Name: GST-Hisの精製：全長精製タンパク質を降伏二段階アフィニティー精製プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学ぶ、GST-Hisタグを用いた二段階アフィニティー精製法で、昆虫細胞で発現した全長組換えタンパク質を高純度に精製する手法です。SDS-PAGEで品質を確認し、生化学研究に応用できます。

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我々は法の開発につながる議論アンヌ=マリー·ディオン·コートに感謝します。 JKとRBはFQNRT博士学者、M.-MGはバニエCIHR学者であり、J.-YMはFRSQ上級研究員である。この作品は、自然科学と工学研究評議会からJYへの資金によってサポートされていました。 M.

1。組換えバキュロウイルスの作製バキュロウイルスは、主に、わずかな修正を加えた製造業者のプロトコルに従って、Invitrogen社のBac-to-Bacバキュロウイルス発現系を用いて生成されます。 <ol><li>修正するpFastBac1ベクター（Gibco社、生命）は、GSTおよびHis-タグ（ 図2）を含む作成されました。をpET-52bの（+）ベクター（Novagen）のマルチクローニングサイト（MCS）は、10xHisタグを含有するpFastBac1-ストレプト-10xHisを生成するようにするpFastBac1ベクターのMCSに挿入した。をpET-52bの（+）MCS配列が5 &#39;端および3にHindIII制限部位&#39;端におけるBglII制限部位を付加する、XbaIおよびBlpIを制限部位の間に増幅されたPCRであった。 PCR産物は、次いで、BamHIおよびBglII制限配列の相溶性を使用して、pFastBac1のBamHIおよびHindIIIの制限部位間にクローニングした。目的は、の発現を可能にするpFastBac1を生成することであったのでストレプトアビジンと10xHisタグを用いる組換えタンパク質、ペット-52B（+）のBamHI制限部位がMCSの配列が使用されませんでした。また、XbaI制限部位が既にするpFastBac1のMCSとをpET-52bのMCSに挿入し、これらの（+）内のサイト間で生じる制限部位の重複を避けるために使用されなかった。プレシジョンプロテアーゼ認識部位（LeuGluValLeuPheGln / GlyPro）とのGSTコード配列を、次いで、pFastBac1の - ストレプトマイシン-10xHisに挿入した。をpGEX-6P-2（GEヘルスケア）からGST cDNA配列は、PCR、それぞれ5にNcoIおよびKpnI制限部位を含むプライマー &#39;および3&#39;の末端を増幅した。 NcoI部位は、開始コドンの追加だけでなく、GSTにアラニンを可能にします。 PCR産物を、次いで、ストレプトアビジン-タグの欠失をもたらす、NcoIおよびKpnI制限部位の間にpFastBac1の - ストレプトマイシン-10xHisにクローニングした。このようにして得られた新たな融合ベクターは、pFastBac1の-GST-10xHis命名された。 </li><li> PRをコードするcDNAクローンを作成GST（N末端）およびHisタグ（C末端）の間をpFastBac-GST-10xHisベクターへの関心のotein。 C末端Hisタグとの融合を可能にするためのcDNAの終止コドンを除去するように注意してください。 </li><li> Eを変換（ステップ1.2）で得られた組換えたpFastBacとの大腸菌 DH10Bacコンピバクミドを生成する。コロニーがBluo-galおよびIPTG（10μg/ mlのテトラサイクリン、50μg/ mlのカナマイシン、7μg/ mlのゲンタマイシン、100μg/ mlのBluoを含有選択プレート上で30℃、37℃、数時間で一晩成長させるギャル、40μg/ mlのIPTG）。 </li><li>白の表現型を確認するために、選択プレート上で（ステップ1.3から）2個の白色コロニーを選択し、restreak。 </li><li>ステップ1.4から2白いコロニーをLBの2ミリリットル10μg/ mlのテトラサイクリンを含む、50μg/ mlのカナマイシン、10μg/ mlのゲンタマイシンを接種し、それらを37℃で撹拌（250回転）の下で一晩増殖させ</li><li>バクミドDNAを精製するために、ステップ1.5からの細菌をペレット溶液を300μlの私は細胞を再懸濁し、溶液IIを300μl（キアゲンからマキシプレップキット）を追加します。 、室温で5分間インキュベートし、3MのKOAcのpH 5.5を300μlを加え、氷上で10分間インキュベートする。 4°C、10分間最大速度でサンプルを遠心分離する。上清にイソプロパノールを800μl加え、氷上で10分間インキュベートする。 4℃で15分間サンプルを遠心分離し、70％エタノール500μlでペレットを洗浄する。ペレットを乾燥させトリス-EDTA pH8.0の40μlの滅菌条件下でそれを懸濁します。バクミドDNAは、4℃で保存する必要があります</li><li>製造業者のプロトコルに記載のようにバキュロウイルスを生成する。バキュロウイルスは、光から保護して4℃で保存することができる。 </li></ol> 2。組換えタンパク質発現<ol><li>精製のための最も効率的なバキュロウイルスを選択すると、タンパク質発現のピークに到達する何時監視するために、ミニ感染アッセイaを実行するSは、以下のとおりのSf9の2×10 7に感染バキュロウイルスの133μL（1/150）と（10％FBSおよび1％P / Sで補完）グレースメディアに27℃で培養した細胞を感染させた。 0、24、48で1.5ミリリットルのアリコートを収集し、72時間後に感染。細胞をペレット化し、抗タグ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより目的のタンパク質の発現レベルを分析する。 </li><li>ウイルスとメディアの間で1/150の割合で、メディアの500ミリリットル1ml当たり1.0×10 6 Sf9細胞を含むスピナーを感染させるためにステップ2.1から最も効率的なバキュロウイルスを使用してください。感染細胞は27℃で、懸濁液中で増殖し、最大のタンパク質発現（上記ステップ2.1で決定される）に達したときに細胞を回収しましょう​​。ペレット化した細胞は、さらに使用するまで-80℃で保存することができる。 </li></ol> 3。可溶性細胞溶解物の調製以下のインキュベーションステップは全て、軽度の回転下で4℃で行われる。 <ol><li>溶解SGST結合バッファー（150mMのNaCl、1mMのEDTA、0.05％トリトン-X-100、1mMの250mMのNaClの終濃度についてのPBS1XでDTT、およびプロテアーゼ阻害剤の約20 mlの目的タンパク質を発現するF9細胞カクテル（Roche）を氷水浴中で、ダウンスホモジナイザーでソリューション20Xをダウンス、超音波処理3X 30秒ごと（70％出力）し、再び20Xをダウンス。 </li><li> （省略可能）。 1mMのMgCl 2を有する全細胞溶解物をインキュベートし、DNAまたはRNAの混入を除去するために4℃で30分間7ヌクレアーゼ（2.5 U / ml）をベンゾナーゼ。 </li><li> 4℃で30分間18,000 rpmで遠心分離上清を保管してください。 </li><li> （省略可能）。遠心分離機明確な可溶性溶解を得るために4℃、18,000 rpmで30分間、再び上清。目詰まりを回避するために、0.2または0.45μmのフィルターで上澄みを渡します。 </li></ol> 4。 GSTビーズ上のタンパク質の結合<ol><li> GSTビーズを1mlの可溶性細胞溶解物をインキュベートする（で2回予備洗浄GST 10mlを穏やかに回転させながら4℃で1時間、緩衝液）に結合する。 </li></ol> コメント：インキュベーション時間は、タンパク質の安定性及び結合効率に応じて最適化する必要がある。 <ol start="2"><li>クイック700 rpmでスピンし、非結合タンパク質を含む上清を除去し（これは、さらなる分析のために保持することができる）。 GST洗浄緩衝液（350mMのNaClを有する最終的なGST結合緩衝液）を用いてGST-結合タンパク質（ 図3B、レーン1）洗浄する。 </li><li>手順を繰り返し4.2倍。最後の洗浄では、できるだけ多くの上清を除去します。 </li><li>熱ショックタンパク質8の非特異的結合を回避するために、4℃で1時間（10ミリリットルGST結合緩衝液中）、5mMのATPおよび15mMのMgCl 2を有するビーズをインキュベートする。 GST洗浄バッファーでビーズを3回洗浄します。 </li></ol> 5。 GSTのプレシジョン切断<ol><li> GSTビーズを遠心し、上清を除去し、P5のBUFとのGSTビーズを洗浄FER（50mMのpH7.0でのNaHPO 4、500mMのNaCl、10％グリセロール、0.05％トリトン-X-100、5mMイミダゾール）。 </li><li> 4℃で一晩に3時間からP5バッファにプレシジョン酵素で、GST-ビーズをインキュベート（100μLの分画に、GSTビーズを分割し、P5の緩衝液100μlに希釈した酵素の4-8単位（2-4μl）を追加します）。 </li></ol> コメント：プレシジョン工程のインキュベーション時間は、分子量ならびにタンパク質の安定性に応じて最適化する必要がある。分解が観察される場合には、このインキュベーション時間は一晩、2時間の最小値の代わりにまで減少させることができる。 <ol start="3"><li>クイックスピンし、上清を集める。 P5の100μlのを追加した後、この手順を2回繰り返す ビーズにバッファリングし、全ての画分（ 図3B、レーン2）プール。 </li></ol> コメント：残りのビーズは切断効率の分析のために使用することができる（ 図3B </strongの&gt;、レーン3）。通常、タンパク質の70〜80％が切断される。 6。タンパク質結合TALON金属アフィニティー樹脂に<ol><li> 1ミリリットルの3画分に、上からの溶出を分割し、回転下で1時間、100μlのタロン金属アフィニティー樹脂乾燥ビーズ（P5緩衝液で2回予洗）と、それぞれインキュベートする。 </li></ol> コメント：いくつかの画分に溶出を割ると、結合/洗浄の効率を向上させます。 <ol start="2"><li> P30バッファー（30 mMイミダゾールの最終濃度でP5バッファー）で樹脂5分を洗ってください。 </li><li>ステップ6.2倍を繰り返して、単一のチューブ内でビーズをプールする。最後の洗浄の前に、できるだけ多くの上清を除去します。 </li></ol> コメント：これはTALONバインドのサンプル（ 図3B、レーン4）に対応している。 7。精製タンパク質の溶出<ol><li> P5で回転下で5分間蛋白結合するTALON樹脂をインキュベート00緩衝液（500 mMイミダゾールの最終濃度を有するバッファーP5）。バッファ1:1 V / Vのビーズとの比率を使用してください（あなたは乾燥ビーズを200μlを取っていた場合、あなたはP500を200μlを追加する必要があります）。 2回にこの手順を繰り返し、別々にそれぞれの溶出画分を保つ（; 図3B、レーン5-7という名前の溶出1（E1）、溶出2（E2）および溶出3（E3））。 </li></ol> コメント：残りのビーズを溶出効率（ 図3B、レーン8）の分析のために使用することができる。典型的に、タンパク質の60〜80％が合計で溶出する。 <ol start="2"><li>クマシーブルー（ 図3B）、または可視化のためのSYPROタンパク質染色でSDS-PAGEおよび染色の標準BSA濃度で各分画の約20〜40μLをロードすることによって、あなたの精製タンパク質の量と質を分析します。 </li></ol> コメント：目的のタンパク質もthroを検出することが可能抗GSTおよび抗His抗体（ 図3C）を使用して精製操作ughout。 8。精製タンパク質の貯蔵<ol><li> 4℃で、適切な保存緩衝液に対して精製タンパク質（ 例えば、20mMトリス酢酸塩pH8.0で、200mMののKAc、10％グリセロール、1mMのEDTA、0.5mMのDTT）で透析これは、透析中に精製されたタンパク質の沈殿のために確認することが重要です。私たちは通常、攪拌回転下で4℃で1時間、2X透析。 </li><li>精製したタンパク質（10-20μL）の小分けを作り、30分間ドライアイス上で凍結する。 -80℃で一定分量を保存し、多くの融解/凍結サイクルを避ける。 </li></ol>

<ol><li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li>
<li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li>
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</ol>

ここで紹介する、GST-Hisの精製プロトコルは、組換えタンパク質の大きさの広い範囲の精製に適している：我々は成功して李 RAD51（41kDa）、piBRCA2（120kDa）、PALB2（130kDa）、および不安定な高分子量のタンパク質の精製リーシュマニア幼児 ： 李 BRCA2（125kDa）6,9。また、このプロトコルを使用して精製したタンパク質は、6生化学的に活性であった。この方法の成功は、単に所望のタンパク質の発現、溶解度および安定性に依存する。 例えば大腸菌のような他のホストでの発現のための分子生物学的ベクトル、 大腸菌や酵母は、簡単に、広く利用可能な、GSTやHisタグを使用して変更できます。これは、ほとんどの分子生物学の実験室のための本技術の適用可能性と費用対効果を強調しています。様々な利点がrecombinan細菌または哺乳動物細胞上で、感染した細胞を選択する我々の決定に影響を与えたトンタンパク質の発現および精製。例えば、このよ...

組換えタンパク質の精製は、生化学の基本的な質問に対処することが重要である。イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ​​排除クロマトグラフィーのようなタンパク質精製の従来の方法は、それぞれ、例えば、その等電点、電荷またはサイズなどの標的タンパク質の物理的性質に依存する。後者のタンパク質特性が大幅に従来のタンパク質精製方法でタンパク質を汚染する可能性を増大させる種々のタンパク質が共有されています。この問題は、時間がかかり、複数の精製カラムの使用により回避することができる。同時に、後者のクロマトグラフィー法は、高価な実験装置を要求する。ほとんどの場合、タグは、目的のタンパク質に固有であるように、アフィニティータグ精製が強く、標的特異性を増加させる。最近の研究では、違反またはHA-アフィニティー精製が広く用いられている。 既存rec視聴とは対照的に単一のタグが使用されるombinantタンパク質精製プロトコルは、2つのタグのユニークな組み合わせを確立した。我々の方法は、所望のタンパク質の量と純度との間の最適な比率のために、目的のタンパク質のC末端にN-末端およびHisタグにおけるGST-タグの融合を含む。 GSTはグルタチオンセファロースビーズでの精製のための非常に効率的で、長いタグ（29 kDa）の、ある。さらに、GSTを使用すると、本手法1の費用対効果を保証します。 （わずか2つのアミノ酸の付加、その結果、認識配列LeuGluValLeuPheGln / GlyProで）プレシジョン酵素GSTを切断する可能性は多くの利点を有し、例えば、この戦略は、アロステリック障害のために、生理学的タンパク質の機能の変化を回避する。他のタンパク質に融合した小端Hisタグは、切断されたGSTを洗い流し、ならびにタンパク質および他の分解によるタンパク質の純度を高めるために第二の精製工程において機能する<html>汚染物質。彼の精製工程カラム（TALON樹脂）にGSTの切り替えとさらに、プロトコルは、透析工程を必要としない。このような精製プロセスにおける一般的な汚染物質は、熱ショックタンパク質（HSP）である。 MgCl 2およびATPとのインキュベーション工程の追加は、これらの汚染物質を除去する（ 図1）を可能にする。 高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）、および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、関心対象の精製されたタンパク質を高収率で生成するために高価な器具類に依存する一般的な技術である。我々はここで紹介するバッチ精製プロトコールは、対照的に、手動で、高価な楽器のセットアップを必要としません。タンパク質の高収量は、プロトコルをスケールアップして行くことができます。これと同時に、バッチ精製プロトコルで、溶出体積はFPLCまたはHPLCで指定されていないタンパク質濃度を向上させるために調整することができる。 ntent &quot;&gt;また、バッ​​チGST-Hisの精製プロトコルで、〜10〜300 kDaの範囲のサイズを有するタンパク質を精製することができる。最大の利点の一つは、一つは、同時にいくつかのタンパク質を精製することができるという事実によって与えられる。例えば、野生型及びその変異タンパク質の両方が提示されたプロトコルの成功は、単独で目的のタンパク質の発現レベルおよび溶解度に依存する。

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</strong</td></tr><tr><td>>E.Coli DH10Bac (competent)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxi Prep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Solution I and II</td></tr><tr><td>Ultra Pure Bluo-Gal</td><td>Gibco (Life)</td><td>15519028</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gibco (Life)</td><td>15529019</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 感染細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>PreScission enzyme</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Grace's infected medium supplemented</td><td>Gibco (Life)</td><td>11605-094</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum Characterized</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td><td>Gibco(生命)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>グルタチオンセファロース樹脂</td><td>GEバイオサイエンス</td><td>17075605</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>ロシュ</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>タロン樹脂</td><td>クロンテック</td><td>635504</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>バイオショップ</td><td>288324</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>ギブコ(生命)</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>ポリクローナルGST抗体</td><td>自社</td><td></td><td></td>生産</tr><tr><td>モノクローナル6X-His抗体</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Dounce ホモジナイザー (タイト)</td><td>ウィートン</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>ソニケーター (フィッシャー ディスメンブレーター)</td><td>フィッシャー</td><td>モデル 150</td><td></td></tr><tr><td>透析バッグ (50 mm)</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td></td><td></td>2115217</tr></tbody></table>

gst-hisの精製：全長精製タンパク質を降伏二段階アフィニティー精製プロトコル

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

インビトロにおけるタンパク質の生化学的特徴付けのための酵素学における重要なアッセイは、関心対象の精製されたタンパク質の高濃度を必要とする。タンパク質精製プロトコルは、効率性、単純性、および費用対効果1を結合する必要があります。ここでは、N-末端グルタチオンセファロースタグ（GST）2,3両融合されるC-末端10xHisタグ4に基づいて、組換えタンパク質のための新たな小規模アフィニティー精製システムとしてGST-Hisの方法を記載目的のタンパク質に。後者の構築物は、タンパク質発現のために5感染したSf9細胞の感染のために、バキュロウイルスを生成するために使用される。 GSTは、浄化効率を確保するのに役立つかなり長いタグ（29 kDa）のである。しかしながら、タンパク質の生理学的特性に影響を与えるかもしれない。従って、それは、その後、プレシジョン酵素6を用いてタンパク質から切断される。最大の純度を保証し、切断されたGSTを除去するために、我々比較的小さいHisタグに基づいて、第二のアフィニティー精製工程を追加した。重要なことには、我々の技術が劣化したタンパク質を除去し、従って、完全長タンパク質を豊かにするための効率的なツールであるタンパク質の両端に隣接する2つの異なるタグに基づいている。ここで紹介する方法は、FPLC等の高価な楽器のセットアップを必要としない。さらに、我々は、夾雑核酸廃止する熱ショックタンパク質不純物およびヌクレアーゼ処理を除去するためにMgCl 2およびATPの洗浄を組み込んだ。要約すると、隣接する2つの異なるタグの組合せN-およびC-末端とタグのいずれかを切断する能力が、興味のある高度に精製された全長タンパク質の回収で評価する。

GST-Hisの精製プロトコールの効率を例証するために、我々はRec14、S.精製 32.9 kDaでpombeのタンパク質。 Rec14 cDNAは、N-およびC-末端GST-およびHis-タグの付加を可能にする我々の修飾するpFastBac1ベクターであった（ 図1A）にクローニングした。組換えバキュロウイルスを調製し、次いで、タンパク質発現のためにSF9に感染した細胞に感染させた。可溶性細胞溶解物をGSTビーズと共にインキュベートし、結合したタンパク質を、PreScissionプロテアーゼとGSTを切断することにより溶出した。得られたRec14は-Hisタンパク質はアフィニティーTALON樹脂上で精製し、結合したタンパク質を500mMのイミダゾールを含むTALON緩衝液で溶出したであった。精製されたRec14-Hisを、記憶バッファに透析し、-80℃（ 図1B）で保存した。 Rec14組換えバキュロウイルス、または対照として偽感染に感染したSF9細胞からの可溶性および全...

本プロトコルでは、一意に切断可能なGST-タグおよび小Hisタグを組み合わせることにより組換えタンパク質の精製を可能にする非常に効率的で費用対効果の高い小規模タンパク質精製方法を実証する。

GST-Hisの精製：全長精製タンパク質を降伏二段階アフィニティー精製プロトコル

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

本実験の総合的な目的は、高度に精製された目的タンパク質のフルレングス体を得ることです。これは、組換えバキュロウイルスを作製し、それを用いてSf9昆虫細胞に感染させることで、2つのタグを付加した目的タンパク質を高発現かつ可溶性の状態で得ることにより達成されます。その後、グルタチオンS-トランスフェラーゼタグ付きタンパク質の精製と、それに続く金属アフィニティークロマトグラフィーによる2段階のアフィニティー精製が行われます。精製の result として、高純度のヒスチジンタグ付きタンパク質が得られます。次に、保存バッファー中の塩濃度を低く抑えるため、精製したタンパク質サンプルを透析します。SDS-PAGEゲルの全タンパク質染色に基づき、タンパク質の発現溶解性、量、および品質に関する結果を得ます。この手法のアイデアは、PAL B twoやBOC twoのような、大きく不安定なタンパク質の精製に困難が生じた際に得られました。したがって、一段階のアフィニティー精製などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、この二段階アフィニティー精製プロトコルを用いることで、得られるタンパク質が非常に高純度であり、一般的に分解産物が含まれていないことです。この方法は、精製された組換えタンパク質の生化学的機能など、タンパク質生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本プロトコルは、組換えbaoウイルスの作製から始まり、次いで、感染のためのテキストプロトコルに記載されている通り、最も効率的なBAウイルスを選別します。500 mLの培地中に0.75～1.0 × 10⁶個のSF9細胞を含むスピナー培養容器を準備し、ウイルスと培地の比率を1:150にします。スピナーを細胞培養フード内に設置し、スピナーのアームの一方から必要量のbaulaウイルス懸濁液を細胞懸濁液に添加して、細胞を感染させます。感染細胞を27 °Cで浮遊培養し、最も効率的なバキュロウイルスを選択した際に決定した最大タンパク質発現量に達した時点で細胞を回収します。細胞回収後、目的タンパク質を発現しているSf9細胞を、プロテアーゼ阻害剤を添加した約20 mLのGST結合バッファーを用い、氷水浴中で溶解します。ホモジナイザーで溶液を20回上下に攪拌し、次に32秒間の超音波処理を3サイクル行い、再度20回上下に攪拌します。次に、細胞溶解液を18,000 RPMで30分間、4 °Cで遠心分離し、上清を回収します。この可溶性細胞溶解液を、あらかじめ洗浄した1 mLのGSTビーズとともに、緩やかな回転条件下で4 °Cにて1時間インキュベートします。インキュベーション時間は、タンパク質の安定性と結合後の結合効率に応じて最適化してください。700 RPMで短時間遠心し、未結合タンパク質を含む上清を除去します。GST結合タンパク質をGST洗浄バッファーで洗浄します。最後の洗浄の後、この工程を2回繰り返します。上清を可能な限り取り除きます。その後、インキュベーション後のヒートショックタンパク質の非特異的結合を避けるため、GST結合バッファー10 mLに5 mM ATPおよび15 mM 塩化マグネシウムを加えた溶液中で、ビーズを4°Cで1時間インキュベートします。GST洗浄バッファーでビーズを3回洗浄します。GSTビーズを遠心分離して上清を除去した後、P five bufferでGSTビーズを洗浄します。次に、GSTビーズを100 µLずつに分注し、100 µLのP five bufferで希釈した4〜8 unitsのprecision enzymeを加えます。GSTビーズと酵素を4°Cで緩やかに回転させながら、3時間から一晩インキュベートします。インキュベーション時間は、切断後のタンパク質の安定性に加えて、その分子量に応じて最適化してください。クイックスピンを行い、上清を回収します。ビーズにP five bufferを100 µL加えます。その後、遠心分離と上清の回収を2回繰り返します。すべての画分を回収してください。EITを1 mLずつの3つの分画に分け、あらかじめ洗浄したtalon metal affinity resin dry beads 100 µLと共に、回転条件下で1時間インキュベートします。溶出液を数分画に分けることで、結合および洗浄効率が向上します。次に、4 °Cで緩やかな回転をかけながら、P 30 bufferを用いて樹脂を5分間洗浄します。この洗浄を2回繰り返した後、ビーズを単一のチューブに回収し、精製タンパク質を溶出させます。タンパク質が結合したTalonレジンにP 500バッファーを加えます。バッファーとビーズの添加比率は、容量比で1:1とします。懸濁液を回転させながら5分間インキュベートします。この手順を2回繰り返します。精製タンパク質を保存するため、溶出した各画分を分けて保持してください。攪拌しながら4 °Cで1時間、適切な保存バッファーを用いてタンパク質の透析を2回行います。透析中に精製タンパク質が沈殿していないか確認することが重要です。精製タンパク質を少量ずつ分注し、ドライアイス上で30分間凍結させます。分注したサンプルは-80°Cで保存し、凍結融解の繰り返しを避けてください。各フラクションを約 20 to 40 µL ずつ SDS-PAGE ゲルにロードし、精製過程を分析します。ゲルの電気泳動後、可視化のためにクマシーブルーまたはタンパク質染色剤で染色します。REC 14 組換えバキュロウイルスに感染させた SF nine 細胞、および対照としての擬似感染細胞から得られた可溶性および全細胞溶解物をクマシーブルーで染色して分析し、精製過程における GST-RE14-His タンパク質の発現を確認しました。本手法の効率を追跡するため、多数のサンプルをクマシーブルーによって分析しました。染色結果から、精製の第一段階においてGST Rec 14がGSTビーズに正しく結合していたことが示されました。GSTとの融合により、見かけの分子量は約50 kilodaltonsでしたが、G-S-T-G-S-Tでの精密切断後は、遊離したrec 14 hissが約37 kilodaltonsに移動しています。切断されたGSTはGSTビーズ上で確認でき、一部の遊離したREC 14が依然としてGSTビーズに結合していましたが、REC 14 hissの顕著な濃縮が達成されました。このステップは、精密プロテアーゼによるタンパク質のインキュベーション時間を延長することで改善可能です。Talonビーズに結合したREC 14 hissの解析結果を、GST精製ステップ後のタンパク質と比較すると、REC 14 hissの大部分がTalonビーズに結合していることが示されています。数回の洗浄後、rec 14 hissを溶出・回収し、3回の溶出操作を行った。分析の結果、rec 14 hissの高純度が確認された。また、溶出画分と溶出後のタロンビーズを比較したところ、1回目の溶出でrec 14 hissが最高濃度で回収されており、ビーズに結合したままのrec 14 hissはほとんど検出されなかったことから、この溶出操作の効率性が示された。これらのサンプルは、REC 14を追跡するために、抗GST抗体および抗His抗体を用いたウェスタンブロット解析にも供されました。手順全体を通して、抗GSTブロットにより、GST精製ステップから得られたタンパク質に一部のGST-REC 14およびGST単体が混在していたこと、そしてHisタグアフィニティ精製ステップによって不純物が除去されたことが示されています。このブロットにより、プレシジョン処理とHisタグ精製ステップによって、REC 14からGSTが効率的に除去されたことが明らかになりました。抗Hisタグブロットは、REC 14を検出することを目的としています。このブロットにより、GST-REC 14-HisおよびREC 14-Hisが完全に切断されず、GSTビーズから除去されなかったことが確認されます。さらに、高濃度ではREC 14が凝集していると考えられます。要約すると、提示された結果は、S palm B rec 14の精製におけるGST hiss精製の効率性を実証しています。このビデオを視聴することで、高度に精製された組換えタンパク質を回収する方法について十分に理解できたはずです。一度習得すれば、活用できるでしょう。この手法は、適切に実施すれば、可溶性ly acidの変性後12時間以内に完了させることができます。本手順を行う際は、タンパク質の分解を防ぐため、迅速に、かつ厳格に4 °Cで作業することが重要です。本手順に続き、タンパク質パートナーの同定や標的タンパク質の翻訳後修飾などの追加的な疑問を解決するために、共沈降アッセイや質量分析などの他の手法を実施することができます。本手法ではDNA修復タンパク質を用いていますが、この戦略を修正することで、他の研究分野におけるタンパク質の機能を解析することが可能です。

gst-his-purification-two-step-affinity-purification-protocol-yielding

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

タンパク質導入は、細胞に生物学的に活性なタンパク質の直接配信を可能にします。このようなDNAトランスフェクションまたはウイルス形質導入などの従来の方法とは対照的に、この非侵襲的なパラダイムは、細胞毒性および永久的な遺伝子修飾による発癌性形質転換のリスクを回避滴定可能な方法で高効率な細胞の操作が可能になります。...

エンジニアリング細胞透過性のタンパク質

ここで、我々は、高活性Hsp104、六量体AAA +タンパク質酵母、タンパク質の分解に結合ATPの加水分解からの精製のためのプロトコルについて説明します。このスキームでは、からアフィニティー精製のためのしたHis6...

Hsp104の精製、タンパク質Disaggregase

小説や高効率二段アフィニティークロマトグラフィーのプロトコルが開発され、詳細に説明されている。方法は2つの固有の親和性を持つ小型の精製タグに基づいており、異なるプロパティを持つ標的タンパク質の広い範囲に適用可能です。...

小型二重特異性アフィニティタグによって容易に直交するタンパク質の精製

我々は、液体処理ロボットを用いた組換えタンパク質のアフィニティータグ精製する方法を説明します。この方法は、一般にハイスループットフォーマットで可溶性Hisタグ融合タンパク質の小スケールの精製にも適用可能である。...

アフィニティータグ組換えタンパク質のハイスループット精製

出典: Becker, B., 他リシン毒素A連鎖(RTA)輸送に必要な細胞成分を特定するための簡易蛍光基レポーターアッセイ。 J. Vis. Exp.

 組換え細菌タンパク質の精製のための親和性クロマトグラフィー技術

このビデオでは、クロストリジウム・ディフィシル菌からヒスチジンタグ付きピロホスホキナーゼ酵素を精製するニッケル親和性クロマトグラフィー技術を実演します。...

ニッケルアフィニティークロマトグラフィーベースのタンパク質精製:細菌細胞溶解物からポリヒスチジンタグ付き組換えタンパク質を精製する技術

ここでは、ラベルフリーの定量的質量分析法を用いたタンパク質相関プロファイリングに続く親和性タンパク質複合体の精製と青ネイティブPAGEによるそれらの分離のためのプロトコルを提示します。この方法は、異なるタンパク質複合体へのインタラクトームを解決するのに便利です。...

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

封入体、ミリグラム単位の微量のタンパク質を生成するための精製からカンピロバクター走 Tlp3 の dCACHE ペリプラズム...

高効率巻き戻しと受容体リガンド結合領域の浄化法

イオン チャネルの浄化はしばしば困難、しかし、一度は、それが悪意のチャネルの構造と機能の生体外で調査。ここでは、式と哺乳類 bestrophin 蛋白質、Ca2...

哺乳類 Bestrophin イオン チャネルの発現と精製

INADタンパク質複合体の組み立て機構に基づいて、このプロトコールでは、内因性 ショウジョウバエ...

内因性 ショウジョウバエ 一過性受容器電位チャネルの精製

この記事では、6X-ヒスチジンタグで標識されたヒト組換えタンパク質であるフラップエンドヌクレアーゼ1(FEN1)のアフィニティー精製の手順について説明します。このプロトコルでは、タグ付きタンパク質の精製に2つの異なる固定化金属イオンカラムを使用します。...

Fast Protein Liquid Chromatographyシステムを用いた6X-Hisタグ付きタンパク質のアフィニティー精製(英語) 

学ぶ、GST-Hisタグを用いた二段階アフィニティー精製法で、昆虫細胞で発現した全長組換えタンパク質を高純度に精製する手法です。SDS-PAGEで品質を確認し、生化学研究に応用できます。

GST-Hisの精製：全長精製タンパク質を降伏二段階アフィニティー精製プロトコル

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