GST-Hisの精製：全長精製タンパク質を降伏二段階アフィニティー精製プロトコル

本実験の総合的な目的は、高度に精製された目的タンパク質のフルレングス体を得ることです。これは、組換えバキュロウイルスを作製し、それを用いてSf9昆虫細胞に感染させることで、2つのタグを付加した目的タンパク質を高発現かつ可溶性の状態で得ることにより達成されます。その後、グルタチオンS-トランスフェラーゼタグ付きタンパク質の精製と、それに続く金属アフィニティークロマトグラフィーによる2段階のアフィニティー精製が行われます。

精製の result として、高純度のヒスチジンタグ付きタンパク質が得られます。次に、保存バッファー中の塩濃度を低く抑えるため、精製したタンパク質サンプルを透析します。SDS-PAGEゲルの全タンパク質染色に基づき、タンパク質の発現溶解性、量、および品質に関する結果を得ます。

この手法のアイデアは、PAL B twoやBOC twoのような、大きく不安定なタンパク質の精製に困難が生じた際に得られました。したがって、一段階のアフィニティー精製などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、この二段階アフィニティー精製プロトコルを用いることで、得られるタンパク質が非常に高純度であり、一般的に分解産物が含まれていないことです。この方法は、精製された組換えタンパク質の生化学的機能など、タンパク質生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

本プロトコルは、組換えbaoウイルスの作製から始まり、次いで、感染のためのテキストプロトコルに記載されている通り、最も効率的なBAウイルスを選別します。500 mLの培地中に0.75～1.0 × 10⁶個のSF9細胞を含むスピナー培養容器を準備し、ウイルスと培地の比率を1:150にします。スピナーを細胞培養フード内に設置し、スピナーのアームの一方から必要量のbaulaウイルス懸濁液を細胞懸濁液に添加して、細胞を感染させます。

感染細胞を27 °Cで浮遊培養し、最も効率的なバキュロウイルスを選択した際に決定した最大タンパク質発現量に達した時点で細胞を回収します。細胞回収後、目的タンパク質を発現しているSf9細胞を、プロテアーゼ阻害剤を添加した約20 mLのGST結合バッファーを用い、氷水浴中で溶解します。ホモジナイザーで溶液を20回上下に攪拌し、次に32秒間の超音波処理を3サイクル行い、再度20回上下に攪拌します。次に、細胞溶解液を18,000 RPMで30分間、4 °Cで遠心分離し、上清を回収します。この可溶性細胞溶解液を、あらかじめ洗浄した1 mLのGSTビーズとともに、緩やかな回転条件下で4 °Cにて1時間インキュベートします。

インキュベーション時間は、タンパク質の安定性と結合後の結合効率に応じて最適化してください。700 RPMで短時間遠心し、未結合タンパク質を含む上清を除去します。GST結合タンパク質をGST洗浄バッファーで洗浄します。

最後の洗浄の後、この工程を2回繰り返します。上清を可能な限り取り除きます。その後、インキュベーション後のヒートショックタンパク質の非特異的結合を避けるため、GST結合バッファー10 mLに5 mM ATPおよび15 mM 塩化マグネシウムを加えた溶液中で、ビーズを4°Cで1時間インキュベートします。

GST洗浄バッファーでビーズを3回洗浄します。GSTビーズを遠心分離して上清を除去した後、P five bufferでGSTビーズを洗浄します。次に、GSTビーズを100 µLずつに分注し、100 µLのP five bufferで希釈した4〜8 unitsのprecision enzymeを加えます。

GSTビーズと酵素を4°Cで緩やかに回転させながら、3時間から一晩インキュベートします。インキュベーション時間は、切断後のタンパク質の安定性に加えて、その分子量に応じて最適化してください。クイックスピンを行い、上清を回収します。

ビーズにP five bufferを100 µL加えます。その後、遠心分離と上清の回収を2回繰り返します。すべての画分を回収してください。

EITを1 mLずつの3つの分画に分け、あらかじめ洗浄したtalon metal affinity resin dry beads 100 µLと共に、回転条件下で1時間インキュベートします。溶出液を数分画に分けることで、結合および洗浄効率が向上します。次に、4 °Cで緩やかな回転をかけながら、P 30 bufferを用いて樹脂を5分間洗浄します。この洗浄を2回繰り返した後、ビーズを単一のチューブに回収し、精製タンパク質を溶出させます。

タンパク質が結合したTalonレジンにP 500バッファーを加えます。バッファーとビーズの添加比率は、容量比で1:1とします。懸濁液を回転させながら5分間インキュベートします。

この手順を2回繰り返します。精製タンパク質を保存するため、溶出した各画分を分けて保持してください。攪拌しながら4 °Cで1時間、適切な保存バッファーを用いてタンパク質の透析を2回行います。

透析中に精製タンパク質が沈殿していないか確認することが重要です。精製タンパク質を少量ずつ分注し、ドライアイス上で30分間凍結させます。分注したサンプルは-80°Cで保存し、凍結融解の繰り返しを避けてください。

各フラクションを約 20 to 40 µL ずつ SDS-PAGE ゲルにロードし、精製過程を分析します。ゲルの電気泳動後、可視化のためにクマシーブルーまたはタンパク質染色剤で染色します。REC 14 組換えバキュロウイルスに感染させた SF nine 細胞、および対照としての擬似感染細胞から得られた可溶性および全細胞溶解物をクマシーブルーで染色して分析し、精製過程における GST-RE14-His タンパク質の発現を確認しました。本手法の効率を追跡するため、多数のサンプルをクマシーブルーによって分析しました。

染色結果から、精製の第一段階においてGST Rec 14がGSTビーズに正しく結合していたことが示されました。GSTとの融合により、見かけの分子量は約50 kilodaltonsでしたが、G-S-T-G-S-Tでの精密切断後は、遊離したrec 14 hissが約37 kilodaltonsに移動しています。切断されたGSTはGSTビーズ上で確認でき、一部の遊離したREC 14が依然としてGSTビーズに結合していましたが、REC 14 hissの顕著な濃縮が達成されました。このステップは、精密プロテアーゼによるタンパク質のインキュベーション時間を延長することで改善可能です。Talonビーズに結合したREC 14 hissの解析結果を、GST精製ステップ後のタンパク質と比較すると、REC 14 hissの大部分がTalonビーズに結合していることが示されています。

数回の洗浄後、rec 14 hissを溶出・回収し、3回の溶出操作を行った。分析の結果、rec 14 hissの高純度が確認された。また、溶出画分と溶出後のタロンビーズを比較したところ、1回目の溶出でrec 14 hissが最高濃度で回収されており、ビーズに結合したままのrec 14 hissはほとんど検出されなかったことから、この溶出操作の効率性が示された。

これらのサンプルは、REC 14を追跡するために、抗GST抗体および抗His抗体を用いたウェスタンブロット解析にも供されました。手順全体を通して、抗GSTブロットにより、GST精製ステップから得られたタンパク質に一部のGST-REC 14およびGST単体が混在していたこと、そしてHisタグアフィニティ精製ステップによって不純物が除去されたことが示されています。このブロットにより、プレシジョン処理とHisタグ精製ステップによって、REC 14からGSTが効率的に除去されたことが明らかになりました。

抗Hisタグブロットは、REC 14を検出することを目的としています。このブロットにより、GST-REC 14-HisおよびREC 14-Hisが完全に切断されず、GSTビーズから除去されなかったことが確認されます。さらに、高濃度ではREC 14が凝集していると考えられます。

要約すると、提示された結果は、S palm B rec 14の精製におけるGST hiss精製の効率性を実証しています。このビデオを視聴することで、高度に精製された組換えタンパク質を回収する方法について十分に理解できたはずです。一度習得すれば、活用できるでしょう。

この手法は、適切に実施すれば、可溶性ly acidの変性後12時間以内に完了させることができます。本手順を行う際は、タンパク質の分解を防ぐため、迅速に、かつ厳格に4 °Cで作業することが重要です。本手順に続き、タンパク質パートナーの同定や標的タンパク質の翻訳後修飾などの追加的な疑問を解決するために、共沈降アッセイや質量分析などの他の手法を実施することができます。

本手法ではDNA修復タンパク質を用いていますが、この戦略を修正することで、他の研究分野におけるタンパク質の機能を解析することが可能です。