Name: 外傷性脳損傷後の神経細胞や遺伝子発現解析のための単一ニューロンの濃縮された集団のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: 学ぶレーザーキャプチャーマイクロダイセクションによる外傷性脳損傷後のラット海馬ニューロンの単離法。凍結切片から神経細胞を精密に採取し、遺伝子発現解析を行う技術を解説します。

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この作品はR01 NS052532（HLHに）、ムーディーズ·財団、麻酔科によって運営されている。我々は、ローリー、太字、彼らの編集支援のためのクリスティンCourteauバトラーとクリスティペリー、レイアウト、すべての図、表、アートワークの優れた生産のためのクリスティーペリーに感謝します。

1。外科的処置とTBI流体パーカッション<ol><li>全ての動物実験は、まず動物実験（第8版、全米研究評議会）のお手入れと使用のためのテキサスメディカルブランチ、ガルベストン、テキサス州と健康ガイドの国立研究所の大学の施設内動物のケアと使用委員会によって承認されています。 </li><li>ラット（ベンダーチャールズ川から得られた成体雄Sprague-Dawleyラットに、400〜500グラム、ポートランド、メイン州）がケージあたり2を収容し、これらの一定の条件をビバリウム内に食品や水を自由に提供されています：1800への光サイクル（600時間使用する時間）、温度（21℃〜23℃）、湿度（40％〜50％）の1週間前。 </li><li> 4％、イソフルラン挿管、機械的換気でラットを麻酔（NEMI科学、ニューイングランドの医療機器、メドウェイ、マサチューセッツ州）は、酸素でイソフルラン1.5から2.0パーセントを有するラット：空気（70:30）と流体パーカッション矢のためにそれらを準備前述のように負傷。8、10 </li><li>実験デザインに応じて損傷後の適切な時点でラットを生け贄に捧げる。迅速に、脳を除去し、直ちにドライアイスで凍結し、-80℃で保存50mlチューブ内のCまたは凍結切片のため10月に埋め込む直ちに進みます。 </li></ol> 2。セクショニングとラット脳の染色<ol><li>一定の温度に保たれた場合は、直ちに使用されていない脳組織は、1月までのために-80℃に保つことができる。 -80℃で凍結されている脳は、その後°その後切片は、-20°Cに解凍し、C、および再凍結融解後の第二品質のRNAが得られない。脳は、解凍された10月に搭載され、区分されたされた後、スライドは24時間以内に染色し、染色の1時間〜30分以内にLCMを使用する必要があります。これは、良い品質のRNAを確実にするでしょう。 LCM後、LCMのキャップに捕捉された細胞は、最大一週間、-80℃での溶解バッファーに格納することができますが、RNAは、最高の品質を確保するために、適時に隔離されるべきである。&lt;は/ LI&gt; <li>前に脳を区画には、RNase-ZAPとクライオスタットを拭くとEtOH（それぞれの脳の間に使い捨ての刃を交換して）でブラシを清掃してください。 </li><li> -80℃の冷凍庫から50 mlチューブで脳を取り出し、-22℃で約10分間、チューブ内の雪解けの温度でクライオスタット内に配置します。ガーゼでステージ上にチューブと場所、アップ腹側から脳を取り出します。 </li><li>カミソリの刃を用いて、小脳と視交叉における前方部分にちょうど吻側脳の後方部分を削除するために脳をスライス。 10月取付媒体（ティッシュテック）とcryomoldをご記入のうえ、前方側に金型に脳を下に置きます。それが白に変わったら（約10分）まで、脳組織がマウント培地で凍結することができます。 </li><li> 10月と脳に試料ディスク（ティッシュテック）を凍結します。金型から脳を取り出します。試料ヘッドに脳を挿入して、ネジを締めます。 </li><li> disposaを挿入BLE、ロープロファイルナイフホルダーにブレード（フィッシャーサイエンティフィック）とレバーを締めます。 </li><li> 10月の外側の層を除去するために、20μm以下で脳をスライスし始める。海馬領域に達すると、10ミクロンにダイヤルを設定してください。組織切片（フィッシャー·サイエンティフィック）の上にガラススライドまたはプラススラ​​イドガラスを配置することにより、冠状連続切片を収集します。セクショニングが完了するまで、スライドはRNaseフリーの染色ラックに-20℃で保存されている。 </li><li>組織切片が処理されるガラス製品からすべてのRNaseを除去するには、すべての染色コンテナを拭うとエリミナーゼ（フィッシャーサイエンティフィック）とシリンダーを卒業し、ミリQ水ですすいでください。 RNaseフリー水ですべてのソリューションを用意し、クレシルバイオレット（Sigma-Aldrich社）とフルオロジェイド（ヒスト-CHEM）を使用する前に0.2μmのフィルターで染色をフィルタリングします。 </li><li> 30秒RTで脳切片を解凍し、75％エタノール（1分）で固定します。 </li><li>定着後のシングル負傷したニューロンのLCMは、RNaseフリーの水（1分）で、スライドをすすぎ、1％クレシルバイオレット（15-20秒）で対比染色、RNaseフリー水（2×30秒）ですすぎ、フルオロジェイド（4分）で染色し、RNaseフリー水（3×1分）ですすぎRNaseフリー水（30秒）、100％EtOHを（30秒）、キシレン（2×3分）から作られた95％エタノールで脱水する。 </li><li>定着後のニューロンのスワスのLCMは、RNaseフリー水（1分）で、スライドをすすぎ、1％クレシルバイオレット（1分）で染色し、（3×1分）のためにRNaseフリー水ですすぎ、95％の脱水をEtOH（2×30秒）、100％EtOHを（2×30秒）、キシレン（2×3分）。 </li><li>空気は、LCMに先立って15分間換気フード内のすべてのセクションを乾燥させてください。彼らは部屋から部屋へと転送することが必要な場合は、スライドセクション側は、乾燥剤が並んでスライドボックスには、最大保存することができます。のセクションでは、乾燥している後に、LCMがすぐに実行された場合は、最適な結果が得られる。 LCMは、30分〜1時間に制限すべきである。次のセクションでは、EAである細胞の連続帯状の領域をキャプチャする方法について説明します第一このテクニックを学んでいる人のためにマスターするsiest。その後、我々は正確に単一ニューロンをキャプチャする方法について説明します。私たちの手順では、変性ニューロンのフルオロジェイド·マーカーに対するその親和性によって瀕死のニューロンを特定します。フルオロジェイド陰性細胞は、ニューロンを存続されるものとみなされます。 </li></ol> 3。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM） 海馬神経細胞の濃縮された集団のスワスのLCM <ol><li> LCMは、赤外ダイオードレーザー（Life Technologies社）でPixCell IIE顕微鏡を使用して実行されます。 </li><li>垂直位置に中央のジョイスティックを調整します。回転させ、所定の位置に4X目標をロックします。 </li><li>海馬の領域が表示されているまで、顕微鏡ステージの中心にスライドを入れて、手動で調整してください。焦点にイメージを持って来るために粗調整と微フォーカス調整を使用しています。 </li><li>コントローラ上の真空ボタンを押すことによって、真空チャックをアクティブにします。 PLに10X対物レンズを回転させ、ロックエース。粗調整と微調整を再び焦点を当てる。 </li><li>負荷線の位置にキャップがポイカセットモジュールと位置にポイカプセルマクロLCMキャップ（Life Technologies）をロードします。キャップの周りにキャップの配置アームと位置を回転させます。カセットモジュールからポイカプセルのキャップを除去するためにキャップの配置アームを持ち上げます。 </li><li>スライド上にキャップの配置アームを回転させて、スライド上に腕を下げる、これはスライド上にキャップを置きます。ファインフォーカスを調整し、細胞がキャップに黒の円の内側にあるかどうかを確認するジョイスティックを動かします。すべてのセルのキャプチャはこの黒丸内にある必要があります。 </li><li>レーザパラメータを設定します。まず、コントローラ上のレーザー有効ボタンを押してください。レーザーターゲットスポットはコンピュータのモニター上視野内のピンクのドットのように見えるようになります。 </li><li> 75 mWで、1.0から2.0ミリ秒のための最適な細胞捕獲の必要に応じて - レーザーの焦点を合わせると65〜パワーと持続時間を調整するために小さなレーザスポットサイズ（7.5μm）を設定します。 </li><li> TEにレーザーST、ピックアップする細胞が存在しない領域にレーザスポットを移動するためにジョイスティックを使用しています。親指スイッチを使用してレーザーを発射。目に見えるダークリングは、レーザーが発射された明確な領域を囲むかどうかを確認するために離れて溶融ポリマースポットからレーザスポットを移動し、チェックするためにジョイスティックを使用しています。 </li><li>細胞を捕捉するには、キャプチャするために、細胞の領域の上にレーザスポットを移動するためにジョイスティックを使用しています。親指スイッチを使用してレーザーを発射。細胞の大きな領域をキャプチャするためにレーザーを発射しながらジョイスティックを動かします。レーザーが発射されるとき、それは標的細胞の表面にキャップに熱可塑性ポリマーフィルムを溶融する。ポリマーは、このように将来の分子アプリケーションのためのサンプルの整合性を確保したRNA、DNAやタンパク質を変更しない、レーザー放射を吸収する。 </li><li>興味のあるすべてのセルを焼成した後、キャップの配置アームを持ち上げる。捕捉された細胞は、組織切片から分離してポイカプセルのキャップに付着する。残りの組織および欠損セルが可視になります視野内ible。キャップ上の細胞はまた、スライドの空の部分にキャップを配置することにより閲覧することができます。 </li><li>キャップの配置アームを持ち上げ、キャップStationをアンロードするためにそれを回転させます。駅にキャップを下げて元の位置に戻してキャップの配置アームを回転させます。 </li><li>プラットフォームに沿って、キャップの上にポイカプセル挿入工具をスライドさせます。プラットフォームからツールを持ち上げます。キャップが取り付けられたままになります。軽く不要な組織を離れてきれいにポイカプセルクリーンパッドにキャップを触れないでください。 </li><li> RNAqueousマイクロアイソレーションキットから得られた溶解バッファー100μlで満たさ0.5ミリリットルRNaseフリーのチューブにキャップを置きます。細胞を溶解するために30秒間ボルテックス直ちにキャップ。 42℃でインキュベートする-80℃で30分間、そして凍結用のC°CのRNA分離まで。 </li></ol>海馬における単一FJ +ニューロンのLCM <ol start="15"><li>単一細胞を捕捉するには、ポイカセットモジュールとpositiにポイカプセルHS LCMキャップを読み込む負荷線の位置でキャップに。キャップの配置アームを回転させ、キャップの周りに配置します。カセットモジュールからポイカプセルのキャップを除去するためにキャップの配置アームを持ち上げます。 </li><li>レーザーの焦点を合わせると、単一細胞の最適な細胞捕獲用の0.45から0.50ミリ秒のために65 -75 mWまでレーザパワーと持続時間を調整するために小さなレーザスポットサイズ（7.5μm）を設定します。 </li><li>スライド上にキャップの配置アームを回転させて、スライドに向かって腕を下げる。これは、スライド上にキャップを置きます。ポイカプセルのHSキャップ面は、LCM中のサンプルから高架に座っている。 </li><li>シングルFJ +細胞にレーザを移動するジョイスティックを使用しています。キャプチャされてすべての細胞は、キャップに小さな黒いリングの内側になければなりません。親指スイッチを使用してレーザーを発射。 </li><li>黒丸区域内のすべての細胞がレーザーを発射されたとき、キャップの配置アームを持ち上げる。捕捉された細胞は、組織切片から分離してポイカプセルHSキャップに付着する。 </li><li>マイクロ上の別のスライドを入れステージに対応したHSキャップがいっぱいになるまでのFJ +細胞を収集します。溶解バッファーの40〜50μlで埋め0.5ミリリットルRNaseフリーのチューブにキャップを置きます。細胞を溶解するために30秒間ボルテックス直ちにキャップ。 42℃でインキュベートする-80℃で30分間、そして凍結用のC°CのRNA分離まで。 </li></ol> 4。 LCMサンプルからトータルRNAの分離（このセクションは、単にビデオのプレゼンテーションで説明されます） <ol><li>細胞からの全RNAを、製造業者のプロトコールに従ってRNAqueous-Micro社キット（Ambion）を用いて単離される。全ての試薬および洗浄溶液は、このキットで提供されています。フィルタに溶解液バッファー30μlを添加することにより、プリウェットミクロフィルターカートリッジアセンブリ。 5分後、10,000×gで30秒間遠心フィルターを。 </li><li>サンプル溶解液にLCM添加剤の3μlを加え、ピペットで混合し、遠心分離する。 </li><li>サンプル溶解液に100％EtOHを（1/2量）52μlを加え、ピペットで混合し、フィルターにライセートを転送するコラム。 </li><li>カラムにRNAに結合するには、1分間10,000×gでフィルターカラムを遠心します。 1サンプルに対して複数のキャップがある場合は、別々に同じカラムを通して各ライセートをスピン。 </li><li> RNAqueousマイクロキットに記載されているようRNA分離手順を完了します。 </li><li>キットに記載されているようLCM RNAサンプルのDNase処理およびDNase不活化を実行し、-80℃でRNaseフリーのチューブや店舗にRNAを転送℃に</li></ol> 5。 RNA定量と下流のアプリケーション RNAの品質と定量化の評価は、製造業者のプロトコルに従ってピコ·キット（Agilent Technologies社、サンタクララ、カリフォルニア州）からの試薬を使用してAgilentバイオアナライザを用いて行われる。 <ol><li>全RNAをAgilentバイオアナライザー2100（アジレント·テクノロジー）で分析されています。ソフトウェアは、各サンプルの範囲のfにRNAの完全数（RIN）を割り当てることによって、濃度およびRNAサンプルの完全性を評価するromは1から10まで。 1-5は、分解されたRNAを示し、7月10日は、良い品質のRNAを示しています。 </li><li> SYBR-グリーンケミストリーを使用して、個々のTaqmanアッセイまたはRT2プロファイラアレイ、劣化していない無傷のRNAは、リアルタイムPCRに使用されます。 RNAは、mRNAのマイクロアレイ解析とmicroRNAのマイクロアレイ解析に使用することができます。 </li></ol>

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著者らは、利害の対立がないことを宣言します。

このLCM手法は、TBIの分子機構を理解する上で重要な進歩を遂げることができるようになりました。8,10,11,12,13我々は、ラット海馬の異なるサブ領域は、その遺伝子発現プロファイルを持っていることを実証するために、この技術を利用した最初の研究者であったけがへの選択的脆弱性と相関する。我々の研究は、我々は、わずか10などのレーザー捕捉された細胞から、定量PCRによって、遺伝子発現を定量化し、我々は600捕獲された細胞としていくつかのゲノムワイドマイクロアレイ解析を行うことができることができることを示した。 LCMは、多様な神経学的および神経疾患に関与することが知られている他の脳領域の類似の研究の貴重なツールとなります。たとえば、LCMを用いた研究では、黒質のドーパミンニューロンにおけるパーキンソン病の病因、14とsに関与報酬回路に関与している側坐核の支援ゲノムワイドプロファイリング研究、に光を当てるたubstance乱用障害15 ニューロンの異質性はゲノムレベル16で反射され、臨床試験ではTBIのための実験的な治療の成功の不足に貢献するかもしれない。したがって、我々の目標は、TBIの後ニューロンの生存に影響を与える重要な要素を調査するために、この手法を利用することである。死にかけていると隣接TBIの後に海馬ニューロンの生存我々の最近のゲノムワイドプロファイリング研究は、細胞死遺伝子と細胞生存の発現レベルの比を反映して、携帯レオスタットはTBI後の細胞運命を調節することが示唆された。これらの継続的な研究が積極的に細胞生存加減抵抗器に影響を与えることができる薬物療法戦略の設計と開発に貢献していきます。さらに、我々は現在、TBI後の海馬神経細胞の潜在的な治療の薬物治療の効果を追跡し、監視するために、LCM使用。したがって、我々の研究は慎重にRNaseフリー処理テクニックを与えられたことを示しているといくつかの既存のプロトコルの変更は、それが正確な定量的遺伝子発現解析のためのLCMから高品質のRNAサンプルを得ることが可能である。 しかし、LCM技術に関連するいくつかの落とし穴があります。たとえば、任意のミクログリア汚染なしのみ神経細胞を収集することはほとんど不可能になる場合があります。海馬の錐体細胞層では、細胞の95％はグリアおよび他の細胞型の小さな割合を残して、錐体細胞と10％のニューロンであるために、この人口の90％を持つニューロン。8,17であることが推定されている私たちの研究では18我々 はフルオロヒスイ特に脳組織内だけ傷ついた神経細胞を標識する蛍光色素を使用しています。 GFAPのマーカーであることが異なる汚れは、ミクログリアを染色することが必要であろう。のみフルオロヒスイステンド単一ニューロンの遺体を収集19は、ニューロンのより均一な集団を確実にします。トラブルシューティングが必要な場合があり、別の一般的な問題は、サークルがないということですレーザーが発射されたときtが定義されている。この問題が発生した場合、それはレーザーの設定を確認し、必要に応じてパワーと持続時間を調整することが必要である。また、キャップが組織の上に平らに置き、アームに正しく装着されていることを確認することが重要です。 LCMのテクニカルマニュアルを参照するか、テクニカルサポートを呼び出すことは、時には必要であろう。 LCMおよびRNAを単離した後、RNAの品質は、常に任意の遺伝子発現解析に先立ってバイオアナライザを用いて評価されるべきである。 レーザー切断（Life Technologies社、ライカマイクロシステムズ）と（ツァイス）の楽器を突入させたレーザーを含む現在市場に出回っているレーザーキャプチャー機器のいくつかの種類があります。私たちのLCMシステムは少数細胞を捕捉するために適しています。他の高スループット、より自動化されたシステムは、ゲノム、特にプロテオーム解析のための細胞の大きい数値を得るために、より適している場合があります。実際、これらの自動化システムを使用してLCMはprの分析のための大きな可能性を秘めている同定された細胞または細胞の濃縮された集団でotein式20は、さらに、LCMは、私たちは関係なく、最も異質の組織における複雑性の定義された種類の細胞における遺伝子発現を調査することができる21の免疫標識細胞の遺伝子発現解析を容易にすることができる。したがって、LCMは細胞の単一または濃縮された集団の最先端の分子生物学的研究のための優れたツールです。

異種組織の遺伝子発現解析は、常に問題となっているが、これは約5,000の異なる細胞型を有する哺乳動物の脳では特にそうです先立ちレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）技術の開発〜4は 、TBIの効果のゲノム研究。 in vivoでの異なる神経細胞の種類だけでなく、グリア細胞および免疫細胞をサポートするだけでなく、構成の脳細胞の混合集団における遺伝子発現の解析に基づいていた。これらの異種の組織から得られた結果の複雑な遺伝子発現プロファイル、および損傷によって誘発された細胞シグナルの相反するパターンは、TBIの前臨床試験で有効性が証明さ治療戦略のヒト臨床試験での失敗の1つの説明かもしれません。5 ラット腰から神経細胞の脆弱な集団に傷害誘導性遺伝子発現の明確な理解を得るためにpocampus、我々は最初のエメルト-昇らによって報告されたLCMの手法は、図3続いて、我々は、定量的リアルタイムPCRやマイクロアレイ解析を用いたニューロンとmRNAプロファイリングのための単一ニューロンの濃縮された集団の効率的な捕捉のために、この顕微解剖法を変更し、最適化を採用。ゲノム解析のための脳組織の凍結切片でのmRNAの整合性を維持するために、我々は固定、染色、冷凍ラットの脳切片からニューロンの急速な捕獲のための既存のプロトコルを変更しました。負傷して死にかけている海馬ニューロンの同定および単離のために、我々はまた、LCM用フルオロジェイド染色技術を最適化しました。フルオロジェイドはアポトーシスとネクローシス細胞死を区別しません。したがって、変性ニューロンのすべての種類は、この汚れ。6,7によって検出することができここでは、単一の瀕死または生き残った神経細胞のプールだけでなく、濃縮populatiの帯状の領域を取得するために、我々の研究室で使用されるプロトコルを記述する異なる神経細胞の種類（TBI後の遺伝子発現解析のためのすなわち CA1-CA3ニューロン）のアドオン。当研究室で行っている流体パーカッション脳損傷のための手順は、島村ら 、8で詳細に説明し、アルダーら JOVEに公表したマウスの横方向の流体-パーカッション傷害プロトコルに非常に似ています。9 LCM技術は持っているので組織中のDNA、RNAおよびタンパク質のインテグリティに最小限、あるいはまったく影響を有することが示され、これは、定義された種類の細胞の分子とタンパク質解析のための優れたツールです。

<table><tbody><tr><td>PixCell IIe レーザーキャプチャー 顕微鏡</td><td>Life Technologies (Arcturus)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous Micro- Kit</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Capsure LCM caps</td><td>Applied Biosystems</td><td>LCM0211/LCM0214</td><td></td></tr><tr><td>フルオロジェイド</td><td>ヒストケム株式会社</td><td></td><td></td>#1FJ</tr><tr><td>クレシルバイオレットアセテート</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>キシレン (組織学的グレード)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 200 プルーフ (組織学的グレード)</td><td>UTMB 薬局</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase フリー バリアピペットのヒント</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>2123635, 212364, 212361, 21-236-2A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/brochures/cms_086283.pdf" target="_blank">Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies)</a> <a href="http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/brochure-downloads.html?catalog=laser_microdissection" target="_blank">Zeiss Laser Microdissection The PALM family </a> <a href="http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20DM6000%20B/Brochures/Leica_DM4000-6000_B-Brochure_en.pdf" target="_blank">ライカマイクロシステムズ</a></td></tr></tbody></table>

外傷性脳損傷後の神経細胞や遺伝子発現解析のための単一ニューロンの濃縮された集団のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

TBI後の長期的な認知障害は、学習、記憶と執行機能のために重要である内側側頭葉の海馬領域における傷害誘導性の神経変性に関連付けられています。1,2したがって、我々の研究は、特定の神経細胞の遺伝子発現解析に焦点を当てる海馬の異なるサブ領域における集団。エメルト-バック、 らによって1996年に導入されたレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）の技術、。、3は、単一細胞などが含まれ哺乳類の脳のような不均一な組織からの細胞の濃縮された集団の遺伝子発現解析で大きな進歩を可能にした機能的な細胞型の何千もの。4私たちは、TBIの病因の根底分子メカニズムを調べるためにLCMおよび外傷性脳損傷の十分に確立されたラットモデルを（TBI）を使用します。流体パーカッションTBIの後、脳を、直ちにドライアイスで凍結し、予め決められた時間、損傷後に削除されますとクライオスタットで切片化のために準備した。ラットの脳はすぐに10月、切片に埋め込まれた、または-80℃で数ヶ月保存することができ℃のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション用セクショニング前。さらに、当社は、概日リズムに、TBIの効果を研究するため、LCMを使用しています。このため、我々は哺乳類の脳のマスタークロックを含む視交叉上核からニューロンをキャプチャします。ここでは、リアルタイムPCRによって、および/シングル同定ニューロン（負傷し、変性、フルオロジェイド陽性、または無傷、フルオロジェイド陰性）とその後の遺伝子発現解析のための海馬神経細胞の濃縮された集団を得るためのLCMの使用を実証または全ゲノムマイクロアレイ。これらのLCMの対応の研究はラット海馬の解剖学的に別個の領域の選択的脆弱性は、これらの異なる領域からLCMによって得られたニューロンの異なる集団の異なった遺伝子発現プロファイルに反映されていることを明らかにした。私達の単一セルの研究からの結果、どこに私たちは死にかけていると隣接存続海馬ニューロンの転写プロファイルを比較し、TBI後の細胞死と生存を調節する細胞生存レオスタットの存在を示唆している。

私たちの最初の研究のLCMにおいて、我々はラット海馬の機能的に異なるサブ領域（CA1およびCA3）がTBIに対する脆弱性を反映した遺伝子発現プロファイルを持っていることを示すことができた。8 図1A〜1Cは、海馬錐体細胞のレーザーキャプチャー（CA1を示していますCA3）、前、およびLCM後の歯状回ニューロンとSCNニューロン。ピラミッド形のきれいなキャプチャ、顆粒またはSCNのニューロンは、それぞれが、マクロ·キャップに示されています。 図2A-2Bは、LCMの前と後死んで、フルオロジェイド正錐体ニューロンと存続、フルオロジェイド負の錐体細胞を示しています。瀕死または生き残ったニューロンのクリーンキャプチャはLCMのキャップに捕捉された細胞を表示することによって示されている。 LCMの後、全RNAをTaqManまたはSYBRグリーン化学（ 図3A）、小さなfocuを用いた遺伝子発現の定量的リアルタイムPCR解析を含む分子研究の多様な配列を使用することができますSYBRグリーンプローブ（ 図3B）、または全ゲノムマイクロアレイ研究（ 図3C）を用いてPCRアレイをセッド。 <img alt="図1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1.jpg" /> 図1。ラット脳から定義されている細胞集団のスワスのレーザーキャプチャーマイクロダイセクション。ラット脳の冷凍10μmの冠状切片をエタノールで固定ニッスル染色（クレシルバイオレット）で染色し、LCMのために準備されます。示され、ラットの海馬と視交叉上核の絵海馬歯状回におけるラット海馬のCA1-CA3サブフィールドからLCMおよびマクロキャップ上で可視化として捕捉された細胞。A.錐体ニューロンの前と後にBの顆粒細胞である。第三脳室の両側に位置する二国間で視交叉上核と視神経十字の上方に位置する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2.jpg" /> 図2。ラット海馬からの単一ニューロンのレーザーキャプチャーマイクロダイセクション。示さCA3ニューロンLCMの前と後のAの退化、フルオロジェイド陽性（染色）海馬CA3ニューロンA と Bの存続、フルオロジェイド陰性（非染色）されています。捕捉された細胞は、可視化されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するにはここをクリック</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" src=&quot;/ files/ftp_upload/50308/50308fig3.jpg&quot; /&gt; 図3。レーザー捕捉ニューロンから単離した全RNAの遺伝子発現解析。SCNにおける概日時計遺伝子発現のAの定量的リアルタイムPCRのデータが。焦点のPCRアレイを用いてアポトーシス関連遺伝子の発現を示す海馬神経細胞を死に、生存における遺伝子発現のB.ヒートマップ℃、アジレントのTBIまたはTBI偽傷害を受けたラットに加え、脳損傷（神経型一酸化窒素によって誘導される遺伝子のノックダウン式に設計された組換えアデノ随伴siRNAのウイルスから海馬CA1-CA3ニューロンにおける遺伝子発現の全ゲノムマイクロアレイ解析酵素とグルタチオンペルオキシダーゼ-1）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するにはここをクリック</a> 。

我々は、海馬ニューロンまたは定量的リアルタイムPCRおよび/または全ゲノムマイクロアレイを用いてその後の遺伝子発現解析のために負傷したラット脳の凍結切片からの単一ニューロンの濃縮された集団を得るためにレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）を使用する方法について説明します。

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

この手順の全体的な目標は、その後の遺伝子発現分析のためにレーザーキャプチャマイクロダイセクションによって、凍結組織切片から海馬ニューロンと単一ニューロンの濃縮集団を取得する方法を実証することです。これは、最初に麻酔薬を投与することによって達成されます、麻酔室内のラット。次いで、ラットに挿管され、機械的に換気され、ラットを準備するために定位固定装置ヘッドホルダーに入れられる。2番目のステップは、流体パーカッション脳損傷を投与することです。次に、脳の冠状切片をクライオスタットで切断し、ニューロンの変性マーカーであるフルーロエイド、またはミサイル染色であるリアルバイオレットのいずれかで染色します。最後のステップは、レーザーキャプチャマイクロダイセクションを実行し、単一のニューロンまたはニューロンのプールを収集することです。最終的に、捕捉された細胞から全RNAを単離し、Agilentバイオアナライザーを使用して品質を分析し、定量化して、定量的リアルタイムPCRやパスウェイに焦点を当てたマイクロアレイ解析、ゲノムワイドなマイクロアレイ解析などのダウンストリームアプリケーションで使用されます。手動マイクロダイセクションのような既存の方法のこの技術の主な利点は、ニューロンまたはグリア細胞や免疫調節細胞などの他の脳細胞タイプの濃縮集団、または組織切片から単一ニューロンを取得できることです。これにより、脳内の異なる同定された細胞タイプや、複数の細胞タイプで構成される他の不均一な組織で遺伝子発現解析を行うことができますが、この手順を実証することは見逃されます。Debbie Boone、当研究室のシニアリサーチアソシエイト。まず、ラットから液体パーカッション、外傷性脳損傷、または偽損傷を受けた脳組織をマイナス80°Cの冷凍庫から取り出し、マイナス22°Cに移します。クライオスタットを10分間使用して、脳が解凍されている間に脳を切片温度にします。エタノールを含むRNAザップでクライオスタットを拭き、エタノールでブラシを洗浄します。10分が経過したら、脳をチューブから取り出し、腹側を上にしてクライオスタットステージのガーゼの上に置き、新しいカミソリの刃を使用して脳をスライスして脳の後部を取り除きます。小脳と視交叉の前部にちょうど吻側があります。クライオ型にOCT封入剤を充填し、前面を下にして脳を型に入れます。脳組織が白くなるまで、封入剤中で凍結させます。これには約 10 分かかります。次に、OCTで標本ディスクを脳に凍結します。次に、型を取り外します。ブレインを装着した状態でディスクを試料ヘッドに挿入し、ネジを締めます。使い捨てのロープロを挿入しますfile ナイフホルダーにブレードを締め、レバーを締めます。OCTの外層を取り除くために、脳を20ミクロンでスライスし始めます。海馬領域に到達したら、ミクロンダイヤルを10に設定します。スライドガラスまたはプラスガラスを配置して、冠状シリアルセクションを収集します。ティッシュ部分にスライドさせます。切片作製が完了するまで、スライドをマイナス20°CのRNAフリー染色ラックに置きます。切片の染色に進む前に、すべての染色容器とメスシリンダーをESEで拭き取り、ミリQ水ですすいでください。すべての溶液がRNAフリーの水で調製されていること、およびクレスタールバイオレットとフルオロジェイドの染色が以前に0.2ミクロンのフィルターを通過していることを確認してください。トール脳切片を室温で30秒間使用し、75%エタノールで1分間固定します。次に、ニューロンの帯または個々のニューロンのLCMのLCMのLCMの適切な対比染色に進み、固定後、スライドをRNAフリーウォーターで1分間リンスし、1%クレストバイオレットで1分間染色します。RNAフリーウォーターで1分間3回すすぎ、95%エタノールで脱水し、それぞれ30秒間2回脱水します。次に、100%エタノールを30秒間2回、キシレンを3分間ずつ2回加熱します。風乾後、ヒュームフード内のすべての切片を15分間乾燥させた後、LCMに進みます。LCM が実行されます。Pセル2 E顕微鏡と赤外線ダイオードレーザーを使用して、まず中央のジョイスティックを垂直位置に調整します。次に、Forexの目標を回転させて所定の位置にロックします。顕微鏡ステージの中央に染色された海馬切片のあるスライドを置き、海馬の領域が見えるまで手動で調整します。コースを使用して、フォーカス調整を見つけます。セクションに焦点を合わせるには、コントローラーのバキュームボタンを押してバキュームチャックをアクティブにします。次に、10 x対物レンズを回転させて所定の位置に固定します。コースと微調整で再び焦点を合わせます。マクロ LCM キャップのキャップをキャップとカセット・モジュールにセットし、キャップをロード・ラインの位置に取り付けます。キャップ配置アームを回転させ、キャップの周りに配置します。次に、キャップ配置アームを上げて、キャップをカセットモジュールから取り外します。キャップ配置アームをスライドの上で回転させてから、スライドの上に下げてキャップをスライドに置きます。ファインフォーカスを調整し、ジョイスティックを動かして、キャップの黒い円の内側にセルがあるかどうかを確認します。キャプチャするすべてのセルは、この黒い円の内側にある必要があります。次に、レーザーパラメータを設定します。まず、コントローラーのレーザーイネーブルボタンを押します。レーザーターゲットスポットはピンク色で表示されます。コンピュータモニターの視野内。レーザースポットサイズを小さく設定してレーザーを集束させ、最適なセルキャプチャのために必要に応じて出力と持続時間を1〜2ミリ秒で65〜75ミリワットに調整します。レーザーをテストするには、ジョイスティックを使用して、拾うセルがない領域にレーザースポットを移動します。サムスイッチを使用してレーザーを発射します。次に、ジョイスティックを使用してレーザースポットを溶融したポリマースポットから離し、レーザーが発射された透明な領域を囲む目に見える暗いリングがあるかどうかを確認します。細胞を捕捉するには、ジョイスティックを使用してレーザースポットを細胞の領域上に移動させ、レーザーを捕捉して発射します。親指スイッチを使用して、レーザーを発射しながらジョイスティックを動かし、細胞の広い領域をキャプチャします。目的の細胞をすべて発射した後、キャップ配置アームを持ち上げます。捕捉された細胞は組織切片から分離し、キャップに付着します。キャップ、残りの組織、欠落している細胞が視野に表示されます。キャップのセルは、スライドの空の部分にキャップを置くことによっても表示できます。キャップ配置アームを持ち上げ、キャップアンロードステーションまで回転させます。キャップをステーションに下げ、キャップ配置アームを回転させて元の位置に戻します。挿入ツールのキャップをプラットフォームに沿ってキャップにスライドさせます。キャップを取り付けた状態でツールをプラットフォームから持ち上げます。キャップを付箋の接着部分に軽く触れて、不要なティッシュをきれいに取り除きます。RN水性マイクロアイソレーションキットから得られた100マイクロリットルの溶解緩衝液で満たされた0.5ミリリットルのRNAフリーチューブにキャップを入れます。すぐにキャップを30秒間渦巻きにして嘘をつきます。細胞は、サンプルを摂氏42度で30分間インキュベートし、摂氏マイナス80度で凍結してRNAが単離します。固定後の単一損傷ニューロンのLCMの染色手順は、ニューロンの帯の手順と似ています。ただし、一部のインキュベーション時間は異なり、すすぎおよび脱水の前にフッ化物で4分間保持された切片については、染色後の詳細についてプロトコルのテキスト部分を参照してください。再度、ドラフト内のすべてのセクションを15分間風乾します。LCMに進み、シングルセルをロードキャプチャする前に、マクロLCMキャップと同じ手順を使用して、HS LCMキャップをキャップまたはカセットモジュールにキャプチャします。ここでも、レーザーの焦点を合わせるためにレーザースポットサイズを小さく設定しますが、今回はレーザー出力と持続時間を65〜75ミリワットに0.45〜0.5ミリ秒調整して、単一細胞の最適な細胞捕捉を実現します。キャップ配置アームをスライド上で回転させ、アームをスライドに向かって下げます。キャップをスライド上に配置するには、キャプチャHSキャップの表面をサンプルから高くします。LCM中に、ジョイスティックを使用して、単一のFluor Aid陽性細胞上でレーザーを動かします。キャプチャされるすべてのセルは、親指スイッチを使用してレーザーを発射するキャップの小さな黒いリングの内側にある必要があります。黒丸領域内のすべての細胞がレーザーリフト、キャップ配置アームで発射されると、捕捉された細胞は組織切片から分離し、捕捉hsキャップに付着します。次に、顕微鏡ステージに別のスライドを置き、HSキャップがいっぱいになるまでフルロエイド陽性細胞を収集します。次に、キャップを40〜50マイクロリットルの溶解、緩衝液、ボルテックス、インキュベーターで満たされた0.5ミリリットルのRNAフリーチューブに入れてから、再び摂氏マイナス80度で凍結します。そうでない場合は、プロトコルのテキスト部分の指示に従ってRNA単離をすぐに実行します。次の画像は、ラット脳の凍結されたラット脳の10ミクロンの冠状切片から特定の細胞集団の帯のレーザーキャプチャマイクロダイセクションを示しています。このプロトコルに従って調製され、クレスタルバイオレットとミサイル染色で染色されました。この画像は、ラット海馬の約1から約3のサブフィールドのパラメタルニューロンを示しています。ここでは、海馬歯状回における顆粒細胞が捕捉されている。最後に、第3脳室の両側と視交叉の上に位置する両側の視交叉上核から捕捉されたニューロンの帯を示します。SCNには、全身の概日リズムを制御するマスター概日時計が含まれています。次の図は、ラット海馬からの単一ニューロンのレーザーキャプチャマイクロダイセクションを示しています。ここに示されているのは、変性フッ化物陽性の海馬約3つのニューロンであり、ここに生き残ったフルロエイドは陰性の約3つのニューロンであり、LCMの前後に捕捉された細胞が示され、LCMキャップ上に視覚化されています。次の図は、レーザー捕捉されたニューロンから単離された全RNAの遺伝子発現解析を示しています。この画像は、SCNにおける概日時計遺伝子発現の定量的リアルタイムPCRデータを示しています。死にかけている海馬ニューロンと生存している海馬ニューロンにおける遺伝子発現のこのヒートマップは、焦点を絞ったPCRアレイを使用したアポトーシス関連遺伝子の発現プロファイリングを示しています。最後に、偽の損傷を受けたラットの約1〜約3ニューロンの遺伝子発現の全ゲノムENTマイクロアレイ分析から生成されたヒートマップの例を示します。TBIと、ニューロンの一酸化窒素、シンテース、またはグルタチオンペルオキシダーゼのいずれかの発現をノックダウンするように設計された横臥アデノ随伴siRNAウイルス。 どちらも脳損傷によって誘発される遺伝子です その発生後。これらの技術は、脳損傷やがんなど、多くの研究分野の科学者がこれらの疾患の動物モデルを使用して、特定の細胞集団のゲノムプロテオミクスおよび代謝プロファイリングを行う道を開きました。例えば、現在、これらの技術を用いて、依存症に関与することが知られている脳の前頭前野や側坐核の領域から特定の細胞集団をレーザーキャプチャーしています。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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