トランスジェニックフィッシュの無傷の脳内で識別ニューロンからの電気的活動を記録する

本手順の全体的な目的は、無傷の魚類脳標本からニューロンの電気活動を記録することです。まず、MS 2 22で生後4〜6ヶ月のトランスジェニックゼブラフィッシュを麻酔し、脳を摘出します。次に、GFPで標識された目的のニューロンの1つに記録電極を接触させ、ルーズパッチまたはホールセルパッチクランプ電気生理学を用いてその電気活動を記録します。

最終的に、これらの結果から、無傷の脳におけるさまざまな処理に応じた活動電位の発火頻度の変化や、膜電位の変化を示すことができます。細胞電気生理学や培養細胞、あるいは脳スライス標本などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、神経回路が維持された全脳標本においてニューロンの電気的特性を特徴付けられる点にあります。これらの測定結果は生殖神経内分泌学に洞察を与えるだけでなく、モチベーションや情動行動を制御するニューロンなどの他の神経系にも、ゼブラフィッシュを用いて応用することが可能です。

このデモンストレーションでは、GnRH3ニューロンがGFPで遺伝的に標識されたトランスジェニックゼブラフィッシュを使用します。まず、成魚のゼブラフィッシュを5 mLのMS-222に浸して麻酔をかけます。鰓の動きが停止してから数分後、魚を魚用生理食塩水を入れた60 mmのペトリ皿に移します。次に、はさみを用いて、魚の尾端側の喉の部分から切断して脱頭します。

頭部を、魚類用生理食塩水が半分まで満たされ、yl guardが敷かれた直径35 mmのペトリ皿に移します。皿の中央には窪みが必要であり、そこに頭部を背面側に上にして配置し、昆虫針を用いて固定します。微細剪刀を用い、頭蓋骨の背面部分の周囲を慎重に切り開きます。

次に、ピンセットで頭蓋骨を慎重に除去し、脊髄の前部を含む脳の背側を露出させます。続いて、微細チップピンセットで脊髄をそっと持ち上げ、微細チップ鋏を用いて両側の結合神経を切断します。これには、脳神経、脊髄神経、視神経の腹側、および前嗅神経の切断が含まれます。

完全に解剖した脳を、新鮮な魚用生理食塩水で満たした新しいペトリ皿に入れ、顕微鏡下で観察します。脳全体および下垂体が損傷しておらず、切断や穿孔がないことを注意深く確認してください。損傷した脳は廃棄し、針を用いて最初からやり直してください。

シアノアクリレートなどの速乾性接着剤を、記録室の中心に少量滴下します。接着剤を1 cm²の範囲に広げます。その後、速やかに脳を接着剤の上に移動させます。

腹側を上にして固定します。次に、脳を覆うように、記録チャンバーに魚用生理食塩水を約1 mL注入します。先端の細いピンセットを用いて、脳の記録領域表面にある髄膜を前方に向かって慎重に除去します。

曝気した魚用生理食塩水を、1分間に少なくとも200 µLの速度で脳に持続的に灌流させます。6～10 MΩのガラス微小電極を数本作製し、ルーズパッチ記録液を半分ほど充填します。冷却CCDカメラを備えた正立蛍光顕微鏡を用い、10倍対物レンズから始めて、GFPを発現している末端神経節RH3ニューロンを探します。

次に、40倍の対物レンズに切り替え、頭部の直前にある嗅球の腹側表面またはその付近にあるニューロンを探します。その後、顕微鏡からのリアルタイム画像を表示しているビデオモニターに切り替えます。このニューロンクラスターには、8〜10個のGnRHニューロンが含まれています。

マイクロ電極を記録チャンバーのバス内に配置し、電極の先端を標的ニューロンの上に位置させます。マイクロ電極の詰まりを防ぐため、常にわずかな正圧をかけます。電極先端を標的ニューロンにゆっくりと近づけ、Axo graftソフトウェアを用いて電極抵抗を確認および監視してください。

ボルテージクランプモードでシールテストを行い、電極の先端がニューロンの表面に接触した際に、電極抵抗がわずかに変化することを確認します。必要に応じて、正圧を解除して軽い負圧を加え、低抵抗シールを形成します。良好な記録を得るための最も重要なステップは、清潔なニューロンを選択することであり、これにより電極と細胞膜との間に理想的なシールを形成することができます。

次に、カレントクランプモードに切り替えます。PowerLabプログラムのChartを開き、電流を入力せずに膜電位の連続記録を開始します。必要に応じて電圧のスケールと記録速度を調整し、薬剤などの処理を行う前に、通常の魚用生理食塩水中で約5分間、基線の電気活動を記録します。薬剤、ホルモン、ペプチドなどのバス灌流は、200 µL/minの流量で脳標本に添加してください。

次に、細胞を確認した後の洗浄期間には通常の魚類用生理食塩水を使用し、ボルテージクランプモードで電極抵抗をチェックし、モニターします。電極の先端がニューロンの表面に接触し、電極抵抗がわずかに変化した時点で、正圧を解除し、わずかに負圧をかけてニューロンに高抵抗シール（ギガシール）を形成させます。

緩やかに口で吸引します。パッチを当てた細胞膜を破裂させます。膜が破れると、抵抗値は瞬時に約 120 から 250 mega ohms まで低下します。

次にカレントクランプモードに切り替え、電流を入力せずにチャートを用いて膜電位を連続的に記録します。ここでも、必要に応じて電圧のスケールと記録速度を調整してください。通常の魚用生理食塩水中で約5分間、電気活動のベースライン記録を行った後、処置を施し、続いて洗浄期間を設けます。moca末梢神経GNRH3ニューロンの自発的な電気活動を、カレントクランプモードで記録しました。

典型的な発火率は0.5から6 Hzの活動電位です。活動電位は通常、かなり規則的なスパイク間隔を持つ強直性または拍動性のパターンで発火し、スパイク間の膜電位は平均して約-48 mVです。この実験的手法は、成体トランスジェニック個体の前脳に位置するGFP標識GNRHニューロンからの記録にも有効です。

トランスジェニックゼブラフィッシュの摘出された完全な脳におけるニューロンの電気活動を記録しました。ゼブラフィッシュの記録は、ルースパッチ法を用い、DACAで記載されているのと同様の方法で行われました。また、同一の技術を用いてホールセル記録も行いました。

中脳末端神経のGnRHニューロンとは異なり、ゼブラフィッシュの前視床下部、腹側頭部、および視床下部におけるGnRHニューロンの自発的な活動電位の発火パターンは、しばしば不規則です。この手法を習得すれば、適切に実施することで、15分間の記録を1時間で完了させることができます。ご成功をお祈りします。