GST-Hisの精製：全長精製タンパク質を降伏二段階アフィニティー精製プロトコル
2013年10月29日
本プロトコルでは、一意に切断可能なGST-タグおよび小Hisタグを組み合わせることにより組換えタンパク質の精製を可能にする非常に効率的で費用対効果の高い小規模タンパク質精製方法を実証する。
次の実験の全体的な目標は、高度に精製された目的の全長タンパク質を取得することです。これは、組換えバオウイルスを作製し、SF 9昆虫細胞に感染させて、目的のタンパク質の高発現で可溶性の2つのタグ付きバージョンを得ることによって達成されます。次に、グルタチオン、セロスタグ付きタンパク質の精製、続いて金属アフィニティークロマトグラフィーの精製を特徴とする2段階のアフィニティー精製が行われます。
精製の結果、高純度のヒスチジンタグ付きタンパク質が得られます。次に、精製したタンパク質サンプルを透析して、保存バッファー中の低塩濃度を保証します。SDSページゲルの全タンパク質染色に基づいて、タンパク質の発現溶解度、量、および品質を示す結果が得られます。
この方法を思いついたのは、PAL B 2やBOC 2などの大きくて不安定なタンパク質の精製に苦労したときでした。したがって、この技術がワンステップアフィニティー精製のような既存の方法よりも優れているのは、当社のツーステップアフィニティー精製プロトコルでは、得られるタンパク質の純度が高く、一般的に分解生成物がないことです。この方法は、精製された組換えタンパク質の生化学的機能など、タンパク質生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。
このプロトコルは、組換えバオウイルスの産生から始まり、続いて、感染のテキストプロトコールに記載されている最も効率的なBAウイルスを選択します。500ミリリットルの培地中に10〜6個のSFナイン細胞を0.75〜1.0倍、ウイルスと培地との間に1〜150の比率で含有するスピナー培養容器を調製する。スピナーを細胞培養フードの下に置き、スピナーの片方のアームを通じて必要な量のバウラウイルス懸濁液を細胞懸濁液に加えることにより、細胞を感染させます。
感染した細胞を摂氏27度の懸濁液で増殖させ、最も効率的な黄斑ウイルスを選択する際に決定される最大タンパク質発現に達したときに細胞を採取します。細胞を回収した後、目的のタンパク質を発現するSF9個の細胞を約20ミリリットルのGST結合緩衝液で溶解し、氷水浴中でプロテアーゼ阻害剤を補充します。ダウンホモジナイザーで溶液を20回ダウンさせ、次に3回の32サイクルで超音波処理してから再び20回踊る前に、細胞溶解物を18,000RPMで摂氏4度で30分間遠心分離し、上清を保ちます予備洗浄されたGSTビーズ1ミリリットルで可溶性細胞溶解物をインキュベートします穏やかな回転の下で摂氏4度で1時間。
インキュベーション時間は、プロと結合後の結合効率の安定性に応じて最適化する必要があります。700 RPMで素早く回転し、未結合タンパク質を含む上清を除去します。GST結合タンパク質をGST洗浄バッファーで洗浄します。
最後の洗浄後、このプロセスを2回繰り返します。上清をできるだけ取り除きます。次に、ビーズを5ミリモルのA TPと15ミリモルの塩化マグネシウムと10ミリリットルのGST結合バッファーに4°Cで1時間インキュベートし、インキュベーション後のヒートショックタンパク質の非特異的結合を回避します。
ビーズをGST洗浄バッファーで3回洗浄します。GSTビーズを遠心分離し、上清を取り除いた後、GSTビーズをP fiveバッファーで洗浄します。次に、GSTビーズ、100マイクロリットルの違反分を分割し、100マイクロリットルのP 5バッファーで希釈した精密酵素を4〜8単位加えます。
GSTビーズを酵素と3時間から一晩、摂氏4度で穏やかに回転させてインキュベートします。インキュベーション時間は、分子量と切断後のタンパク質の安定性に応じて最適化する必要があります。クイックスピンして上澄み物を集めます。
ビーズに100マイクロリットルのP fiveバッファーを追加します。次に、繰り返し、スピンし、上清を2回収集します。すべての分数を引っ張ります。
EITを1ミリリットルの3つの画分に分割し、それぞれを100マイクロリットルの洗浄済みタロン金属アフィニティー樹脂ドライビーズと回転させて1時間インキュベートし、溶出をいくつかの画分に分割し、結合と洗浄の効率を高めます。次に、樹脂をP 30バッファーで摂氏4度で5分間、穏やかに回転させて洗浄します。洗浄を2回繰り返した後、ビーズを1本のチューブに引っ張って精製タンパク質を溶出します。
P 500バッファーをタンパク質結合タロン樹脂に添加します。バッファーとビーズの比率を 1 対 1 のボリュームで追加します。容積。懸濁液を回転させて5分間インキュベートします。
この手順を 2 回繰り返します。精製されたタンパク質を保存するために、逃れた各画分を別々に保ちます。攪拌下で、適切な保存緩衝液に対してタンパク質を摂氏4度で1時間2回透析します。
透析中に精製されたタンパク質の沈殿を確認することが重要です。精製したタンパク質の小さなアリコートを作り、ドライアイスで30分間凍結します。アリコートは摂氏マイナス80度で保管し、多くの解凍凍結サイクルを避けてください。
各画分の約20〜40マイクロリットルをSDSページゲルにロードすることにより、精製プロセスを分析します。ゲル染色液をクマシブルー染色またはタンパク質染色液で可視化した後、REC 14組換えバロウイルスに感染したSF9細胞または対照としてモック感染したSF9細胞の可溶性および全細胞溶解物をクマシブルー染色で解析し、精製過程でのGST re 14 hisタンパク質の発現を確認することができました。kumasi Blueによるこれらのサンプルの分析法分析の効率を追跡するために、多くのサンプルを分析しました。
染色は、精製の最初のステップで、G-S-T-G-S-Tによる精密切断後のrec 14とGSTの融合により、GST Rec 14が見かけの分子量約50キロダルトンのGSTビーズに正しく結合したことを示しています。切断されたGSTはGSTビーズ上で視覚化できますが、GSTを含まないREC 14の一部はまだGSTビーズに結合したままであるにもかかわらず、REC 14ヒスの顕著な濃縮が達成されました。このステップは、TALONビーズに結合したREC 14 hissの精密プロテアーゼ分析により、GST精製ステップでREC 14 hissの大部分がTalonビーズに結合していることが示された後に言及されたタンパク質と比較して、タンパク質のインキュベーション時間を長くすることで改善できます。
数回の洗浄後、REC 14のヒスノイズを逃れて回収し、3回の錯覚を行いました。分析の結果、エルシアンが錯覚の効率を示した後、逃れたフラクションとタロンビーズの最初のエルシアンの比較で、rec 14ヒスの高純度とrec 14ヒスの濃度が明らかになりました。rec 14のヒスノイズはほとんどないので、ビーズに結合していると検出できます。
これらのサンプルは、REC 14に従うために、抗GST抗体および抗HIS抗体を用いたウェスタン血液分析にも供されました。手順全体を通して、抗GSTブロットは、GST精製ステップから言及されたタンパク質にGS TRE 14およびGSTのみが存在し、汚染物質がヒスタグアフィニティー精製ステップによって除去されたことを示しています。このブロットは、精密処理とヒスタグ精製ステップにより、GSTがre14から効率的に除去されたことを示しています。
抗ヒスブロットは、re 14を検出することを目的としています。このブロットは、GST Rec 14 ヒスと REC 14 ヒスが完全に切断されず、GST ビーズから除去されなかったことを裏付けています。また、高濃度ではREC14が凝集しているように見える。
要約すると、提示された結果は、S palm B rec 14の精製に対するGSTヒス精製の効率を示しています。このビデオを見た後、あなたは非常に美しくなったエネルギーを回復する方法をよく理解しているはずです。組換えタンパク質を一度習得したら。
この技術は、適切に実行されれば、可溶性ly酸の変性後12時間で行うことができます。この手順を試行している間は、この手順に続いてタンパク質の分解を避けるために、摂氏4度で迅速かつ厳密に作業することを覚えておくことが重要です。コード沈殿アッセイや質量分析などの他の方法を実行して、タンパク質パートナーの同定や目的のタンパク質の翻訳後修飾などの追加の質問に答えることができます。
この方法をDNAに使用していますが、他の研究分野でタンパク質の機能を研究するために、修復タンパク質を戦略に合わせて変更することができます。
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概要
このプロトコルは、cleavable GST-tagとHis-tagを使用した小規模なタンパク質精製の費用対効果の高い方法を概説しています。この手法により、組換えタンパク質の効率的な分離が可能となり、高い純度と溶解性を確保します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- タンパク質精製
- 組換えタンパク質発現
- アフィニティクロマトグラフィー
背景
- 組換えタンパク質は様々な生化学的研究に不可欠です。
- 従来の精製方法は高コストで時間がかかる可能性があります。
- タグの組み合わせにより精製効率を向上させることができます。
- 昆虫細胞は高レベルのタンパク質発現によく使用されます。
研究の目的
- 高効率のタンパク質精製プロトコルを確立すること。
- 目的のタンパク質の完全な形態を可溶性の形で生産すること。
- 精製されたタンパク質の品質と量を評価すること。
使用された方法
- タンパク質発現のための組換えbaoウイルスの生産。
- タグ付きタンパク質を生産するためのSF9昆虫細胞への感染。
- グルタチオンと金属アフィニティクロマトグラフィーを使用した2段階のアフィニティ精製。
- 塩濃度を低下させるための精製されたタンパク質サンプルの透析。
主な結果
- 高純度のヒスチジンタグ付きタンパク質の成功した精製。
- SDS-PAGEによるタンパク質発現、溶解性、品質の評価。
- 精製方法の効率性の実証。
- 結果は、タンパク質研究におけるより広範な応用のための方法の可能性を示しています。
結論
- 開発されたプロトコルはタンパク質精製に効率的で費用対効果が高いです。
- GSTとHisタグの組み合わせにより精製結果が向上します。
- この方法は研究における様々な組換えタンパク質に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Protein purification remains a critical bottleneck in early-stage target validation, where obtaining full-length, highly pure recombinant proteins is essential for reliable biochemical and functional assays. The GST-His two-step affinity method addresses this challenge by combining orthogonal tags to enrich intact protein species and remove degradation products, thereby improving data quality in downstream screening and mechanistic studies. This approach supports predictive confidence in target validation by reducing false negatives caused by impure or truncated protein preparations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses using full-length proteins, reducing mechanistic ambiguity from proteolytic fragments.
- Operational Value: Provides a cost-effective, small-scale purification workflow compatible with baculovirus expression in insect cells.
- Predictive Value: Increases confidence in assay results by enriching for intact protein species, supporting reliable target engagement and enzymatic readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers highly purified protein suitable for quantitative enzymatic assays and binding studies.
- Operational Value: Eliminates need for expensive FPLC systems, enabling scalable implementation in academic and industrial labs.
- Reproducibility: Dual-tag strategy and cleavage step reduce batch variability from degraded protein contaminants.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Purified full-length proteins support preclinical functional validation and biomarker assay development.
- Mechanistic De-risking: Removal of GST tag after initial purification minimizes potential tag-induced artifacts in functional studies.
- Nucleic Acid & HSP Removal: ATP/MgCl2 washes and nuclease treatment reduce common contaminants that interfere with downstream applications.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from recombinant protein expression to assay-ready protein supply, enabling reliable transition from target hit confirmation to lead characterization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing soluble, full-length protein for enzymatic and interaction assays.
- Screening: Produces assay-ready protein with high purity and low salt content after dialysis, suitable for high-concentration screening formats.
- Analytics: Enables clear SDS-PAGE and Western blot analysis to confirm purity, cleavage efficiency, and absence of degradation products.
- Translational Research: Purified protein can be used in preclinical models to validate target function and mechanism of action.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable across multiple recombinant proteins, reducing re-optimization effort in protein production pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Full-length protein enrichment improves target validation reliability and reduces false structure-activity relationships.
- Operational Value: Two-step affinity purification increases yield of pure protein while minimizing reagent waste and instrument dependency.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions by providing clean biochemical data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Reduces late-stage attrition risk by improving target confidence through rigorous protein quality control.
Implementation Considerations
- Requires expertise in baculovirus production and insect cell culture for recombinant protein expression.
- Dependent on access to glutathione and nickel-affinity resins, protease cleavage enzymes, and standard chromatography equipment.
- Needs standardization of cleavage efficiency and wash conditions across protein targets to ensure consistent tag removal.
- Adaptation may be needed for proteins sensitive to GST tag presence or cleavage conditions.
- Practical limitations include potential incomplete cleavage and residual tag presence, requiring validation via Western blot for each target.
