カチオン性リポソームを介した特異的siRNAの再配達によるマウスの肺におけるIntersectin-1Sの長期サイレン。電子顕微鏡によるノックダウン効果の評価

本実験の全体的な目的は、intersectin-1の長期的なノックダウンがマウスの肺の構造および機能に及ぼす影響を評価することです。まず、第2段階としてマウスの肺血管系を標的とする特定のINA二本鎖リポソーム複合体を調製します。次いで、intersectin-1の発現を効率的に抑制するため、このINAリポソーム複合体を眼窩後静脈路投与により、24日間連続して72時間ごとに繰り返し投与します。

次に、injected miceの肺組織を採取し、intersect in oneのタンパク質およびmRNAレベルの評価、ならびに肺の広範な形態学的解析を行うため、生化学的分析とEM調査を実施します。肺溶解物を特異的なintersect in one抗体を用いたウェスタンブロットおよびQ-R-T-P-C-Rで解析した結果、24日間にわたり特異的かつ効率的なintersect in oneのノックダウンが維持されていることが示されました。ライマーやレンチウイルスなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、肺へのonic liposomesの送達が再現可能で安全であり、非毒性で、肺内皮において極めて有効であることです。

私たちは、in vivoでNの抑制が交差的に及ぼす影響を評価することを決定した際、他のsRNAデリバリー法ではうまくいかなかったため、この手法を考案しました。カチオン性リポソームを調製するには、丸底フラスコにジメチルジオドデシルアンモニウムブロミド（DOAB）のストック溶液315 µLを加え、続いてコレステロールストック溶液200 µLとクロロホルム9.5 mLを加え、旋回させて混合します。フラスコを、温度37 °C、回転数100 rpm以上に設定したエバポレーターに取り付けます。

アルゴンの1番目のバルブを時計回りに回して完全に開きます。必ずこのバルブを最初に開閉してください。2番目のバルブは、フラスコに吹き込むアルゴンの圧力を制御します。

緩やかな圧力がかかるように、部分的に開放します。アルゴンガスタンクとロトバポレーターを接続するチューブにドライアイスの結露が滴り始めたら、フラスコが完全に浸からない程度に水面に触れるまで、ロトバポレーターをウォーターバスに下げます。回転速度ダイヤルを100〜120 RPMまで上げます。フラスコ内のクロロホルムがすべて蒸発したら、装置を停止します。

ロータリーエバポレーターの回転速度ダイヤルをゼロにし、アルゴンタンクのバルブを閉じます。フラスコを取り出します。脂質を再懸濁させるため、5%glucose溶液を2mL、フラスコに加えます。

1 mLピペットチップを用いて、すべての脂質を溶解させるためにフラスコの底を十分に掻き出します。得られた溶液を42 °Cのウォーターバスで1時間インキュベートし、その間、フラスコをゆっくりとボルテックスします。フラスコを立てた状態で、底がソニケーター内の冷水にわずかに触れるようにし、溶液を少なくとも20〜30分間超音波処理します。

次に、丸底フラスコを水に浸した状態で、ロータリーエバポレーターの水浴を用いて42 °Cで20分間、回転速度ゼロで加熱します。リポソームを0.47 µmのシリンジフィルターでろ過し、続いて0.22 µmのシリンジフィルターでろ過します。小型エクストルーダーを用いて、リポソームを50 nmのメンブレンでろ過し、均一な単層リポソーム小胞集団を生成します。

リポソームをエッペンドルフチューブに移し、氷上に置きます。リポソーム8 molに対しRNA 2 µgの比率で、リポソームirna ITSN複合体を調製します。この例では、I-A-I-T-S-Nを 50 µL 使用します。

50 µMのストック溶液から、RNase/DNaseフリーのEORチューブを用いて、調製直後のリポソーム100 µLに添加します。マウスに投与するまで、混合液は氷上で保持してください。本研究に使用したマウスは、週齢4～6週、体重約25 gです。

投与前に、足先をつまむことで動物が十分に麻酔状態にあることを確認します。使用するシリンジは、針付きの1 mL結核用シリンジで、片手で保持します。マウスの耳を持ち、マウスを横向きに倒して眼内角を露出させます。

PIKA半月板の内側を狙い、眼球に触れないようにしてください。薬剤を充填したシリンジを用い、3軸すべてにおいて45度の角度で眼の涙嚢にアプローチします。混合液をゆっくりと注入し、マウスをケージに戻して、注入した側を下にして回復させます。

マウスにITSN1遺伝子を標的とするsiRNAを72時間ごとに24日間投与します。この手順を開始する前に、逃避反射がないことを確認し、マウスが完全に麻酔されていることを検証してください。開腹術を行い、横隔膜を摘出します。

次に、胸腔を開いて肺と心臓を露出させます。より正確に行うため、StereoZoom顕微鏡を用いて胸腺を摘出します。その後、肺動脈にカテーテルを挿入します。

次に、気管切開を行い、気管口からマウスを挿管します。人工呼吸器を、呼吸数150回/分、1回換気量150 µLに設定します。流出路として、1.5 mL/分に設定したペリスタルティックポンプと37 °Cに加温したHank's溶液を用いて、左心房を開通させます。

マウスの肺血管を5分間灌流して血液を除去した後、トレーサーを用いて10分間灌流します。未結合のトレーサーを洗い流した後、4% formaldehyde、2.5% gluar aldehyde、および1% tannic acidを10分間灌流し、肺のin situ固定を行います。肺を回収し、余分な組織を除去します。

肺を小さなブロック状に切り分け、2 mLの固定液混合液が入ったラベル付きシンチレーションバイアルに移します。電子顕微鏡用の肺組織処理を開始するため、まず肺ブロックを0.1 Mのナトリウム緩衝液で短時間、3回洗浄します。

次に、室温で1時間、0.1 Pipee緩衝液中の4%aldehyde 2.5%glutaraldehydeで標本を固定します。Callen burger緩衝液で一度洗浄した後、フード内で氷上の暗所で1時間、1%Pilate Osmiumを用いて後固定します。標本をCallen burger緩衝液中で、室温で2時間から一晩インキュベートします。50%ethanolで一度洗浄し、その後、段階的な濃度のエタノール系列を用いて脱水します。

70% ethanolで5分間、95% ethanolで5分間、次いで100% Ethanolで15分間ずつ2回処理します。その後、100% propylene oxideに切り替え、15分間のインキュベーションを2回行います。

プロピレンオキシドを除去し、50%プロピレンオキシドと50%Eponの混合液を加えます。室温でホイール回転させながら一晩インキュベートします。翌朝、混合液を除去し、新鮮なEponを加えます。ホイール上で少なくとも4〜5時間放置します。

選択した検体を、新鮮な100% Epon 812を半分まで満たしたダブルテーパードモールドに入れます。検体を端に配置し、モールドを60 °Cのインキュベーターに移して48～72時間硬化させます。ITSN1 siRNAリポソーム複合体を繰り返し投与し、21日間連続でITSN1の発現を慢性的に抑制した結果、マウスの肺においてITSN1タンパク質レベルが有意に低下しました。ここに示す代表的な結果のように、未処理のコントロール群および処理群マウスの肺ライセートを用い、siRNA投与後の指定された複数の時点において、ITSN1およびactinに対する抗体でブロットを行いました。

代表的な高感度ブロットCLフィルムのデンシトメトリー解析およびITSN1 mRNAの定量RT-PCRにより、ITSN1 siRNAリポソーム複合体による処理がマウス肺におけるITSN1タンパク質を効率的にダウンレギュレートすることがさらに確認されました。ITSN1レベルの低下は、エンドサイトーシスの不全と内皮輸送の乱れを引き起こし、内皮間バリアの崩壊および肺水腫を招きます。これらの肺組織の代表的な電子顕微鏡写真は、8 nmの金コロイド標識アルブミン粒子によって全長にわたってラベル付けされた、開いた内皮間接合（IJ）を示しています。

パネルA1はパネルAの拡大図であり、矢印は同一平面上に近接して位置する3〜4個の金コロイドアルブミン粒子を示しています。これはIEJの広い開口部を示唆しています。金コロイド粒子は、パネルA1およびBの矢印で示されるIJの管腔外出口にも認められます。また、パネルAのアスタリスクで示されるCVE Aの数の限定性と、毛細血管周囲腔の拡張にも注目してください。インテクトin1発現の急激なダウンレギュレーションにより、不十分なエンドサイトーシスを補うために代替輸送経路がアップレギュレートされました。

これらの電子顕微鏡（EM）画像は、パネルAに膜状のリングを、パネルBに多形性の細管を、そしてパネルCに典型的なcve LAと融合した拡大エンドソームを示しており、これらが金アルブミンの取り込みと輸送に積極的に関与していることがわかります。また、血管周囲腔の重度の拡張と蛋白性浮腫も観察されます。intersect in oneの発現を24日間持続的に抑制することで、血管内皮バリアの完全性が部分的に回復し、マウスの肺浮腫が軽減されました。

電子顕微鏡（EM）による形態学的研究により、8 nmの金 albumin トレーサーはこの時点ではIEJを通過できず、代わりに矢印で示された接合部の腔側入口にろ過残渣を形成することが示されました。しかし、血管周囲腔（PVS）にはある程度の拡張と軽度の浮腫が見られ、接合部はこのサイズの粒子に対して不透過性であることが示唆されましたが、形質膜に近接する漏出性の多胞体（MVB）内の一部の小型小胞には、8 nmの金 albumin 粒子による標識が認められました。この表は、コントロール群および欠損マウスの肺内皮におけるエンドサイトーシスによるtrans cyto構造の数を示しています。

重要な知見として、ITSN1欠損マウスの肺内皮におけるcaveolaeの数の減少が挙げられます。ITSN1発現の慢性的な抑制は、代替的なエンドサイトーシス経路の活性化を引き起こし、金コロイドアルブミン粒子で標識される膜状のリングまたは管状構造であるcaveolaeの数を部分的に減少させました。また、ITSN1慢性欠損マウスの肺内皮では、対照群と比較して14倍の増加も認められました。

本手順に続き、マウス肺溶解液を用いたELISAなどの手法を実施することで、異なるhnicトレーサーの血管内皮輸送量を定量的に推定できます。このビデオを視聴することで、目的のタンパク質をノックダウンし、その機能を評価するために、onicリポソームとsiRNAの複合体をマウス肺内皮に特異的に送達する方法について十分に理解できるはずです。