>イメージングのための落射蛍光顕微鏡</td><td>ツァイスは、様々な</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

鳥類胚性内耳神経における聴覚繊維の選択的なトレース

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

ニワトリ胚は、末梢および中枢神経節細胞の突起の研究のために広く使用されているモデルです。聴覚系では、VIIIth脳神経内聴覚軸索の選択的標識は、中枢聴覚回路発達の研究を強化するであろう。内耳の複数の感覚器官がVIIIth神経1に貢献するため、この方法は困難である。また、確実に鳥VIIIth神経軸索内の前庭グループに対して聴覚を区別するマーカーが同定されていない。回路が形成される前に、感覚誘発反応が存在していないとして、聴覚と前庭の経路は、初期胚において機能的に区別することはできません。一元的に突出したVIIIth神経軸索は、いくつかの研究でトレースされているが、聴覚軸索標識は他のVIIIth神経コンポーネント2,3からラベリングを伴っていた。ここでは、音響神経節から選択ラベへのトレースを順行するための方法を説明します開発VIIIth神経内のL聴覚軸索。まず、酸素人工脳脊髄液中に浸漬し、8日、ニワトリ胚の前頭部の部分切開した後、蝸牛管は、解剖学的なランドマークによって識別されます。次に、罰金引かガラスマイクロピペットは、音響神経節細胞が配置されているダクトと隣接深い領域にローダミンデキストランアミンを少量注入するように配置されている。注射後30分以内に、聴覚軸索は後脳に集中的に追跡され、後に、次の組織学的準備を可視化することができる。この方法では、中枢聴覚回路形成に周辺の発達研究のための便利なツールを提供します。

VIIIth神経と神経自体の解剖学的構造のコンポーネント（ 図1、図3）、複雑で入り組んである。選択的に音響神経節細胞から生じる繊維をトレースすることにより、脳幹内VIIIth神経だけでなく、一次聴覚求心性神経のセグメントがきれいにトレースすることができるとその前庭の対応（ 図2、図3）とは区別される。同様に、この技術は、音響神経節細胞の周辺の突起（ 図3G）を研究するために使用、または個々の前庭器官から生じる予測を研究するために変更することができます。軸索が正常に彼らの全体の長さに沿ってトレースされますので、正確な定量分析を加えて、聴覚繊維標識の前のアプローチとは異なり、初期の神経支配の正確なタイミングやパターンなど、開発時前庭予測、ターゲティングエラー率などから区別聴覚を行うことができますこのアプローチは、性能です非固定、生体組織のMEDとは、このようにin vitroの実験で 、他に同時使用することができます。 このテク...

ここでは、神経と後脳における聴覚軸索線維の選択的なトレースのための初期のニワトリ胚の音響神経節への蛍光色素を注入し顕微解剖法を説明します。

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

本手順の目的は、胚において末梢神経系から中枢神経系への聴覚線維を選択的に追跡することです。まず、マイクロドーズ切断を行い、腹側軟骨頭蓋を露出させて鳥類の蝸牛管を特定します。次に、その下層にある聴神経節細胞およびその軸索へマイクロインジェクションを行います。次に、DIAの移行を促すため、サンプルを酸素供給済みの人工脳脊髄液で20分間インキュベートします。最後に、組織の組織学的調製と切片作成を行い、音響神経節の中心投射を顕微鏡で可視化します。既存の手法に対する本手法の主な利点は、第8脳神経を選択的にトレースできることです。高解像度の聴覚線維を用いることで、生体組織内での迅速な色素転移が可能となり、発生の初期段階における実験が行えます。この手法は、聴覚研究分野における重要な疑問の解決に寄与します。例えば、軸索を中心標的に導く分子は何であるか、といった点です。あるいは、神経回路は損傷や耳毒性物質への曝露にどのように反応するのでしょうか。まず、500 mLの広口Nalgeneボトルに、ボトルの3分の2が満たされるまで人工脳脊髄液を加えます。穴が開いた蓋をボトルに締め直します。95%酸素および5%二酸化炭素のタンクに接続したステムバブラーを、蓋の穴を通してA CSFの中に入れます。ガスを供給し、気泡が液面の約3分の1まで一定に上昇し、かつ縁から液が飛び散らない程度の圧力に調整します。個々のサンプルを分離するため、5 mLのガラスバイアルを最大6本までジャーの中に浸します。また、ガス流の乱流からも注意してください。A CSFを少なくとも20分間酸素化させます。A CSFの酸素化が進む間に、ガラスマイクロピペットを準備し、0.4% Triton XXを含むPBSで調製した6.25% rhodamine dextranおよび免疫溶液でマイクロピペットを充填します。マイクロピペットをマイクロマニピュレーターに取り付け、微細ピンセットで先端を砕いて20～50 micronの開口部を作ります。細いチューブを用いて、固定したマイクロマニピュレーターをピコスプリッツァーに接続してください。セットアップの残りを完了させるため、ピコスプリッツァーを10〜30 PSIに設定します。小さなシリコン解剖皿に、2本の解剖ピンを小さな六角形を描くように配置してください。また、2本の微細先端ピンセットを用意します。解剖エリアに、湾曲先端ピンセット、50 milliliterのビーカー、および組織廃棄物用容器を用意します。卵からニワトリ胚を取り出した後、頭部をシリコンコーティングされた解剖皿の上に置きます。ウェーボート内で、関心のある側（この場合は右側）の耳が見えるように、頭部を腹側から見える位置に配置します。正しい位置に配置したら、後脳領域を避けて解剖ピンで組織を固定します。50 milliliter

selective-tracing-auditory-fibers-avian-embryonic-vestibulocochlear

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

哺乳類の蝸牛の内有毛細胞のリボンシナプスにおける聴覚神経線維の樹状突起からのホールセルパッチクランプ記録。...

蝸牛内有毛細胞に接触求心性樹状突起でのシナプス後録音：リボンシナプスでのモニタリングの多胞体のリリース

このビデオは、実験室の設定でくさび形の脳スライスを準備するプロセスを示しています。ビブラートームを使用して、マウスの脳からくさび形のスライスをさまざまな厚さで作成します。このスライスには、太い方の端にある聴覚神経根が含まれており、細い方の端には聴覚関連のニューロンが配置されています。...

聴覚ニューロンを可視化するためのくさび脳スライスの準備

発達神経生物学の根本的な問題はどのように神経細胞のネットワークが胚の脳の中で確立されています。ここでは、そのようなのCre /...

ニワトリ胚における軸索軌道とシナプスターゲットを追跡する後脳のエレクトロ

私たちは、胚マウスの内耳からの蝸牛外植片の分離と培養を説明する方法を提示します。 また、方形波エレクトロポレーションによる蝸牛外植片への遺伝子導入法も示しています。in...

エレクトロポレーションによりマウス胎児蝸牛外植の文化と遺伝子導入

聴覚器官は聴覚を媒介します。ここでは、発育中のニワトリ聴覚器官における聴覚前駆細胞の増殖と分化を研究するために最適化された、修正されたin...

チキン聴覚器官への遺伝子導入によって、<em&gt;卵内</em&gt;マイクロエレクト​​ロポレーション

鳥類および哺乳動物の聴覚脳幹ニューロンは、正常な聴覚機能のための基本的なプロセスである高速神経エンコーディングに特化しています。これらのニューロンは、胚後脳の別個の前駆細胞から生じる。我々は、聴覚発達中の遺伝子機能を研究するために、ニワトリ胚の後脳における遺伝子を発現させるためにエレクトロポレーションを利用する技術を提示する。...

鶏の聴覚脳幹における卵の電気穿孔

ここでは、1つの脳幹スライス内のトノトピック特性と発生軌跡を調べるために、ニワトリ胚の非冠状聴覚脳幹スライスを取得するためのプロトコルを提示します。これらのスライスは、矢状、水平、および水平/横セクションを含み、従来の冠状セクションよりも個々のスライス平面内のより大きなトノトピック領域を包含する。...

胚性ニワトリ聴覚脳幹をスライスしてトノトピック勾配とマイクロ回路を評価する

私たちは標準的な聴覚脳幹応答(ABR)技術を使用し、聴覚機能のための早熟な鳥類モデルである孵化鶏に適用しました。このプロトコルは、動物の準備とABRの獲得技術を詳細に概説し、他の鳥類またはげっ歯類のモデルに翻訳できる手順を示しています。...

ニワトリ孵化子の聴覚脳幹応答の評価

ひよこは、さまざまな研究のために費用効果が高く、アクセスしやすく、広く利用可能なモデル生物です。ここでは、鳥類の内耳の発達と再生の根底にある分子メカニズムを理解するための一連のプロトコルが詳述されています。...

鳥類の内耳の発達を研究するためのOvoおよびEx Ovoの方法

ovoエレクトロポレーションを用いて、ニワトリ胚の聴覚内耳と蝸牛核を選択的にトランスフェクションし、回路アセンブリの離散期に脆弱X精神遅滞タンパク質の細胞群特異的ノックダウンを達成する方法を考案しました。...

聴覚回路における脆弱X精神遅滞タンパク質の細胞自律機能をIn Ovo エレクトロポレーション法で解剖

ここでは、内耳の前庭神経節および螺旋神経節ニューロンからの解剖、解離、培養、およびパッチクランプ記録の詳細な手順を提供する方法を示します。...

パッチクランプ記録のための新生児げっ歯類からの前庭およびらせん状神経節体細胞の分離と培養

学ぶ 鳥類胚の聴覚繊維選択的トレース法。微小解剖と蛍光色素注入により、音響神経節から中枢神経系への軸索投射を可視化し、聴覚経路の発生機構を解明する。

鳥類胚性内耳神経における聴覚繊維の選択的なトレース

さらに動画を探す