外傷性脳損傷後の神経細胞や遺伝子発現解析のための単一ニューロンの濃縮された集団のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

この手順の全体的な目標は、その後の遺伝子発現分析のためにレーザーキャプチャマイクロダイセクションによって、凍結組織切片から海馬ニューロンと単一ニューロンの濃縮集団を取得する方法を実証することです。これは、最初に麻酔薬を投与することによって達成されます、麻酔室内のラット。次いで、ラットに挿管され、機械的に換気され、ラットを準備するために定位固定装置ヘッドホルダーに入れ

2番目のステップは、流体パーカッション脳損傷を投与することです。次に、脳の冠状切片をクライオスタットで切断し、ニューロンの変性マーカーであるフルーロエイド、またはミサイル染色であるリアルバイオレットのいずれかで染色します。最後のステップは、レーザーキャプチャマイクロダイセクションを実行し、単一のニューロンまたはニューロンのプールを収集することです。

最終的に、捕捉された細胞から全RNAを単離し、Agilentバイオアナライザーを使用して品質を分析し、定量化して、定量的リアルタイムPCRやパスウェイに焦点を当てたマイクロアレイ解析、ゲノムワイドなマイクロアレイ解析などのダウンストリームアプリケーションで使用されます。手動マイクロダイセクションのような既存の方法のこの技術の主な利点は、ニューロンまたはグリア細胞や免疫調節細胞などの他の脳細胞タイプの濃縮集団、または組織切片から単一ニューロンを取得できることです。これにより、脳内の異なる同定された細胞タイプや、複数の細胞タイプで構成される他の不均一な組織で遺伝子発現解析を行うことができますが、この手順を実証することは見逃されます。

Debbie Boone、当研究室のシニアリサーチアソシエイト。まず、ラットから液体パーカッション、外傷性脳損傷、または偽損傷を受けた脳組織をマイナス80°Cの冷凍庫から取り出し、マイナス22°Cに移します。クライオスタットを10分間使用して、脳が解凍されている間に脳を切片温度にします。

エタノールを含むRNAザップでクライオスタットを拭き、エタノールでブラシを洗浄します。10分が経過したら、脳をチューブから取り出し、腹側を上にしてクライオスタットステージのガーゼの上に置き、新しいカミソリの刃を使用して脳をスライスして脳の後部を取り除きます。小脳と視交叉の前部にちょうど吻側があります。

クライオ型にOCT封入剤を充填し、前面を下にして脳を型に入れます。脳組織が白くなるまで、封入剤中で凍結させます。これには約 10 分かかります。

次に、OCTで標本ディスクを脳に凍結します。次に、型を取り外します。ブレインを装着した状態でディスクを試料ヘッドに挿入し、ネジを締めます。

使い捨てのロープロを挿入しますfile ナイフホルダーにブレードを締め、レバーを締めます。OCTの外層を取り除くために、脳を20ミクロンでスライスし始めます。海馬領域に到達したら、ミクロンダイヤルを10に設定します。

スライドガラスまたはプラスガラスを配置して、冠状シリアルセクションを収集します。ティッシュ部分にスライドさせます。切片作製が完了するまで、スライドをマイナス20°CのRNAフリー染色ラックに置きます。

切片の染色に進む前に、すべての染色容器とメスシリンダーをESEで拭き取り、ミリQ水ですすいでください。すべての溶液がRNAフリーの水で調製されていること、およびクレスタールバイオレットとフルオロジェイドの染色が以前に0.2ミクロンのフィルターを通過していることを確認してください。トール脳切片を室温で30秒間使用し、75%エタノールで1分間固定します。

次に、ニューロンの帯または個々のニューロンのLCMのLCMのLCMの適切な対比染色に進み、固定後、スライドをRNAフリーウォーターで1分間リンスし、1%クレストバイオレットで1分間染色します。RNAフリーウォーターで1分間3回すすぎ、95%エタノールで脱水し、それぞれ30秒間2回脱水します。次に、100%エタノールを30秒間2回、キシレンを3分間ずつ2回

風乾後、ヒュームフード内のすべての切片を15分間乾燥させた後、LCMに進みます。LCM が実行されます。Pセル2 E顕微鏡と赤外線ダイオードレーザーを使用して、まず中央のジョイスティックを垂直位置に調整します。

次に、Forexの目標を回転させて所定の位置にロックします。顕微鏡ステージの中央に染色された海馬切片のあるスライドを置き、海馬の領域が見えるまで手動で調整します。コースを使用して、フォーカス調整を見つけます。

セクションに焦点を合わせるには、コントローラーのバキュームボタンを押してバキュームチャックをアクティブにします。次に、10 x対物レンズを回転させて所定の位置に固定します。コースと微調整で再び焦点を合わせます。

マクロ LCM キャップのキャップをキャップとカセット・モジュールにセットし、キャップをロード・ラインの位置に取り付けます。キャップ配置アームを回転させ、キャップの周りに配置します。次に、キャップ配置アームを上げて、キャップをカセットモジュールから取り外します。

キャップ配置アームをスライドの上で回転させてから、スライドの上に下げてキャップをスライドに置きます。ファインフォーカスを調整し、ジョイスティックを動かして、キャップの黒い円の内側にセルがあるかどうかを確認します。キャプチャするすべてのセルは、この黒い円の内側にある必要があります。

次に、レーザーパラメータを設定します。まず、コントローラーのレーザーイネーブルボタンを押します。レーザーターゲットスポットはピンク色で表示されます。

コンピュータモニターの視野内。レーザースポットサイズを小さく設定してレーザーを集束させ、最適なセルキャプチャのために必要に応じて出力と持続時間を1〜2ミリ秒で65〜75ミリワットに調整します。レーザーをテストするには、ジョイスティックを使用して、拾うセルがない領域にレーザースポットを移動します。

サムスイッチを使用してレーザーを発射します。次に、ジョイスティックを使用してレーザースポットを溶融したポリマースポットから離し、レーザーが発射された透明な領域を囲む目に見える暗いリングがあるかどうかを確認します。細胞を捕捉するには、ジョイスティックを使用してレーザースポットを細胞の領域上に移動させ、レーザーを捕捉して発射します。

親指スイッチを使用して、レーザーを発射しながらジョイスティックを動かし、細胞の広い領域をキャプチャします。目的の細胞をすべて発射した後、キャップ配置アームを持ち上げます。捕捉された細胞は組織切片から分離し、キャップに付着します。

キャップ、残りの組織、欠落している細胞が視野に表示されます。キャップのセルは、スライドの空の部分にキャップを置くことによっても表示できます。キャップ配置アームを持ち上げ、キャップアンロードステーションまで回転させます。

キャップをステーションに下げ、キャップ配置アームを回転させて元の位置に戻します。挿入ツールのキャップをプラットフォームに沿ってキャップにスライドさせます。キャップを取り付けた状態でツールをプラットフォームから持ち上げます。

キャップを付箋の接着部分に軽く触れて、不要なティッシュをきれいに取り除きます。RN水性マイクロアイソレーションキットから得られた100マイクロリットルの溶解緩衝液で満たされた0.5ミリリットルのRNAフリーチューブにキャップを入れます。すぐにキャップを30秒間渦巻きにして嘘をつきます。

細胞は、サンプルを摂氏42度で30分間インキュベートし、摂氏マイナス80度で凍結してRNAが単離します。固定後の単一損傷ニューロンのLCMの染色手順は、ニューロンの帯の手順と似ています。ただし、一部のインキュベーション時間は異なり、すすぎおよび脱水の前にフッ化物で4分間保持された切片については、染色後の詳細についてプロトコルのテキスト部分を参照してください。

再度、ドラフト内のすべてのセクションを15分間風乾します。LCMに進み、シングルセルをロードキャプチャする前に、マクロLCMキャップと同じ手順を使用して、HS LCMキャップをキャップまたはカセットモジュールにキャプチャします。ここでも、レーザーの焦点を合わせるためにレーザースポットサイズを小さく設定しますが、今回はレーザー出力と持続時間を65〜75ミリワットに0.45〜0.5ミリ秒調整して、単一細胞の最適な細胞捕捉を実現します。

キャップ配置アームをスライド上で回転させ、アームをスライドに向かって下げます。キャップをスライド上に配置するには、キャプチャHSキャップの表面をサンプルから高くします。LCM中に、ジョイスティックを使用して、単一のFluor Aid陽性細胞上でレーザーを動かします。

キャプチャされるすべてのセルは、親指スイッチを使用してレーザーを発射するキャップの小さな黒いリングの内側にある必要があります。黒丸領域内のすべての細胞がレーザーリフト、キャップ配置アームで発射されると、捕捉された細胞は組織切片から分離し、捕捉hsキャップに付着します。次に、顕微鏡ステージに別のスライドを置き、HSキャップがいっぱいになるまでフルロエイド陽性細胞を収集します。

次に、キャップを40〜50マイクロリットルの溶解、緩衝液、ボルテックス、インキュベーターで満たされた0.5ミリリットルのRNAフリーチューブに入れてから、再び摂氏マイナス80度で凍結します。そうでない場合は、プロトコルのテキスト部分の指示に従ってRNA単離をすぐに実行します。次の画像は、ラット脳の凍結されたラット脳の10ミクロンの冠状切片から特定の細胞集団の帯のレーザーキャプチャマイクロダイセクションを示しています。

このプロトコルに従って調製され、クレスタルバイオレットとミサイル染色で染色されました。この画像は、ラット海馬の約1から約3のサブフィールドのパラメタルニューロンを示しています。ここでは、海馬歯状回における顆粒細胞が捕捉されている。

最後に、第3脳室の両側と視交叉の上に位置する両側の視交叉上核から捕捉されたニューロンの帯を示します。SCNには、全身の概日リズムを制御するマスター概日時計が含まれています。次の図は、ラット海馬からの単一ニューロンのレーザーキャプチャマイクロダイセクションを示しています。

ここに示されているのは、変性フッ化物陽性の海馬約3つのニューロンであり、ここに生き残ったフルロエイドは陰性の約3つのニューロンであり、LCMの前後に捕捉された細胞が示され、LCMキャップ上に視覚化されています。次の図は、レーザー捕捉されたニューロンから単離された全RNAの遺伝子発現解析を示しています。この画像は、SCNにおける概日時計遺伝子発現の定量的リアルタイムPCRデータを示しています。

死にかけている海馬ニューロンと生存している海馬ニューロンにおける遺伝子発現のこのヒートマップは、焦点を絞ったPCRアレイを使用したアポトーシス関連遺伝子の発現プロファイリングを示しています。最後に、偽の損傷を受けたラットの約1〜約3ニューロンの遺伝子発現の全ゲノムENTマイクロアレイ分析から生成されたヒートマップの例を示します。TBIと、ニューロンの一酸化窒素、シンテース、またはグルタチオンペルオキシダーゼのいずれかの発現をノックダウンするように設計された横臥アデノ随伴siRNAウイルス。 どちらも脳損傷によって誘発される遺伝子です その発生後。これらの技術は、脳損傷やがんなど、多くの研究分野の科学者がこれらの疾患の動物モデルを使用して、特定の細胞集団のゲノムプロテオミクスおよび代謝プロファイリングを行う道を開きました。

例えば、現在、これらの技術を用いて、依存症に関与することが知られている脳の前頭前野や側坐核の領域から特定の細胞集団をレーザーキャプチャ