Name: トランスジェニックフィッシュの無傷の脳内で識別ニューロンからの電気的活動を記録する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 学ぶ 無傷の脳内で識別ニューロンからの電気的活動を記録する手法。トランスジェニックメダカを用いてGFP標識GnRHニューロンのパッチクランプ記録を行い、神経回路を保ったまま活動電位の発火頻度変化を解析する。

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我々は技術支援のために博士孟チン林さんと元ドン感謝。この作品は、健康HD053767の国立研究所からの助成金（NLWに下請け）でサポートされている、研究担当副学長、カリフォルニア大学ロサンゼルス校（NLW）の生理学とOfficeの部門からの資金によってされました。

1。大人のメダカから脳の解剖<ol><li>に浸漬することにより（ 図1A）、男性または女性成人を麻酔5ミリリットルMS-222（150 mg / Lで、pHは7.4）、エラの動きがdecapitating前に中止した後、数分待ってください。すべての手順は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の制度動物実験委員会によって承認された。 </li><li> 60 mmの直径のペトリ皿にハサミで蓋の尾側端で魚の生理食塩水で魚の首を刈る。 </li><li>脳の解剖のために頭を置き、保護するためにその中にうつ病を持っている35 mmの直径ペトリ皿、半魚の生理食塩水で満たされ、シルガードが並んへの転送魚の頭を。位置や虫ピンと背側の頭を固定します。 </li><li>注意深く細かいハサミでその周囲に頭蓋骨の背の部分をカットし、静かに脊髄の前方部分を含む完全に脳の背の部分を露出させ、ピンセットでそれを削除します。 </li> &lt;リチウム&gt;細かいチップピンセットで軽く脊髄を持ち上げて、先の細いハサミで二国間の結合神経切断：の前方部分に脳神経、脊髄神経と視神経、脳の腹側に、そして嗅覚神経を脳。 </li><li>魚の生理食塩水で満たされた新鮮なペトリ皿に完全に解剖脳を置き、全体の脳は、任意の切り傷や刺し傷なし（下垂体を含む）を無傷であることを確認するために、顕微鏡下で慎重に確認してください。損傷した脳を実験のために使用されていません。 </li></ol> 2。録音室における脳の取り付け<ol><li>記録室の中心に針を持つシアノアクリレートまたはいくつかの他の速効性接着剤の小滴を置き、1cm 2の約 ​​のりを広げた。 </li><li>迅速に腹側を上位置に脳とのり、それを下に移す。 </li><li>それは録音室を埋め、脳を覆うように、魚の生理食塩水1 mlを加える。連続灌流少なくとも200μL/分の速度で通気魚の生理食塩水で脳。 </li><li>微先端鉗子を使用すると、慎重に脳の記録領域の表面上髄膜を除去します。 </li></ol> 3。電気生理学<ol><li>活動電位の発火の緩いパッチ記録<ol><li>ガラス微小電極（MΩ6-10）は、電極プラー（ 例えばサッターP-87）を使用して、ホウケイ酸ガラスピペット（1B150F-4、世界の精密機器）から構成され、バックアップルーズパッチ録音ソリューション中途半端で満たされている電極。 </li><li>次いで、40×水浸対物レンズ（ 図1C）、冷却された電荷結合素子（CCD）カメラで直立蛍光顕微鏡を用いて、GFPを発現する10倍（ 図1B）を介してTN-GnRH3ニューロンを見つける。彼らは終脳のすぐ前方嗅球の腹面内または付近に位置しています。 </li><li>提供しているビデオモニターに切り替え顕微鏡からリアルタイム画像TN-GnRH3ニューロンクラスター（ 図1C）を検索する。 </li><li>電極の先端がニューロン目標を超えているように、お風呂に微小電極を配置します。それが目詰まりしないように、微小電極に一定の若干正圧を適用し、ゆっくりと電極の先端とターゲットニューロンに近づく。 </li><li> AxoGraphソフトウェアとAxographソフトウェア（アクソン·インスツルメンツ）のアンプAxoclamp 200Bを使用して電圧クランプモードで電極抵抗を確認し、監視する。あなたは、電極の先端が神経細胞の表面上に、抵抗が若干変化することAxoGraph表示からであると、ビデオモニタから見ることができる場合には、低オン抵抗のシールを作るために正圧を解放し、必要に応じてわずかな負圧を適用するニューロン（&lt;100MΩ）。 </li><li>電流クランプモードに切り替えて、スケールを調整し、任意の現在の入力なしで連続して膜電位を記録電圧と記録速度の必要に応じ。データは、パワーラブソフトウエア（ADInstruments社製）により回収し、分析する。 </li><li>任意の治療（ 図2A）の前に、約5分間、通常の魚の生理食塩水のレコードベースラインの電気的活動。薬、ホルモン、ペプチドなどの浴灌流。魚の生理食塩水に加え、通常の魚の生理食塩水5、6、11でウォッシュアウト期間が続く200μL/分の速度、に続く。 </li></ol></li><li>膜電位の全細胞記録 3.1.4 - 全細胞パッチクランプ電気生理学的手順は、ステップ3.1.1から、上述した外ルーズパッチ記録過程と同様である。その後の手順は、それに応じてずれる。 <ol><li>電圧クランプモードで電極抵抗を確認し、監視する。あなたは、電極の先端が神経細胞の表面上に、抵抗変化がわずかに正を解放することをオシロスコープであることから、ビデオモニタから見ることができる圧力とニューロン（〜3ギガΩ）上の高抵抗シールを作るには少し負圧を適用する。破裂パッチを適用した膜に口で優しく吸引を適用し、あなたはMΩ約120から250への抵抗の急激な低下が表示されます。 </li><li>電流クランプモードに切り替え、必要に応じて電圧と記録速度のスケールを調整し、任意の現在の入力なしで連続して膜電位を記録します。 </li><li> 3.1.7（ 図2B）で上記のように任意の治療の前に、約5分間の通常の魚の生理食塩水のレコードベースラインの電気的活動。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotrophin-releasing+hormone+%28GnRH%29+in+the+animal+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Soc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom.</a> J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).</li>
<li>Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+cues+from+conspecifics+alter+electrical+activity+of+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+in+the+terminal+nerve+via+visual+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).</li>
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<li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+form+of+gonadotropin-releasing+hormone+in+the+medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).</li>
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<li>Abraham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gonadotropin-releasing+hormone-3+neuron+ablation+in+zebrafish%3A+effects+on+neurogenesis%2C+neuronal+migration%2C+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction.</a> Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).</li>
<li>Wayne, N. L., Kuwahara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-endorphin+alters+electrical+activity+of+gonadotropin+releasing+hormone+neurons+located+in+the+terminal+nerve+of+the+teleost+medaka+%28Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).</li>
<li>Oka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+gonadotrophin-releasing+hormone+neurones+and+steroid-sensitive+sexually+dimorphic+kisspeptin+neurones+in+teleosts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroendocrinol%22%5BJournal%5D)">Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts.</a> J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).</li>
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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

GnRHの3：GFPトランスジェニック魚は、直接·間接的に再生3、8-10に関与している行動の中央制御の神経統合や規制の基礎となる神経生理学的メカニズムを研究するためのユニークなモデルを提供します。このモデルシステムの重要な利点の一つは、12、神経回路6を中断することなく、電気生理学的記録のための神経細胞、9、11には比較的簡単にアクセスできるように、GFPを発現していることを多くのGnRH3ニューロンが脳の腹側表面に近いです（ 図図1B及び図1C、図3Aおよび図3B）。このビデオでは、メダカの無傷の成体脳におけるTN-GnRH3ニューロンから両方緩いパッチと細胞全体の記録を示している。 TN-GnRH3ニューロンは0.5-6Hz.Thereの周波数で発射自発的活動電位のトニックや鼓動パターンが自然発火で検出可能な性差なかった展示率5が、GnRH3ニューロンの電気活動の劇的な発達的変化は胚9</su...

<table><tbody><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td></td><td>BX50W (アップライト)</td></tr><tr><td>アンプ</td><td>アクソン機器</td><td></td><td>アクソクランプ 200B </td></tr><tr><td>A-Dコンバーター</td><td>Computer Interference Corp.</td><td></td><td>Digidata ITC-18 </td></tr><tr><td>冷却CCDカメラ</td><td>PCO Computer Optics</td><td></td><td>Sensicam</td></tr><tr><td>Xenon lamp</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFPフィルターセット</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イメージングソフトウェア</td><td>インテリジェントイメージングイノベーション</td><td></td><td>スライドブックソフトウェア </td></tr><tr><td>電気生理学データ収集ソフトウェア</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Axographソフトウェア </td></tr><tr><td>電気生理学データ収集ソフトウェア</td><td>AD Instruments Inc.</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>電気生理学のためのPowerLab Headstage</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>CV 203BU </td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Recording Chamber Platform</td><td>Warner Instrument Corp.</td><td></td><td>P1</td></tr><tr><td>レコーディングチャンバー</td><td>ワーナーインストゥルメントコーポレーション</td><td></td><td>RC-26G </td></tr><tr><td>電極プーラー</td><td>サッター器具</td><td></td><td>P87 </td></tr><tr><td>フィラメント 電極プーラー用</td><td>サッター器具</td><td>FB330B</td><td>3.0 mm 幅トラフ フィラメント</td></tr><tr><td>1.5 mm ガラス毛細血管</td><td>ワールド精密機器</td><td>1B150-4</td><td>マイク&#8211;シ</td></tr><tr><td>リンジ</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>309586</td><td>3 ml</td></tr><tr><td>MS-222 </td><td>シグマ</td><td>E10521-10G</td><td>エチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩</td></tr><tr><td>魚の生理食塩</td><td></td><td></td><td>mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES </td></tr><tr><td>電極溶液 (ルーズ パッチ) </td><td></td><td></td><td>mM:150 NaCl;3.5 KCl;2.5 CaCl<サブ>2</サブ>;1.3 MgCl<サブ >2</サブ>;10ヘペス;10グルコース</td></tr><tr><td>電極溶液(全細胞パッチ)</td><td></td><td></td><td>mM:112.5 K-グルコン酸;NaCl;17.5 KCl;0.5 CaCl2;1 MgCl<サブ >2</サブ>;5 MgATP;1エグタ;10ヘペス;1 GTPです。0.1ロイペプチン;10リン酸化クレアチン </td></tr></tbody></table>

トランスジェニックフィッシュの無傷の脳内で識別ニューロンからの電気的活動を記録する

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

複雑な行動を調節する神経回路の細胞生理学を理解することは、この作業はCNSの神経回路は無傷のままで無傷の脳の調製において実行可能なモデルシステムを使用して、大幅に高められる。私たちは、ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）ニューロンは遺伝的に無傷の脳内の識別のための緑色蛍光タンパク質でタグ付けされたトランスジェニック魚を使用しています。魚のGnRHニューロンの複数の集団があり、その機能は、脳内の場所と、彼らは1を表現することのGnRH遺伝子に依存しています。我々は、トランスジェニックメダカの無傷の脳（ 図1BおよびC）を使用して、嗅球に関連付けられているターミナル·神経（TN）に位置GnRH3ニューロンに私たちのデモを当てている。研究はメダカTN-GnRH3ニューロンは外部環境から中枢神経系への情報の送信器として作用する、神経調節であることを示唆している。トンちょっとなどのよく知られた視床下部GnRH1ニューロン2、3を実行します。TN-GnRH3ニューロンの自発活動電位の発火のトニックパターンが固有の特性4-6、周波数であり、下垂体-性腺機能の調節に直接的な役割を果たしていない同種2と神経ペプチドキスペプチン1 5からの視覚的な手がかりによって変調となっている。このビデオでは、TN-GnRH3のニューロンは神経細胞を識別し、脳全体での電気的活動を監視する方法をお見せするために強化された緑色蛍光タンパク質7にリンクGnrh3のプロモーター領域を含む導入遺伝子を発現するトランスジェニックメダカの安定したラインを使用準備6。

メダカの摘出脳からGFP標識TN-GnRH3ニューロンの二国間のクラスタの例を図1B及び1Cに示されている。各クラスタは、約8-10のGnRHニューロンを含んでいます。ターゲットTN-GnRH3の自発神経活動は、0.5〜6 Hzでの典型的な発火率と電流クランプモード（I = 0）で記録した。活動電位の発火のパターンはかなり規則的なスパイク間間隔で、通常はトニックや鼓動パターンです。サンプルトレースは図2（：;：全細胞2Bルーズパッチ2A）に示されている。 この実験的なアプローチでは、成人のゼブラフィッシュ（ 図3Aおよび図3B）の前脳に位置GFP標識のGnRHニューロンからの記録でも成功しています。ルーズパッチ（ 図3C）および全細胞記録（によってメダカに上記のように切 ​​除し、無傷の脳内の神経細胞の電気的活動は、同様の方法で記録された<stronG&gt;図3D）。メダカTN-...

このビデオでは、複雑な神経回路を維持し、脳全体の準備、で識別される単一のニューロンからの電気的活動を記録する方法を説明します。私たちは、ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）ニューロンは遺伝的に無傷の脳の準備の識別のための蛍光タンパク質でタグ付けされたトランスジェニック魚を使用しています。

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

本手順の全体的な目的は、無傷の魚類脳標本からニューロンの電気活動を記録することです。まず、MS 2 22で生後4〜6ヶ月のトランスジェニックゼブラフィッシュを麻酔し、脳を摘出します。次に、GFPで標識された目的のニューロンの1つに記録電極を接触させ、ルーズパッチまたはホールセルパッチクランプ電気生理学を用いてその電気活動を記録します。最終的に、これらの結果から、無傷の脳におけるさまざまな処理に応じた活動電位の発火頻度の変化や、膜電位の変化を示すことができます。細胞電気生理学や培養細胞、あるいは脳スライス標本などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、神経回路が維持された全脳標本においてニューロンの電気的特性を特徴付けられる点にあります。これらの測定結果は生殖神経内分泌学に洞察を与えるだけでなく、モチベーションや情動行動を制御するニューロンなどの他の神経系にも、ゼブラフィッシュを用いて応用することが可能です。このデモンストレーションでは、GnRH3ニューロンがGFPで遺伝的に標識されたトランスジェニックゼブラフィッシュを使用します。まず、成魚のゼブラフィッシュを5 mLのMS-222に浸して麻酔をかけます。鰓の動きが停止してから数分後、魚を魚用生理食塩水を入れた60 mmのペトリ皿に移します。次に、はさみを用いて、魚の尾端側の喉の部分から切断して脱頭します。頭部を、魚類用生理食塩水が半分まで満たされ、yl guardが敷かれた直径35 mmのペトリ皿に移します。皿の中央には窪みが必要であり、そこに頭部を背面側に上にして配置し、昆虫針を用いて固定します。微細剪刀を用い、頭蓋骨の背面部分の周囲を慎重に切り開きます。次に、ピンセットで頭蓋骨を慎重に除去し、脊髄の前部を含む脳の背側を露出させます。続いて、微細チップピンセットで脊髄をそっと持ち上げ、微細チップ鋏を用いて両側の結合神経を切断します。これには、脳神経、脊髄神経、視神経の腹側、および前嗅神経の切断が含まれます。完全に解剖した脳を、新鮮な魚用生理食塩水で満たした新しいペトリ皿に入れ、顕微鏡下で観察します。脳全体および下垂体が損傷しておらず、切断や穿孔がないことを注意深く確認してください。損傷した脳は廃棄し、針を用いて最初からやり直してください。シアノアクリレートなどの速乾性接着剤を、記録室の中心に少量滴下します。接着剤を1 cm²の範囲に広げます。その後、速やかに脳を接着剤の上に移動させます。腹側を上にして固定します。次に、脳を覆うように、記録チャンバーに魚用生理食塩水を約1 mL注入します。先端の細いピンセットを用いて、脳の記録領域表面にある髄膜を前方に向かって慎重に除去します。曝気した魚用生理食塩水を、1分間に少なくとも200 µLの速度で脳に持続的に灌流させます。6～10 MΩのガラス微小電極を数本作製し、ルーズパッチ記録液を半分ほど充填します。冷却CCDカメラを備えた正立蛍光顕微鏡を用い、10倍対物レンズから始めて、GFPを発現している末端神経節RH3ニューロンを探します。次に、40倍の対物レンズに切り替え、頭部の直前にある嗅球の腹側表面またはその付近にあるニューロンを探します。その後、顕微鏡からのリアルタイム画像を表示しているビデオモニターに切り替えます。このニューロンクラスターには、8〜10個のGnRHニューロンが含まれています。マイクロ電極を記録チャンバーのバス内に配置し、電極の先端を標的ニューロンの上に位置させます。マイクロ電極の詰まりを防ぐため、常にわずかな正圧をかけます。電極先端を標的ニューロンにゆっくりと近づけ、Axo graftソフトウェアを用いて電極抵抗を確認および監視してください。ボルテージクランプモードでシールテストを行い、電極の先端がニューロンの表面に接触した際に、電極抵抗がわずかに変化することを確認します。必要に応じて、正圧を解除して軽い負圧を加え、低抵抗シールを形成します。良好な記録を得るための最も重要なステップは、清潔なニューロンを選択することであり、これにより電極と細胞膜との間に理想的なシールを形成することができます。次に、カレントクランプモードに切り替えます。PowerLabプログラムのChartを開き、電流を入力せずに膜電位の連続記録を開始します。必要に応じて電圧のスケールと記録速度を調整し、薬剤などの処理を行う前に、通常の魚用生理食塩水中で約5分間、基線の電気活動を記録します。薬剤、ホルモン、ペプチドなどのバス灌流は、200 µL/minの流量で脳標本に添加してください。次に、細胞を確認した後の洗浄期間には通常の魚類用生理食塩水を使用し、ボルテージクランプモードで電極抵抗をチェックし、モニターします。電極の先端がニューロンの表面に接触し、電極抵抗がわずかに変化した時点で、正圧を解除し、わずかに負圧をかけてニューロンに高抵抗シール（ギガシール）を形成させます。緩やかに口で吸引します。パッチを当てた細胞膜を破裂させます。膜が破れると、抵抗値は瞬時に約 120 から 250 mega ohms まで低下します。次にカレントクランプモードに切り替え、電流を入力せずにチャートを用いて膜電位を連続的に記録します。ここでも、必要に応じて電圧のスケールと記録速度を調整してください。通常の魚用生理食塩水中で約5分間、電気活動のベースライン記録を行った後、処置を施し、続いて洗浄期間を設けます。moca末梢神経GNRH3ニューロンの自発的な電気活動を、カレントクランプモードで記録しました。典型的な発火率は0.5から6 Hzの活動電位です。活動電位は通常、かなり規則的なスパイク間隔を持つ強直性または拍動性のパターンで発火し、スパイク間の膜電位は平均して約-48 mVです。この実験的手法は、成体トランスジェニック個体の前脳に位置するGFP標識GNRHニューロンからの記録にも有効です。トランスジェニックゼブラフィッシュの摘出された完全な脳におけるニューロンの電気活動を記録しました。ゼブラフィッシュの記録は、ルースパッチ法を用い、DACAで記載されているのと同様の方法で行われました。また、同一の技術を用いてホールセル記録も行いました。中脳末端神経のGnRHニューロンとは異なり、ゼブラフィッシュの前視床下部、腹側頭部、および視床下部におけるGnRHニューロンの自発的な活動電位の発火パターンは、しばしば不規則です。この手法を習得すれば、適切に実施することで、15分間の記録を1時間で完了させることができます。ご成功をお祈りします。

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神経科学

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