Name: シングル細胞におけるゼブラフィッシュセグメンテーション時計のイメージングのための分散前体節中胚葉細胞培養物の世代 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 学ぶ ゼブラフィッシュの前体節中胚葉細胞を分散培養し、蛍光レポーターを用いて単一細胞レベルでサイクリック遺伝子発現の振動を長時間イメージングする方法。セグメンテーション時計の動態をリアルタイムで観察し、発生生物学の研究に応用できる。

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この作品は、EMBO長期フェローシップ（ABW）、国立科学財団国際ポスドク研究フェローシップ（ABW）、マックスプランク研究機構（ABW、DS、JS、ACO）、DIGS-BBのフェローシップ（AO）によってサポートされていましたおよび欧州共同体セブンス枠組み計画STG-207634（DS、ACO）の下で、欧州研究会議。私たちは、原稿上の有益なコ​​メントをラヴィデサイに感謝します。また、ゼブラフィッシュFibronectin1フラグメント、ケア、私たちの魚のラインと画像化をサポートするためのMPI-CBG光学顕微鏡設備の維持管理のためのMPI-CBG魚施設のスタッフの生産のために、MPI-CBGタンパク質発現機構に​​感謝したいと思います。

1。解剖の前に<ol><li>解剖前日に、トランスジェニック対立遺伝子に関してヘテロゼブラフィッシュのペアのインクロスから胚を得る。 <ol><li>シールド段階（6時間受精後）まで、28 O CでのメチレンブルーずにE3培地中で胚を上げる。 </li><li> 20 O、CO / NにメチレンブルーのないE3培地で移植胚彼らは尾芽段階に達すると20 度Cで、胚は、時間ごとに1体節を形成することになる。 20 O Cでの17〜20時間、O / N後、胚を解剖プロトコルの先頭に次の朝、ステージ5から8体節にあるべきである。 </li></ol></li><li>解剖のために必要なツールおよび試薬を組み立てます。 <ol><li>胚および組織の移転のためのファイアーポリッシュガラスピペット</li><li>胚から絨毛膜を除去するための細かいピンセット</li><li>解剖用SYLGARDでコーティングされた35-mmディッシュ - 35ミリメートル皿にシルガードポリマーを注ぎ、37℃でO / Nを治す使ってよく解剖をする硬化したポリマーの小さなボリュームを削除し、針の先端。皿を洗浄し、続いて再利用することができる。 </li><li> PSMの組織操作のための先鋭化、フラット化タングステン線ツール</li><li>文化にPSMの所望の部分を切断するためのマイクロ手術用メス</li><li>トリプシンインキュベーションのための35mmのプラスチックシャーレ</li><li> 10％ウシ胎児血清を含むL15培地</li><li> 0.25％トリプシン/ EDTA溶液</li><li>分散のためのSigmacotedゲルロ​​ーディングのヒント</li><li>メチレンブルーずにE3培地を含むプラスチックペトリ皿。 </li></ol></li><li> Fibronectin1基板（PBS中10μg/ mlの）とグラスボトムイメージング料理をカバーしています。解剖時にコーティングするためにベンチで料理をしておきます。 </li><li>識別するために、適切な蛍光フィルターとソート正トランスジェニック胚（5から8体節期）とステレオスコープを使用してください。 <ol><li>蛍光チャンネル（ 図1A）の下で、YFPの発現前体節中胚葉（PSM）を調べることによって、トランスジェニック胚を特定します。蛍光翔ULDは尾芽の最後に形成された体節の領域に見えるように。最も明るい信号に胚を選択します。子孫の25％が導入遺伝子の2コピーを有するホモ接合胚である必要があります。必要に応じて特定された胚の数は、実験に基づいて変化します。一解剖し尾芽胚ピースは、平均して、1,000個の細胞が得られます。一般的には、いくつかの追加の正の胚は、解剖中に行われた場合のエラーが発生するのに有用である。 </li><li>信号から、特に卵黄細胞において、任意の自己蛍光を区別するために、位置基準として透過光を使用する。 </li><li>メチレンブルーずにE3培地を含む別々のプラスチックシャーレに正の胚を転送します。 </li></ol></li></ol> 2。PSM切開および散布<ol><li>解剖のための胚を準備します。 <ol><li>解剖顕微鏡下で、細かい鉗子を使用して、慎重にE3培地に各胚から絨毛膜を除去します。胚に損傷を与えたり、卵黄細胞を破壊しないように注意してください。 </lI&gt; <li>血清を含むL15培地でのSylgardでコーティングされた解剖皿に入れます。鉗子または他の平らなツールを使用して、シルガードの表面から気泡を除去する。 </li><li>解剖皿にファイアーポリッシュガラスピペットを使用して絨毛膜を除去した胚を転送します。 </li><li>ワイヤーツールを使用して、解剖皿の片側にすべての胚を移動します。 </li></ol></li><li>シングル胚からPSMを解剖。 <ol><li>オリエントよく解剖皿（ 図1B）内のSylgard層で行われた小さなその横側に、単一の胚。 </li><li>マイクロメスを用いて、単に後脳に、胚の腹側の極（ 図1B、赤い点線）を介して前方胚および卵黄細胞をスライス。 </li><li>皿の側にそれを離れて移動し、井戸から胚の前方部分を削除してから、PSMなどの後方部分から離れて、残りの卵黄細胞の顆粒をこすり、ワイヤツールを使用しています。 </li><li>卵黄が削り取られた後、平らにし、離れて、実験者から向いて前方端とのPSMおよび実験（ 図1C）の方を向いて後方に向けます。 </li><li>外胚葉の薄い層が、この時点ではオフに引っ張られていない場合は、離れてPSM組織の上からそれを剥離する線ツールを使用しています。 </li><li>マイクロメスを使用すると、離れた組織の他の部分（ 図1C、赤い点線）から、脊索の終端を越えて尾芽胚、PSMの最も後方の先端を切った。注：PSMからの組織の他の部分は、最後に形成された体節に近い例前方PSMのために、また、実験的な質問に応じて、文化に撮影することができます。 </li><li>離れて解剖エリアから皿の1コーナーに尾芽胚ピースを移動します。解剖フィールドからごみや不要な胚組織をクリアするために、ワイヤ·ツールを使用してください。 </li><li>次の胚を繰り返します。 </li></ol></li><li>プールは、複数の電子からの作品を尾芽胚mbryos、実験に必要とされるセルの数によって異なります。平均して、尾芽胚組織の一枚は、1,000個の細胞が得られます。 </li><li>トリプシン-EDTA少量の空の35 mmのプラスチック製の皿を埋める。 </li><li>ファイアーポリッシュガラスピペットを使用して、トリプシン/ EDTAを含む皿に料理を解剖から尾芽胚曲を転送します。 RTで20分間、トリプシン/ EDTAで尾芽片をインキュベートする。 </li><li>組織は、トリプシン中でインキュベートされている間に、ガラス底のイメージング皿からFibronectin1溶液を除去。 <ol><li>ミリQ水でガラスから3回のソリューションを洗浄します。各洗浄を削除し、料理は完全に乾燥していることを確認するために吸引を使用してください。 </li></ol></li><li>イメージング用培地で尾芽胚片を分散させる。 <ol><li>イメージング皿に血清をL15培地100μlをピペットで。 </li><li>コー​​ティングされたゲルの先端を使用して、可能な限り少量のトリプシン/ EDTAから尾芽胚片を取り除く。 </li><li>培地中に尾芽胚片をピペットイメージング一品。それらを分割し、培地中で細胞を懸濁するために上下に複数回の部分をピペット。気泡を導入しないように注意してください。顕微鏡下で細胞塊を確認し、必要に応じてより多くを分散させる。 </li><li>懸濁液中の分散した細胞を、室温で20分間Fibronectin1コーティングガラス上に沈降させる。 </li></ol></li><li>イメージングを開始する前に、細胞に血清を追加L15培地を少量を追加します。落ち着いた細胞を破壊しないように注意して使用してください。 </li><li>実験の質問を考えると、文化に任意の補足的または薬物治療を追加します。 </li></ol>分散PSM細胞の3。イメージング<ol><li>タイムラプスイメージング顕微鏡で恒温槽内イメージングの皿を設定します。実験のために所望の温度にワーナー室を設定します。料理は、画像取得を開始する前に、少なくとも30分間平衡化することができます。必要であれば外部温度プローブとクロスチェック温度は、皿に入れた。注：ために温度や体節形成率21安定した温度制御との関係は、単一のPSM細胞における期間の正確な測定のために不可欠です。 </li><li>露光時間と利得が雑音レベルに良好な信号を確保するために、飽和することなく、強度の大きなダイナミックレンジを提供することを確認するために蛍光チャンネルにおけるテスト画像を取得する。このプロトコルを使用して私たちのラインから生成され分散した細胞から得られた典型的な蛍光画像は、85のEMゲインで動作EMCCDカメラで透過光画像用の400ミリと40ミリ秒を必要としますから、また、プリアンプ·ゲインと読み出し速度カメラはノイズで信号を最大化するために不可欠である。 </li><li>透過光チャネルを使用して、タイムラプス取得のための細胞のフィールドを選択します。 </li><li>所望の時間のために、タイムラプス取得プロトコルを実行します。 <ol><li> 1透過光と、フィールドごとに1つの蛍光画像を取得。注：取得ROの間隔を設定します。拡張された画像の上に、光退色や細胞内で毒性を誘発することなく、時間的なダイナミクスをキャプチャしますunds。このプロトコルは、2分間隔を使用しています。 </li></ol></li><li>細胞は、ソフトウェアやハードウェアのエラーなど焦点に残ることを保証するために、記録中に時折タイムラプスセットアップをチェックしてください</li></ol>取得した時間経過の映画の4の画像処理<ol><li>開いた動画像処理ソフトで取得したフィールドのファイル。 NOTE：フィジーは、このプロトコルの全ての処理のために使用した。 <ol><li>画像の2スタックを作成するために1フィールドからの透過光と蛍光のフレームを分割します。 </li></ol></li><li>透過光チャネル内の単一のセルを追跡します。 <ol><li>透過光チャネルの最初のフレームで選択したセルの周囲に円形のROI（関心領域）を配置します。注：1録画終了時に健康な細胞のみ、2は、フィールドの外に移動しない、および3は、他のCEと接触しない。LLSは、追跡される。 </li><li> ROIのROIマネージャーに数フレームごとに保存します。最後のフレームまでのセルを追跡します。 </li></ol></li><li>蛍光チャンネルに保存されたROIを使用して強度を測定する。 <ol><li>蛍光スタックを選択し、保存された関心領域を、時間をかけて追跡し、細胞の強度を測定するためのカスタム·サークル補間プラグインとマクロを使用します。 </li><li>マクロからの出力トレースを確認してください。トレースは定性的蛍光タイムラプスの特徴を捉えた場合、Excelのワークシートに値をエクスポートします。 </li><li>セルのためのROIリストを保存します。 </li></ol></li><li>送信されたチャネルで追跡し、フィールド内の他のセルの蛍光チャネルで測定を繰り返します。 </li><li>実験からの追加フィールドのすべての手順を繰り返します。 </li></ol>

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<li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock%3A+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1313-1318 (2006).</li>
<li>Soroldoni, D., Hogan, B. M., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+transgenesis+with+meganuclease+constructs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient transgenesis with meganuclease constructs in zebrafish.</a> Methods in molecular biology. 546, 117-130 (2009).</li>
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</ol>

著者の貢献： ABWが開発され、分散、培養、イメージング、細胞トラッキングプロトコルを洗練。 DSはトランスジェニック系統を生成し、このプロトコルで使用されるタイムラプス蛍光顕微鏡の設計を監督した。 AOは培養液中で解離し、画像PSM細胞に初期原理証明実験を開拓してきました。 JSフィジーの円補間プラグインツールは、タイムラプスムービーからの蛍光強度を測定するために使用さ書いた。 ABWとACOが​​原稿を書いている。

胚発生の過程で起こる細胞プロセスを研究するために、生物学者は、典型的には、胚全体のコンテキスト内でのアプローチを利用する。しかし、完全に単一のセルが発達時間枠内でどのように動作するかを理解するために、分離して個々の細胞を調べ、混乱させる方法も非常に有益である。トランスジェニックゼブラフィッシュの胚を用いて分散PSM細胞培養物を生成することによって、我々は今、直接、定量的な方法でセグメンテーションクロックの遺伝的振動の細胞自律的な性質を研究するためのツールを持っている。これは、様々な条件下で細胞の数百のお蛍光レポーターの振動のダイナミクスを測定することが可能である。 培養中の単一細胞の観察期間が長く無傷の胚における体節形成の期間よりも長い。我々は、培養中のインタクトPSM外植片もまた股関節を示唆し、無傷の胚（データは示していない）よりも遅い振動を示すことを観察する単離された細胞で観察されたより長い周期T単に分散による損傷によるものではない。可変周期および振幅は、我々の単一細胞時系列のほとんどで観察される。この変動の原因は不明であるが、セグメンテーション·クロックのペース意思回路に関する重要な詳細を明らかにする必要があります。 この方法では、我々は、細胞レベルでのセグメンテーションの遺伝的要素を研究し、全胚で調べることに挑戦している問題に対処することができます。たとえば、私たちの文化に、発生中の胚で発見、既知のシグナル伝達分子の制御を加えることにより、我々は、堅牢で再現性のあるアッセイにおいて単一のPSM携帯発振器に与える影響を調べることができます。我々のPSM培養系は、単独で、どのような要因の厳格な評価への扉を開き、または組み合わせでこれらの振動を阻害し、そのような分子間の相互作用を試験するためにどのような要因は、これらの細胞における振動を促進する。手にこれらのツールにより、我々はすることを目指し胚全体で試験することができる予測を生成するために、単一細胞内に存在する公開された組織レベルのデータに基づいて体節形成のモデルならびに使用実績を評価する。 我々の知る限りでは、これは、単一細胞内の蛍光の急性タイムラプス撮影の最初のゼブラフィッシュの一次細胞培養プロトコルです。このプロトコルの更なる発展と改良が可能間違いないです。他のプロトコルは、しばしば、レポーターでトランスフェクトし、長期撮像27-29のために使用することができる安定な細胞株を生成するためにゼブラフィッシュ胚を使用する。安定株は、概日時計などの開発時期に結ばれていないプロセスを画像化するために有用であるが、細胞がその振動は、前駆状態にある間に、胚分割の問題は、すぐに画像を必要とする。細胞は、発振停止と、それらは分化した細胞の運命を想定し、そして組織において、体節中に組み込まれるとき。それはPOである右因子またはin vitroで存在する因子と我々はかなり長期的な観測、複数の連続摂動、またはハイスループットスクリーニングを可能にする、振動残るPSM様ゼブラフィッシュの細胞培養系を作製できることをssible。 我々は、タイムラプス撮影するための分散した細胞の初代培養物を調製するこの方法は、安定したゼブラフィッシュ細胞株を用いて親しみでない発達の時間枠内で起こる任意の細胞プロセスの研究のために適していることを期待する。切開によってまたはFACS経由のどちらか適切なトランスジェニックレポーター系統とは異なる発達段階の異なる細胞型の単離は、胚の解離後、出発細胞を提供することができます。細胞の胚起源によって案内培養条件、いくつかの最適化は、必要とされ得る。トランスジェニックゼブラフィッシュの急速に成長しているコレクションで、この柔軟で敏感なプロトコルを組み合わせることにより、行は、我々は古典的な遺伝的および発生学的方法と相補的であるin vitroの発生生物学のアプローチを容易にするために願っています。

脊椎動物の体軸や、体節形成に沿ってセグメントの定期的な形成は、発生中の胚における空間的および時間的な発振器の証拠である。体節形成を制御する有利なメカニズムは概念的になりました、細胞内サイクリックの遺伝子2のセットのリズミカルな表現によって駆動されると考えられ、セルラー発振器からなる「クロック」は、地層を切り刻み、ここで「時計と波面」モデル1で記述されている前体節中胚葉（PSM）からの体節の。胚が発展するにつれ、PSMでの成熟&quot;波面は「減速して、3を通過する際に、携帯発振器を停止させることは、後方に向かって回帰する組織と協調して動く。一緒に、この時空間的に動的なシステムは、セグメンテーション·クロックと呼ば​​れる。地元のカップリング番目に単一細胞内の遺伝子発振器からセグメンテーションクロックスパンの組織の3増加レベルを研究する現在のアプローチATは、集団のPSM組織4の位置情報の世界的な規制の最後に、細胞との間で発生します。 以前の研究は、ゼブラフィッシュにおける細胞自律セグメンテーション発振器は転写抑制5-7を介して負のフィードバックループを形成すると考えられているfactorfamily 彼女/ HESの転写の遺伝子およびタンパク質産物、から構成されて示唆している。デルタ/ Notchシグナル伝達経路は、隣接するセル間の振動を同期させ、人口8月10日の集合時間を調節する。尾芽で生産FGFシグナル伝達分子は、ゼブラフィッシュ、PSMを横断勾配を構築するために表示され、それによって前部11で発振した細胞を遅くし、逮捕に貢献することを仮定している。今までは、体節形成におけるこれらの分子のそれぞれの機能的役割は、遺伝的変異、モルホリノ注入、熱ショック過剰発現、および拮抗薬のトリートメントルーム、によって研究されてきたクロックコンポーネントとセル5,7,10,12との間のシグナリングのtment。これらの摂動を使用して、セグメンテーション時計機能は、組織レベルでの体節欠陥の説明とHER1、her7、デルタ Cのような周期的な遺伝子の発現の均一な振動の損失から推測されていますしかし、ほぼすべてのこれらのデータのは、固定された胚からのものであり、正確にセグメンテーションクロックの動的な機能に固有の変更を取得することができない。より最近では、多胚タイムラプスイメージングは、変更された発振器周期の最初の変異体を明らかにしたが、これらの観察はまた、組織レベル7,13で行った。このように、体節形成中の仮説を立てた細胞自律振動子の挙動が観察されていない。 本質的に、プロセスは、振動系によって駆動され、体節形成のための静的スナップショットは、不完全な画像を得た。マウスやニワトリの細胞での以前の仕事は、転写産物のレベルを示したとタンパク質盛衰が、約2時間の振動をサンプリングごとに30または45分は、必ずしも、収集されたデータと14,15を描画することができ、したがって結論を制限します。他の生物学的発振器の研究では、最も顕著なのは、概日時計は、リアルタイムの蛍光および生物発光レポーターを16,17を使用して監視することに離れて、遺伝子およびタンパク質発現の段階的測定から移動しました。これらのツールは、単一細胞18のクロック特性を実証するために不可欠です。 たHes1巡回遺伝子の生物発光レポーターを開発し、簡単にマウスのシングルPSM細胞19で特徴づけられている。平均周期と分散は振動がインビトロで数サイクルの間持続することを示す、少数の細胞について計算した。しかしながら、これらの研究は、定量的に、細胞が自然に出入り振動ことができるかどうか、発振器周波数および振幅の安定性および堅牢性に対処していなかったとどのように細胞がそれらの位相関係を維持する。さらに、細胞自律的なクロックで胚に見られるシグナル伝達分子の影響を直接テストされていません。その結果、単一細胞発振器のこれらの基本的な性質は、完全に未知のままである。 我々は最近、HER1式 30のヴィーナス（YFP）の蛍光レポーターを駆動するのBACコンビニアリング20を使用したトランスジェニックフィッシュ系統を開発した。このような行は、それらが埋め込 ​​まれた完全な染色体遺伝子座の規制手がかりを活用し、時間的ダイナミクスとHER1の空間パターンを再現。このブレークスルーは、 インビボで現像ゼブラフィッシュ胚における遺伝子発現のリアルタイムモニタリングを可能にする。細胞自律振動とどのような発現時間をかけて調節されているの基本的な特性を研究するために、我々は最近、in vitroでのPSM細胞から分離して記録するために信頼性の高い方法を開発した。このプロトタイプCOLは、我々は、単一の細胞内でのゼブラフィッシュセグメンテーションクロックの発振を特徴づけることができ、そこから分散した細胞培養を、生成するために、我々のトランスジェニックレポーターラインを利用している方法について説明します。私たちは、それによって、静的または組織レベルの解析ではアクセスできませんでした分野で顕著な問題に取り組むだけでなく、直接、シグナル伝達分子および阻害剤を用いた単一細胞レベルでのセグメンテーションクロックを操作することができます。

<table><tbody><tr><td>落射蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>モデル:SZX16</td><td></td></tr><tr><td>落射蛍光顕微鏡</td><td>X-cite 照明</td><td>シリーズ:120Q</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>モデル:SZX12</td><td></td></tr><tr><td>ファインフォーセプス No.55</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>ガラス転写ピペット</td><td>Assistent</td><td>567/2</td><td></td></tr><tr><td>35mmプラスチックペトリ皿</td><td>Greiner</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>60mmプラスチックペトリ皿</td><td>Greiner</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>Sylgardポリマー</td><td>SASCO</td><td>266727</td><td></td></tr><tr><td>マニピュレーションツール</td><td>自社</td><td></td>製 <td>マニピュレーションツールの説明について Ref.22</td></tr><tr><td>Microsurgical knife</td><td>World Precision Instruments</td><td>500249</td><td></td></tr><tr><td>L15medium</td><td>Invitrogen</td><td>57322</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトミオシン</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Invitrogen</td><td>257322</td><td></td></tr><tr><td>0.05% トリプシン / 0.02%</td><td>EDTA PAA</td><td>L11-004</td><td></td></tr><tr><td>ゲルローディングのヒント</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>253188</td><td></td></tr><tr><td>シグマコート</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>254589</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットセット</td><td>Gilson International</td><td>F167300</td><td></td></tr><tr><td>ゼブラフィッシュ フィブロネクチン1 70 kDフラグメント</td><td>MPI-CBGタンパク質施設</td><td></td><td>既発表の研究に基づくコンストラクトから自社生成 Ref. 23-25</td></tr><tr><td>ガラス底イメージングディッシュ</td><td>Mattek (シングルウェル)</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底イメージングディッシュ</td><td>Greiner (CellView -multi-well)</td><td>262502</td><td></td></tr><tr><td>メチレンブルーを含まないE3媒体</td> 自社<td>製</td><td></td><td>ゼブラフィッシュブック、第5版から Ref.26 </td></tr><tr><td>プラスチックトランスファーピペット</td><td>Ratiolab</td><td>260011</td><td></td></tr><tr><td>ワーナー加熱/冷却チャンバー</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>TC-324B/344B</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCDカメラ</td><td>Andor</td><td>モデル:iXOn 888</td><td></td></tr><tr><td>ヴィーナスフィルター付き広視野蛍光顕微鏡セット</td><td>ツァイス</td><td>モデル: Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Venusフィルターセット</td><td></td>付き広視野蛍光顕微鏡 <td>NeoFluor 40x, NA 0.75</td><td></td></tr><tr><td>Venusフィルターセット付き広視野蛍光顕微鏡</td><td>Lumencor Light Engine</td><td>モデル: Spectra X</td><td></td></tr><tr><td>Venusフィルターセット付き広視野蛍光顕微鏡</td><td>BrightLine HC 575/15</td><td>F39-575</td><td></td></tr></tbody></table>

シングル細胞におけるゼブラフィッシュセグメンテーション時計のイメージングのための分散前体節中胚葉細胞培養物の世代

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

セグメンテーションは、脊椎動物における周期とシーケンシャル形態形成のプロセスである。体軸に沿って体節と呼ばれる組織のブロックの形成は、このリズミカルな胚のパターニング遺伝発振器の証拠である。ゼブラフィッシュにおいて、細胞内のクロック駆動セグメンテーションは、負のフィードバックループに編成彼女/ hesの転写因子ファミリーのメンバーから構成されている。我々は最近、前体節中胚葉（PSM）における振動の時空間パターンを再現巡回遺伝子HER1のためのトランスジェニック蛍光レポーターラインを生成している。これらの行を使用して、我々は、単一の単離されたPSM細胞内セグメンテーションクロック発振のリアルタイム分析を可能にするインビトロ培養システムを開発した。トランスジェニック胚からPSMの組織を除去した後、ガラスボトムディッシュ上に領域を振動から細胞を分散させることによって、我々からの蛍光シグナルのタイムラプス撮影に適した培養物を生成し個々のクロック·セル。このアプローチは、その細胞自律的および組織レベルのプロパティを区別して解剖されることを可能に、これまでにない単一セルの分解能でセグメンテーションクロックを直接操作するための実験や概念的なフレームワークを提供します。

このプロトコルは、蛍光信号のタイムラプスイメージングのための実行可能な、分散された、単一のPSM細胞（ 図2）の文化を生成します。私たちの導入遺伝子は、そのサイクルの生産と分解の時間半程度の胚における内因性遺伝子とタンパク質に類似ダイナミクスで発生リポーターを生成します。 、その速い回転率を、単一細胞におけるYFP信号は漂白を最小限に抑えるために迅速に検出し、各振動サイクルの特徴を捉えるために高時間分解能でなければならない。また、信号の相対的な薄暗与えられ、文化や買収条件は慎重に敏感かつ堅牢な結果を確保するために調整されてきた。我々は、次の要因は、撮像のための最適PSM細胞培養物を生成する際に重要であることが見出された：ガラス底培養皿をコーティングするために使用される1 ECM基板。 2。解剖と画像形成媒体への血清の添加。 HETEの交配後に撮影した識別された胚からのPSMの3。解剖その子孫、潜在的に導入遺伝子の2コピーを運ぶrozygousペア。蛍光シグナルの効率的な捕捉を確実にするために、より高いNAの対物レンズを使用して最適な倍率範囲内に4。画像取得、。 5。背景雑音に寄与し得る強度変動を最小化するために、固体光源を有する照明。信号読み出しを最大にする高感度EM-CCDカメラで6。シグナル検出。 次善の培養は、記録を通して、丸いと健康を維持しない細胞が含まれています。当社は、当社のECM基板は、ゼブラフィッシュfibronectin1の断片は、ポリ-リジンまたはラミニンのような他の一般的に使用される基板と比較して、未分化のPSMのような状態で細胞を維持するという仮説を立てた。我々は試験した他の基質は、細胞がガラスや記録の過程で蛍光信号を発振する損失に平らにしていました。我々はまた、発見した解剖時の培地への血清の添加、分散、記録が解離するために使用トリプシンをクエンチしないことだけが重要であったが、またによる改善された細胞生存率への可能性の背景上での蛍光強度を増加させた。単一細胞からの最適な信号の捕捉を確実にするために、我々は、高NAと特異的に蛍光イメージング（ツァイスプランNeoFluorシリーズ）用に設計された40倍の対物レンズを使用。我々はまた、固体光源は、ノイズの多い画像​​に貢献するバックグラウンドの変動を最小限にすることが重要である伝統的な水銀灯よりもより安定した照明をしていることが分かりました。これらの修飾は、ロバストな結果を確保するために重要である。 このプロトコルを使用して、我々は与えられたフィールド内の細胞の大部分は、記録中のある時点での蛍光されている文化を期待しています。蛍光細胞は、一般的に丸みを帯びたままで、録音時に時々非常に運動性であることを、私たちを見つける。蛍光細胞を含むいくつかの細胞は、記録時にアポトーシスになることがある。これらの細胞は、任意のAから除外されているnalysis。また、他の細胞と接触する細胞を排除または視野の外に移動する。透過光チャネル内の健康な細胞の数をカウントすることによって測定されるように、平均して、我々は、10時間記録の終わりまで視野あたりの細胞数の12％減少を参照。この損失は、フィールドの外に移動した細胞死および細胞の両方を含む。これらの警告に与えられた我々は、平均して、通常はトラック5蛍光生存可能で、表示されたままのフィールドあたりの細胞、及び、条件ごとに6つのフィールドを記録することができます。たとえば、4の条件を用いた実験は、取得された合計24のフィールドと条件あたり典型的には約30追跡された細胞を持つことになります。 10％ウシ胎児血清を含むL15培地で、標準の撮像条件の下で、我々は、PSMの細胞（n = 4つの実験の反復から101セル）が3±1のピーク（2の平均と標準偏差を有する、2〜7のピークの間に生成することができることが判明-3サイクル）。中央値ピーク数、ならびに25％パーセンタイル、2つのピークと75％パーセンタイルiは3つのピークをね。我々の半自動追跡および分析を用いて、我々はすぐに図2Cに示される代表的な細胞トレースと、個々のPSM細胞のための時間トレースの上に蛍光強度を生成することができる。これらの生トレースは、その後、周波数、振幅、サイクル数、およびピークのタイミングと、発振​​PSM細胞の特性の定量的な測定を行うために使用することができる。 <img alt="図1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1.jpg" /> 〜5体節期にYFP蛍光を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ胚の図1。その解剖のトランスジェニック胚および回路図の同定。（A）の側面図。画像は、透過光と蛍光チャンネルのオーバーレイである。矢印はLの方に、PSMを通じて、尾芽の先端に開始信号の領域を示している<html> ASTは、体節が形成された。挿入図は、解剖時の最初のカットの前の胚の側面図（B）の模式図。30。その開発上やSoroldoni らを参照して、生体内挙動の詳細は、（レポーター導入遺伝子の模式図を示す。赤い点線最初のカットを示し、その前後軸に沿って配向卵黄顆粒及び表皮層を除去した後の平坦化されたPSM（C）の模式図で、。ただ尾芽胚の背後にある卵黄細胞ものの、後脳全体に作りました。赤い点線チップを削除するために第二のカットを示し、分散と文化のための尾芽の。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> 07fig2.jpg &quot;/&gt; 図2。分散PSM培養における単一細胞から代表的な画像やトレース。6時間タイムラプス撮影の単一のPSMセルの透過光画像の（A）のモンタージュ。セルは記録の経過を通じて丸みを帯びた、健康的なままであることに注意してください。（B）は 、単一のPSM細胞から蛍光画像のモンタージュ対応。セルの強度のピークは、記録の過程で番号が付けられています。このセル上に置かれたROIから測定時間をかけて、（C）平均強度。値は、フィジーで書かれた円補間プラグインとカスタムマクロを使用して、2分ごとに1つのフレームレートでムービーのすべてのフレームから取られる。強度のピークが再びトレース全体に番号が付けられています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

体節形成には、その空間的なパターン脊椎動物の胚の体軸リズミカルな発達過程である。以前、我々はこのプロセスを駆動する巡回遺伝子を観察する蛍光レポーターを使用したトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を開発しました。ここでは、in vitroでの時間をかけて、これらの線とイメージ、その振動からの培養分散した細胞。

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

本手順の全体的な目的は、ゼブラフィッシュの分節時計における単一の分離細胞を用い、環状遺伝子発現の蛍光レポーターの振動を長期的にイメージングするための分散培養細胞を調製することである。まず、トランスジェニックゼブラフィッシュ胚から前節中胚葉（PSM）組織を摘出する。次に、複数の胚からPSMの最も後方の部位である尾芽を摘出し、それらを合わせてトリプシン中で処理する。次に、ピペットを用いて尾芽の断片を手作業で分散させ、細胞懸濁液を作成します。最後に、この細胞懸濁液をフィブロネクチンでコーティングした培養皿に播種し、長期イメージングを行います。最終的に、蛍光タイムラプス顕微鏡観察により、単一のPSM細胞における強度の時間的な複数回の振動を示す結果を得ることができます。PSM組織における遺伝子発現のCISS（in situ ハイブリダイゼーション）などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、蛍光レポーターを用いることで、単一細胞レベルで分節時計の振動ダイナミクスをリアルタイムでモニタリングできる点にあります。この方法は分節時計に関する固有の情報を提供できるだけでなく、適切なトランスジェニック系統が利用可能であれば、器官形成や疾患モデルなど、単一細胞レベルの挙動に関する情報を得たい他のシステムにも応用可能です。解剖の前日に、トランスジェニックアレルをヘテロ接合体とするゼブラフィッシュのペアを交配させ、胚を回収します。受精後（HPF）約6時間の盾期に達するまで、メチレンブルーを含まないE3培地を用いて28℃で胚を育成させます。その後、胚をメチレンブルーを含まないE3培地に移し、20℃で一晩静置します。胚が尾芽期に達すると、1時間に1ソマイトの割合で形成されます。翌朝の解剖プロトコルの開始時点で、胚が5〜8ソマイト期にある必要があります。解剖器具を準備した後、ガラス底イメージングディッシュをフィブロネクチン1基質でコーティングします。蛍光ステレオ顕微鏡下で解剖を行っている間に、ディッシュをベンチ上に置いてコーティングさせます。前側中胚葉（presi mesoderm）またはPSMを確認し、トランスジェニック胚を特定します。YFP発現を確認してください。最後に出現した体節から尾芽にかけての領域に蛍光が認められるはずです。最も強いシグナルを示す胚を選択してください。透過光を位置基準として確認し、子孫の25%がトランスジェンの2コピーを持つホモ接合体胚である必要があります。自家蛍光を区別するため、陽性の胚をメチレンブルーを含まないE3 mediumが入った別のプラスチック製ペトリ皿に移します。解剖顕微鏡下で精密ピンセットを用いて解剖するための準備として、E3 medium中で各胚から卵膜を慎重に取り除きます。この際、胚を傷つけたり、卵細胞を破壊したりしないように注意してください。ピンセットまたはその他の平らな器具を使用して、cyl guardでコーティングした解剖皿に血清入りL 15培地を満たします。火炎滅菌したガラスピペットを用いて、S guardの表面から気泡を取り除きます。コーティングされた胚を解剖皿に移し、ワイヤーツールを使用して、すべての胚を片側に寄せます。次に、解剖皿の中のサードレイヤーで作製した小さなウェル内で、胚1個を側面に向けます。その後、マイクロスカルペルを使用して、後脳の直前で胚と卵黄細胞を切り、胚の腹極を通過するように切断します。胚の前方を切り出した断片をウェルから取り出し、皿の脇に移動させます。次に、ワイヤーツールを使用して、PSMを含む後部領域から残っている卵黄細胞顆粒を掻き出します。続いて、PSMを平らにし、前方端を外側に、後方端を前方に向けます。この時点で外胚葉の薄い層が剥がれていない場合は、ワイヤーツールを使用してPSM組織の上部から剥ぎ取り、マイクロスカルペルを用いて、脊索の末端または尾芽よりも後方のPSMの最先端部を組織の残りの部分から切り離します。尾芽の断片を、解剖領域から離れたディッシュの隅に移動させ、ワイヤーツールを使用して、解剖領域のプールからデブリや不要な胚組織を取り除きます。実験に必要な細胞数に応じて、複数の胚から尾芽の断片を採取します。平均して、1つの尾芽組織断片から1000個の細胞が得られます。空の35 mmプラスチック製ディッシュに少量のtrypsin EDTAを満たし、火炎滅菌したガラスピペットを用いて、尾芽の断片をディッシュに転移させます。室温で20分間インキュベートし、組織をtrypsinで処理している間に、ガラスボトムイメージングディッシュ内のフィブロネクチン溶液にmilli Q水を加えます。溶液を除去し、Milli Q水でガラス面を3回洗浄します。吸引して各洗浄液を除去し、ディッシュを完全に乾燥させてください。尾芽の断片をイメージングするには、血清含有L 15を100 µL、イメージングディッシュにピペットで分注します。コーティング済みのゲルチップを用いて、尾芽の断片を、可能な限り少量のtrypsin EDTAでイメージングディッシュに移します。断片をピペッティングし、細胞をバラバラにして培地中に懸濁させます。この際、気泡が入らないように注意してください。細胞をフィブロネクチン1でコーティングしたガラス上に20分間、室温で静置させます。インキュベーション後、血清を含むL 15培地を少量、細胞に加えます。その後、イメージングを開始します。沈殿した細胞を乱さないよう注意してください。細胞をイメージングするために、まずディッシュをタイムラプス顕微鏡の温度チャンバー内に設置します。希望の温度を設定し、画像取得を開始する前に、ディッシュを少なくとも30分間平衡化させます。周期を正確に測定するには、安定した温度が不可欠です。単一のPSM細胞において、露光を確認するためのテスト蛍光画像を取得します。時間とゲイン。飽和することなく、強度の広いダイナミックレンジを確保し、良好なSN比を保証します。当研究室の細胞株から調製した分散細胞から得られた、代表的な蛍光画像です。このプロトコルの使用において、EMゲイン85で動作するE-M-C-C-Dカメラを用いた透過光画像の撮影には、400ミリ秒および40ミリ秒を要します。さらに、透過光チャンネルを用いてS/N比を最大化するためには、カメラのプリアンプゲインと読み出し速度の設定も不可欠です。タイムラプス撮影を行う細胞領域を選択してください。光退色や細胞への毒性の誘発を防ぎつつ時間的な動態を捉えるため、例えば2分間隔などの間隔で、1視野につき透過光画像1枚と蛍光画像1枚を取得するタイムラプス撮影プロトコルを実行します。タイムラプス動画を処理するには、ファイルを開き、透過光フレームと蛍光フレームを分割して2つの画像スタックを作成します。透過光チャンネルで単一細胞を追跡するには、記録終了時まで生存していた細胞の周囲に、円形の関心領域（ROI）を指定します。その際、視野外に移動せず、かつ他の細胞と接触しない細胞を選択してください。数フレームごとにROIをROIマネージャーに保存し、最終フレームまで細胞を追跡します。蛍光スタックを選択し、保存したROIを用いて、カスタムサークルINTERPOLATORプラグインとマクロを使用して、追跡した細胞の強度を時間経過とともに測定します。マクロによる出力トレースを確認し、蛍光タイムラプスの特徴を定性的に捉えているかチェックしてください。値をExcelワークシートにエクスポートします。細胞のROIリストを保存してください。ここでは、10時間のタイムラプス記録における単一のPSM細胞の代表的な画像を示しています。ここで使用した導入遺伝子は、10%胎児牛血清を含むL 15培地を用いた標準的なイメージング条件下において、胚内の内在性遺伝子産生タンパク質と同様のダイナミクスおよび発現レベルで産生と分解のサイクルが行われるリポーターを生成します。PSM細胞は2つから7つのピークを生成することがあり、平均および標準偏差は3 ± 1ピークであることが分かりました。ピーク数の中央値および第25パーセンタイルは2ピークであり、第75パーセンタイルは3ピークでした。半自動のトラッキングおよび解析を用いることで、個々のPSM細胞の蛍光強度の経時的変化を迅速に生成できます。これらの生データから得られたトレースを用いて、周波数、振幅、サイクル数、ピークのタイミングなど、振動するPSM細胞の特性を定量的に測定できます。この手順に続き、シグナル分子や阻害剤の添加などの他の手法を行うことで、単一細胞のオシレーターが胚外に存在する因子にどのように反応するかという問いに答えることができます。この手法により、体節形成の研究者が、細胞間相互作用や組織レベルの因子といった、完全な胚内では解析を非常に困難にする複雑さから細胞を切り離し、単純な方法でセグメンテーションクロックの単一細胞挙動を研究できることを期待しています。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、我々は共焦点顕微鏡による単一細胞の解像度でのライブゼブラフィッシュの胚で開発脊椎動物の脳を分析するためにする方法を示しています。これは、我々は、単一セルのゼブラフィッシュの胚を注入し、その後、脳の発達をマウントし、イメージする方法が含まれています。...

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

初期胚を形成する形態形成のプロセスを理解するための鍵は、高解像度での画像セルにできることです。ここでは、細胞膜をターゲットとする緑色蛍光タンパク質で全体のゼブラフィッシュの胚では細胞の単一細胞または小さなクラスターを標識するためのテクニックを説明します。...

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現在のビデオは、開発ゼブラフィッシュの脳内の個々の神経前駆細胞のライブイメージングを実行するためのエレクトロポレーション、共焦点顕微鏡の組み合わせを活用する方法を示しています。...

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このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚から単一細胞を分離する方法、目的の細胞を濃縮する方法、マイクロ流体ベースの単一細胞マルチプレックスシステムでゼブラフィッシュ細胞を捕捉する方法、および単一細胞からの遺伝子発現を評価する方法を説明しています。...

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ここでは、正常な発達を乱すことなく、生きたゼブラフィッシュの胚の後部体の発達を長期間のタイムラプスイメージングを可能にする汎用性の高いマウント方法を紹介します。...

ゼブラフィッシュの開発の長期イメージングのための多彩な取り付け方法

長い波長多光子蛍光励起顕微鏡レーザーの高度な光学技術の組み合わせは、Tg (sox10:EGFP) および Tg (foxd3:GFP)...

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インビボイメージングは、神経系の発達の根底にある細胞メカニズムを調査するために使用できる強力なツールです。ここでは、開発中のゼブラフィッシュ神経系の中で、多色Brainbow標識細胞をリアルタイムに可視化するために、タイムラプス共焦点顕微鏡を用いる手法について説明する。...

Brainbowとタイムラプス共焦点イメージングを用いた生きているゼブラフィッシュの発達脳の可視化

ここでは、ゼブラフィッシュ後部体軸の3次元組織培養に関するプロトコルを提示し、脊椎動物のセグメンテーションの実生研究を可能にする。この外植モデルは、軸伸長、モルフォゲン源の変化、および細胞内分解能組織レベルのライブイメージングを制御します。...

ゼブラフィッシュにおける脊椎動物のセグメンテーションを研究する3D尾翼植物培養

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ早期眼の開発におけるトトラベリングおよび多次元イメージングのアプローチを記述する。レーザー走査共焦点顕微鏡によるラベリング、埋め込み、4次元(4D)イメージング、および光学カップ形態形成の解剖機構のためのデータセットの取得を最適化するための考慮事項について述べる。...

ゼブラフィッシュオプティクスカップ形態形成の4次元イメージング

ライトシート顕微鏡を使用して、無傷の絨毛膜内の初期のゼブラフィッシュ胚をイメージングするためのサンプル調製戦略について説明します。これは、70%エピボリーおよび芽の段階で胚が絨毛膜内で獲得するさまざまな向きを分析し、ライトシートシステムを使用して胚全体で細胞スケールの分解能を得るためのイメージング戦略を詳しく説明します。...

初期ゼブラフィッシュ胚のライトシート顕微鏡イメージングとマウント戦略

学ぶ ゼブラフィッシュの前体節中胚葉細胞を分散培養し、蛍光レポーターを用いて単一細胞レベルでサイクリック遺伝子発現の振動を長時間イメージングする方法。セグメンテーション時計の動態をリアルタイムで観察し、発生生物学の研究に応用できる。

シングル細胞におけるゼブラフィッシュセグメンテーション時計のイメージングのための分散前体節中胚葉細胞培養物の世代

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