ヒト多能性幹細胞から終脳のグルタミン酸作動性ニューロンの仕様

この手順の全体的な目標は、ヒトの発生中に観察されるものと同様のチェックポイントを通過することにより、ヒト胚性幹細胞またはH ESCから頭側ニューロンを生成することです。これは、まずHSCがHESC培地中の懸濁液中で自発的に分化できるようにし、次にHSCを神経誘導培地に移してより選択的に分化させることによって達成されます。次に、胚体またはPSC凝集体を組織培養処理プレートに付着させ、そこで細胞が増殖して単層に分化します。

中心は、キロメートル細胞と形態学的に類似した神経上皮細胞を形成します。次に、神経上皮細胞を単離し、浮遊培養物に入れてニューロスフェアを形成します。最後に、ニューロスフィアはカバースリップにメッキされ、さらに区別することができます。

最終的には、免疫染色または電気生理学を通じて形成された特定のタイプのニューロンを示す結果を得ることができます。この技術の意味は、患者特異的なニューロンが人工多能性幹細胞からも生成され、作用機序や潜在的な治療法を解明できるため、さまざまな遺伝的遺伝性疾患にまで及びます。しかし、この方法は、多能性幹細胞からの爪頭神経サブタイプの発生に関する洞察を提供することができます。

それはまた、爪頭ニューロンに関連するヒト疾患などの他のシステムに適用することができますヒト多能性幹細胞凝集体を生成するには、マウス胚性線維芽細胞フィーダー上でヒト多能性幹細胞をHESC培地で培養することから始めます基本的なFGFを5〜7日間補給すると、コロニーは大きくなりますが、まだ未分化です。コロニーが50ミリリットルのチューブで正しい段階に達したとき。テキストプロトコルに従って、D-M-E-M-F 12培地でdis baysの1ミリグラムあたり1ミリグラムの溶液を準備します。

細胞から培地を吸引し、D-M-E-M-F 12で一度すすぎます。洗浄液を取り出した後、各ウェルに1ミリリットルのディスベイを加え、摂氏37度で3〜5分間インキュベートします。3分が経過したら、顕微鏡で少し暗く見える丸まったエッジがないか確認します。

必要に応じて、細胞をより長くインキュベートします。細胞の準備ができたら、DASE溶液を取り出し、細胞をD-M-E-M-F 12で一度洗浄してから、洗浄液を1.5ミリリットルのHESC培地に置き換えて細胞を剥離して分解します。10ミリリットルのガラスピペットの先端をセルのウェルの右下壁に向けて配置し、小さな上下の動きでウェルを横切って反対側に移動し、反対方向に戻ります。

すべての細胞が懸濁状態になったら、15ミリリットルのチューブに入れ、200 Gで2分間遠心分離してから、ペレットから培地を取り出します。HESC培地を用いて、細胞をフラスコに移し、培養します。例えば、HSCの6ウェルの細胞には、50ミリリットルのHESCが入ったT 75フラスコを1つ使用します。中程度。

細胞を摂氏37度で12時間インキュベートします。次に、細胞の破片を取り除くために、細胞と培地を50ミリリットルのチューブに移し、細胞を一度洗浄してから、50ミリリットルの新鮮な培地で新しいフラスコに移します。この方法で細胞を5日目まで供給し続けます。

5日目に、細胞をスピンダウンし、新しいT75フラスコに移します。50ミリリットルの神経誘導培地またはNIMを使用して、インキュベーションプレートの後に毎日NIMの半分を交換して2〜3日間インキュベートし、細胞はラミニンまたはFBSのいずれかを使用してプレートにプレートに付着するのを助けます。FBSを使用して、それぞれに細胞を含む1.5ミリリットルの培地を追加します。

プレートを静かに振って凝集体を広げ、細胞が一晩付着するのを待ちます。翌日、摂氏37度になったら、ウェルごとにすべての培地を2ミリリットルのNIMと交換します。インキュベーションの1日または2日後、各凝集体は広がって単層を形成し、数日のうちに、これらの細胞の大部分の中心は形態学的にコルマー細胞と同様に見えます。

14日目から17日目頃には、コルマー細胞がよりコンパクトに見えます。時々、細胞は内部に見える内腔を持つ隆起またはリングを形成します。細胞を単離する前に、EU以外の上皮細胞が存在するかどうかを調べ、ピペットチップを使用して細胞をこすり落とします。

コロニーの中心に見られる神経上皮細胞を単離すること。マイクロピペットと滅菌済みの1ミリリットルフィルター付きピペットを使用して、コロニーの中心に圧力を加えてコロニーが浮き上がるようにします。コロニーの外側部分も分離しないように注意してください。

2プレート分の単離細胞を15ミリリットルのチューブに移し、200Gで2分間遠心します。培地を除去した後、10ミリリットルのNIMを含む非組織培養処理T25フラスコに細胞を移します。B 27を添加して翌日一晩インキュベートすると、細胞は球状の外観を持つはずです。

末梢細胞も単離されることがあり、通常はフラスコの底に付着します。これが発生した場合は、球状細胞を新しいフラスコに移し、付着した細胞を培養物に残します。ニューロスフェアとNIMB 27で1週間懸濁液を投与し、細胞の持久力と増殖を促進します。

環状A MPとインスリン様成長因子1を添加します。週末には、ニューロスフェアには頭側前駆細胞が含まれ、最終分化のためにカバースリップにメッキする準備が整います。24でポリウレタンラミニンコーティングされたカバースリップを準備するために、ウェルプレートは、神経分化におけるラミニンの1ミリリットルあたり20マイクログラムの50マイクロリットルでカバースリップをコーティングするために、摂氏37度でポリウレタンの0.1ミリグラムあたり1ミリリットルの溶液でクリーンなカバースリップをコーティングすることから始まります。

各ポリウレタン処理されたカバースリップにミディアム。液体がカバー自体に触れないように注意してください。摂氏37度で1〜2時間インキュベートします。

ラミニンインキュベーション後、D-M-E-M-F 12でニューロスフェアを収集して洗浄します。細胞が大きすぎて適切に付着しない場合は、約2ミリリットルのアキュテインを加え、細胞を摂氏37度で3分間インキュベートします。次に、等量のトリプシン阻害剤を添加し、遠心融合後、細胞を200 Gで3分間遠心融合した後、溶液をNDMに置き換え、P 200を使用して細胞を小さなクラスターに分割します。

それらをプレコートされたカバースリップに置き、培地の大部分を吸引し、数滴の培地で細胞を6センチメートルのペトリ皿に移すと、プレコートされたカバースリップからラミニンを除去せずに選択が容易になります。それぞれに約4〜5個のニューロスフェアを移します。ニューロスフィアを少なくとも2〜4時間接着させてから、B 27サイクリックを添加した0.5ミリリットルの神経分化培地を追加します。.

MPと神経栄養因子は、1日おきに媒体の半分を置き換えます。細胞は、ここに示すように数ヶ月間維持することができます。このプロトコルでは、いくつかの重要なステップを通じて、ヒトPSCを爪頭グルタミン酸作動性ニューロンに区別する方法を説明しています。

PSCの形成は、神経上皮細胞の誘導、爪頭前駆細胞の生成、およびこれらの前駆細胞の爪頭ニューロンへの最終分化を凝集させます。このシステムは堅牢で、例えば、頭蓋ニューロン、前駆細胞、グルタミン酸作動性ニューロンの生成に効果的です。化因子を添加しない場合、HSCは神経系統に分化し、分化後24日で分化しました。

神経前駆体の大部分は、セファロンによって発現されるFox G one, A転写因子に対して陽性であったが、後脳および脊髄細胞のHOKs B four, Aマーカーに対して陰性であったことから、テロンセファリック前駆細胞が成功裏に生成されたことが示唆された。これらのテロン頭側祖先は、PAC sixの発現で示されるように背側表現型を持っています。背側前駆細胞によって発現されるマーカーですが、NK X 2.1 腹側前駆細胞のマーカーではありません。

さらなる分化に続いて、これらの頭側背側前駆細胞はグルタミン酸作動性ニューロンに分化し、グルタミン酸作動性マーカーに陽性でした。TBR 1 TBR 1 に対して陽性を維持したニューロンは、ニューロンマーカー β 3 チューブリンまたはマップ 2 でも陽性でした。これらの細胞は、成熟グルタミン酸作動性ニューロンのマーカーである小胞性グルタミン酸トランスポーター1またはVglut Oneも発現し、培養物中の爪頭型グルタミン酸作動性ニューロンの効率的な生成を示唆しています。

この手順に続いて、これらのニューロンが他の細胞とシナプス結合をすることができるかどうかなどの追加の質問に答えるために、電気生理学のような他の方法を実行することができます。このビデオを見た後、あなたはよく理解しているはずです。それは、いくつかの重要なステップを通じて、ヒト多能性幹細胞を分化し、頭側グルタミン酸作動性ニューロンに分化する必要がありました。

多能性幹細胞の形成は、神経上皮細胞の誘導、頭側前駆細胞の生成、およびこれらの前駆細胞の頭側ニューロンへの最終分化を凝集させます。