Name: ヒト多能性幹細胞から終脳のグルタミン酸作動性ニューロンの仕様 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学ぶヒト多能性幹細胞から終脳グルタミン酸作動性ニューロンへの分化プロトコル。神経誘導培地を用いた選択的分化とニューロスフェア形成により、発達生物学の知見を得る方法を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者が惜しみなくFOXG1抗体を提供するための博士Y.笹井に感謝したいと思います。この作品は、コネチカット幹細胞研究助成金（08-SCB-UCHC- 022と11-SCB24）と痙性対麻痺財団によってサポートされていました。

1。ヒト多能性幹細胞凝集体の生成（D1〜D4） <ol><li>ヒト多能性幹細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF、4 ng / mlで）を補充したhESC媒体の存在下でマウス胚線維芽細胞（MEF）フィーダー上で培養される。文化の中で5から7日後、コロニーが大きいが、それでも未分化である場合、それらは、次のステップのための準備が整いました。 </li><li>酵素液が最初に用意されるべきである。 50 mlチューブで、DMEM/F12培地に1 mg / mlの濃度でディスパーゼ（またはコラゲナーゼ）を溶かす。温めたときにこれらのソリューションは、最高のミックスなので、10〜15分間37℃の水浴中に培地と酵素を含むチューブを配置し、Steriflipフィルタを使用して、それを殺菌する。 </li><li>細胞から培地を吸引、DMEM/F12でそれらをすすぎ、そして同様に、このオフを吸引除去する。ヒトES細胞のための3-5分（性IPSCの場合は最大10分）のためのインキュベーター内で各ウェル場所にディスパーゼの1ミリリットルを追加します。顕微鏡下で細胞を見て、時エッジが少し丸く/ビット暗くなり、細胞は次のステップのための準備が整いました。 3分後に細胞を確認し、必要な場合にそれらを戻すことが最善です。初めてこのプロトコルを使用する場合、それはできるだけ早くディスパーゼから細胞を除去することが重要であると同時に、細胞の1プレートのみで開始するのが最善です。 </li><li>細胞からディスパーゼを吸引。穏やかに（細胞がこの段階では非常に脆弱であり、比較的容易に板から外れます）ディスパーゼを洗い流すために、各ウェルにDMEM/F12培地の1.5 mlを加える。 DMEM/F12を吸引し、各ウェルにhESCの培地1.5mlを加える。 </li><li>細胞を剥離し、別れること、（垂直）の右下隅に向かって10mlガラスピペットの先端を配置ウェル（細胞に触れる）とピペットを上下に移動して - 上向きのストロークが近くになければなりません手続下向きストロークへ。井戸の反対側に到達すると、水平方向の悲惨で繰り返すction。 </li><li>セルの全てが懸濁状態にされたら、15 mlチューブに置き、2分間200 xgでそれらを遠心分離します。チューブの底部での細胞のペレットがあるはずです。ペレット上から培地を吸引。 </li><li>凝集体を保つために利用されるべきである細胞培養フラスコの大きさは細胞の元の量に依存します。 hESCの培地50mlを活用すべきでhESCの6ウェル（1プレート）は、一つの非組織培養は、T75フラスコを治療した。ステップ1.6から37でフラスコとインキュベート℃にセルを転送</li><li>細胞の破片を取り除くためには、細胞培地、フラスコを約12時間後に交換する必要があります。これを行うには、（2分間200×g）で細胞をスピンダウンして、50 mlチューブに培地/細胞のすべてを置いて、古い培地を吸引。次に、新しいT75フラスコに細胞、場所に新鮮なhESCの培地50mlを加える。次いで、細胞を、これと同じ手順（5日まで）続く毎日供給することができます。 </li></ol><ol><li> 50mlチューブに細胞/培地を移し、200×gで2分間細胞を遠心分離する。次に、上清を吸引し、神経誘導培地（NIM）50mlでT75フラスコ新しい（処理非組織培養）にセルを転送します。 </li><li>細胞はNIMに入ったら、培地の半分が一日おきに交換する必要があります。凝集体は、彼らが数分後に自分で50 mlコニカルチューブの底（ない遠心分離は必要ありません）に沈んでしまう場所に十分に大きくなるはずです。 NIM（D7-D8の合計）で2〜3日後、細胞をプレートに準備ができているはずです。ラミニンまたはウシ胎児血清（FBS）は、細胞がプレートに取り付けるために利用することができます。 </li><li>各集合が他のものに触れることなく、いくつかのより多くの日をプレート上で増殖することができるはずとして必要とされている6ウェルプレートに扱わ組織培養の数は、細胞の密度に依存します。平均して、1からセルT75フラスコは細胞の価値は約4-6 6ウェルプレートをもたらすでしょう。 </li><li><ol class="ualpha"><li>ラミニンを使用している場合は、コート10〜20μg/ mlの6ウェルプレート（ウェル〜0.5ミリリットル/）にNIMでそれを希釈してください。 2〜3時間のためにコーティングした後、6ウェルプレート（ウェル当たり約20から30凝集体）上にプレート細胞凝集体。凝集体が取り付けられた後、NIMの1.5 mlを加える。 </li><li> FBSを使用している場合は、90％のNIMおよび10％FBS（1.5 ml /ウェル）の混合物を準備します。各ウェルに細胞と培地1.5mlを加え、穏やかに集計を広げるためにプレートを前後に振ると、細胞がインキュベーターにO / Nを添付することができます。 FBSを削除するには、次の朝培地（2 ml /ウェルNIMの）を変更してください。 </li></ol></li><li>メッキであることの一日か二日後、各集合は単分子膜を形成するために広がるでしょう。数日以内に、これらの細胞のほとんどの中心は形態学的に円柱状の細胞（細長い）のように表示されます。この期間中、一日おきにNIMを変更します。いくつかのPSCライン（特別なLY IPSC）、あまり効率的柱状細胞を形成することができる。この問題が発生した場合、ステージ2の間のBMPおよびTGF阻害剤（2μMでDorsomorphin 29、SB431542 19）の添加が役立つことがあります。 </li><li>日14から17の周りに、円柱状の細胞がよりコンパクトに表示されます。時には、これらの細胞は内部に見えるルーメンと尾根や環を形成する。円柱状の形態に加えて、この段階での細胞は、このようなPAX6とSOX1 12,26として神経上皮マーカーを発現する。 </li><li>分離を開始する前に、1は最初に存在する任意の非神経上皮細胞があるかどうかを判断するために細胞を調べなければなりません。客観的マーカーは、非上皮コロニーを示すために利用することができます。これらは、その後ピペットチップでそれらを掻き落として除去することができます。 </li></ol> 3。終脳前駆細胞の生成（D17-D24） <ol><li>コロニーの中心は神経上皮細胞が含まれており、植民地の他の部分から隔離されるべきである。これは、使用して行うことができますマイクロピペットと滅菌1mlをピペットチップを濾過した。圧力少量のコロニーの中心部に適用されると、それは一般的に極めて容易にオフに持ち上げる。コロニーの外側部分が同様に切り離すことができないように慎重になる。センターでは、頑固なされているし、自分で抜けない場合は、無菌フードで顕微鏡下で針を使用してそれらを切り出すことにより削除することができます。 2分間、200×gで15 mlのチューブとスピンにコロニーの中心部分を転送します。 </li><li>培地を細胞から吸引されるべきである。 （ビタミン、1:50なし）B27の添加によりNIMの10ミリリットルを含むT25フラスコを処理した細胞の価値がある二つのプレートは、その後、非組織培養に転送することができます。細胞の1プレート当たり培地の5〜10 mlを使用します。 </li><li>細胞は翌日見たときに、彼らは外見のような球を持っている必要があります。それはしばしば末梢細胞であるとして、それは新しいフラスコ（NIMとB27の存在下で、午前1時50分）に、これらの細胞を移すことが必要であるでこっそりとフラスコの底に付着している。 </li><li>ニューロスフィアは、その後B27（1:50）を補っNIMを使用して一週間の浮遊培養しなければならない。セルの耐久性を促進し、増殖、サイクリックAMP（cAMP、1μM）と同様にインスリン成長因子（IGF-1、10 ng / ml）をするために、懸濁培養中の培地に添加することができる。この時点では、ニューロスフィアは、終脳前駆細胞が含まれている（FOXG1 +）と最終分化のためにカバースリップ上に播種する準備が整いました。 </li></ol> 4。終脳のニューロン（D25 +）にさらに分化<ol><li><ol class="ualpha"><li>細胞をメッキするpoly-ornithine/lamininコーティングされたカバーガラス（24ウェルプレート中）を用意します。カバーガラスを最初にクリーニングされ、その後、策略-オルニチン（0.1 mg / mlの、37℃、O / N、および冷凍庫に保存されている）でコーティングされています。 ポリオルニチンコーティング： <ol><li>カバースリップを滅菌：のカバーガラスを置き硝酸の入ったビーカー、優しく1時間ドラフト内で振る。 、硝酸を注ぐDI水で数回すすぎ、少なくとも15分間のDI流水でカバースリップのままにしておきます。 95％エタノールでカバーガラスを置き、どちらのRTで30分間（直ちに使用している場合）またはエタノールの店のために振る。 </li><li>無菌フードでは、6ウェルプレートのふたに滅菌カバースリップを含む50 mlチューブの中身を注ぐ。滅菌ピンセットを用いて、一度に1つのカバーグラスをピックアップし、24ウェルプレートの1ウェル内に立設。各ウェルにカバースリップを持つように繰り返します。 </li><li>カバースリップは各ウェルでフラット落ちているまで、彼らが完全に乾いた後、プレートをタップします。次の各カバースリップにポリオルニチンμlの100を（滅菌のdH 2 Oで0.1 mg / ml）を追加し、37℃でプレートO / Nをインキュベート℃に</li><li>翌日、インキュベーターからプレートを取り外し、それらを室温まで冷まします。 （tの端から各カバースリップのオフポリオルニチンアスピレート彼カバースリップ）は、プロセス内のカバーガラスに触れたり、傷を付けないことを確認して。カバーガラスは、洗濯前に約30分間乾燥させます。 </li><li>各ウェルに1 mlの滅菌dH 2 Oを追加し、10分間放置し、各ウェルから水を吸引。この洗浄工程を2回繰り返します。プレートが完全に乾燥した後、（休業はフードでオフカバー）アルミホイルで覆い、上にふたを置き、-20℃で保存する</li></ol></li><li><ol><li>ラミニンでコートしたカバーガラスをして、唯一のカバースリップ自体を（触れる液体を持つように注意しながら、各ポリオルニチン扱わカバースリップに神経分化培地およびラミニン（20μg/ mlの最終濃度）の混合物50μlを加えるとこぼしていないオフ）。添付ファイル用の細胞を準備する前に1〜2時間37℃でそれらをインキュベートする。 </li></ol></li></ol></li><li> 15mlチューブで2分間200 xgでニューロスフィアを収集し、遠心分離する。上清を吸引。 </li> &lt;LI&gt; <ol class="ualpha"><li> DMEM-F12で細胞を洗浄し、再び細胞を遠心分離する。ニューロスが正しくアタッチするには大きすぎる場合は、この段階でAccutaseと解離させることができる。 </li><li> Accutaseを使用する場合と：DMEM-F12で細胞を洗浄した後、ニューロスフェアはAccutase（約2ミリリットル）を加え、3分間37℃で細胞をインキュベートすることにより、小さなクラスターに解離する。次に、トリプシンインヒビター（〜2ミリリットル）の同量を追加し、3分間200 xgで細胞を遠心分離します。次いで、細胞を、NDMに再懸濁し、P200のピペットを用いて分割する必要があります。小さなクラスターは、その後、予め被覆カバーガラス上にめっきすることができる。 </li></ol></li><li>媒体の大半を吸引し、それらを選択すると、より簡単になるように培地に数滴6cmのシャーレ上にセルを配置する。各プレコーティングされたカバースリップに約4-5ニューロスフェアを追加します。第一ラミニンを吸引する必要はありません。 </li><li>ニューロスフィアは、少なくとも2〜4時間のために添付しましょう​​。かつて彼らは持っているよくttached、もっと培地（0.5ミリリットル/カバースリップ）を追加する必要があります。それは、神経B27（1:50）を補充した分化培地は、cAMP（1μM）、および神経栄養因子（BDNF、GDNF、およびIGF、すべてのng / mlで10℃）で構成する必要があります。この時点で、培地の半分は一日おきに変更することができ、これらの細胞は数ヶ月の間維持することができる。 </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Tanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+specification+in+the+spinal+cord%3A+inductive+signals+and+transcriptional+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes.</a> Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).</li>
<li>Wilson, S. I., Edlund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction%3A+toward+a+unifying+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural induction: toward a unifying mechanism.</a> Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).</li>
<li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).</li>
<li>Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).</li>
<li>Singh Roy, N., Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer-specified+GFP-based+FACS+purification+of+human+spinal+motor+neurons+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells.</a> Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).</li>
<li>Lee, H., Shamy, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+and+transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons.</a> Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).</li>
<li>Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).</li>
<li>Li, X. J., Du, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).</li>
<li>Perrier, A. L., Tabar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).</li>
<li>Roy, N. S., Cleren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).</li>
<li>Yan, Y., Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+dopaminergic+neuronal+subtypes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 781-790 (2005).</li>
<li>Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).</li>
<li>Osakada, F., Ikeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).</li>
<li>Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+neurons+and+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).</li>
<li>Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li>
<li>Chambers, S. M., Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).</li>
<li>Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+midbrain+dopaminergic+neurons+from+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Neuron. 28, 31-40 (2000).</li>
<li>Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Patterning of the embryonic forebrain.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).</li>
<li>Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+in+glutamatergic+neurogenesis%3A+conserved+programs+in+neocortex%2C+cerebellum%2C+and+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus.</a> Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).</li>
<li>Watanabe, K., Kamiya, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).</li>
<li>Watanabe, K., Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+via+an+obligated+primitive+anterior+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage.</a> Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).</li>
<li>Li, X. J., Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136, 4055-4063 (2009).</li>
<li>Zeng, H., Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+region-specific+neurons+including+forebrain+glutamatergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 5, e11853(2010).</li>
<li>Kim, D. S., Lee, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+enhancement+of+neural+differentiation+from+human+ES+and+iPS+cells+regardless+of+their+innate+difference+in+differentiation+propensity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity.</a> Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).</li>
<li>Zhang, X., Huang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax6+is+a+human+neuroectoderm+cell+fate+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant.</a> Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).</li>
<li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+patterning+of+the+central+nervous+system%3A+how+many+organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Initial patterning of the central nervous system: how many organizers.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).</li>
<li>Ma, L., Hu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+GABA+neurons+correct+locomotion+deficits+in+quinolinic+acid-lesioned+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice.</a> Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).</li>
<li>Li, W., Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Lowry, W. E., Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li>
<li>Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Ebert, A. D., Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457, 277-280 (2009).</li>
<li>Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li>
<li>Park, I. H., Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+models+of+the+genomic+imprinting+disorders+Angelman+and+Prader-Willi+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).</li>
<li>Kiskinis, E., Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+toward+the+clinical+application+of+patient-specific+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).</li>
<li>Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin-1+L166P+mutant+human+pluripotent+stem+cell-derived+neurons+exhibit+partial+loss+of+gamma-secretase+activity+in+endogenous+amyloid-beta+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation.</a> Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).</li>
<li>Walsh, R. M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Rett+syndrome+with+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Rett syndrome with stem cells.</a> Cell. 143, 499-500 (2010).</li>
<li>Egawa, N., Kitaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+Screening+for+ALS+Using+Patient-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li>
<li>Kola, I., Landis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+the+pharmaceutical+industry+reduce+attrition+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).</li>
</ol>

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

神経分化プロセスの間に、いくつかの重要なステップがあります。そうでなければ細胞はすでに非神経系統になってきに偏っている可能性があるため、人間のPSCが多能性であることを確認することが重要です。これは、あるOct4、Sox2は、Nanog遺伝子、及びTRA-1-60 1から3のように多能性マーカーに対する抗体を用いた人間のPSCを染色することによって確認することができます。人間のPSCは、それらを継代した後、非常によく結合しなかった場合、ROCK阻害剤（Y27632）を助けるために添加することができる。その細胞の多能性を維持が困難な人のために、いくつかの潜在的な問題は、品質/密度MEF細胞のと同様に、バッチ毎に変動があり得るとして使用されてKOSRがたくさんあり​​ます。 MEFフィーダー細胞は、上記のプロトコルでのPSCを維持するために使用されてきたが、この方法はまた、フィーダーフリーシステムを使用して培養するPSCのために動作します。 細胞はPSCの凝集体を形成する分割されているとき、それはLIMに重要であるそれはほんの数分へのディスパーゼ露出（エッジは切り...

ヒト胚性幹細胞（hESC）や人工多能性幹細胞（性IPSC）の両方を含む、ヒト多能性幹細胞（PSCの）、1-3ニューロンを含む体のあらゆる細胞の種類を生成する能力を持っている。人間のPSCからの様々な神経細胞サブタイプの監督の分化は、再生医療におけるこれらの細胞のアプリケーションのための鍵を握っている。開発中の機能的なニューロンのサブタイプの世代は、神経系統の誘導、rostro -尾軸に沿った地域の前駆体の仕様、および4,5地域の前駆細胞から有糸分裂後ニューロンタイプの分化を伴う複雑なプロセスである。 2001年以降、いくつかのシステムは、ニューロンのサブタイプ6,7の次の世代のためのプラットフォームを提供してきたヒトES細胞から神経系統を生成するために設立されました。発達の原理、そのような脊髄の運動ニューロン8-12、中脳DOPのようないくつかのニューロンタイプに基づいアミン作用性のニューロン13から15、および神経網膜細胞16,17を効率的に人間のPSCから指定されています。これは、 生体内で開発中にこれらのニューロンタイプの仕様のために重要である重要なモルフォゲンを適用することによって行われていた。他のプロトコルはまた、分化21を促進するためにこのような小さな分子として、または他の種類の細胞と共培養することにより、追加の要因18から20のいずれかを使用して、神経細胞にヒトES細胞の分化を促進するために開発されている。 人間の大脳新皮質は、高度に発達し、学習、記憶、認知機能22,23において重要な役割を果たしているグルタミン酸作動性ニューロンを含む多くの種類の細胞が含まれています。培養中のグルタミン酸作動性ニューロンを生成するための最初のステップは終脳前駆細胞を指定することです。芳樹さんのグループは、第一の無血清サスペンシオを使ってマウスのESC（​​mESCs）から終脳前駆体の分化を指示報告n個のDKK1の存在下で培養（Wntシグナル伝達を阻害する）、ならびにLeftyA（Nodalシグナル伝達を阻害する）24。その後、自験例を含め、いくつかのグループはまた、無血清培地中で25から27までの人間のPSCから終脳前駆体の仕様を報告している。人間のPSCから終脳前駆体の生成は、外因性のモルフォゲンの使用を必要としないと、これらの前駆体を生成するのに効率がmESCs 26,27からのそれよりはるかに高いです。ここでは、よくZhangさんのグループ7によって確立された神経誘導のために化学的に定義されたシステムが記載されている。外因caudalizing因子の添加なしで、このプロトコルは、効率的に人間のPSC 27日から終脳前駆体を生成します。これらの前駆細胞は、その後、Wntとソニックヘッジホッグ（Shh）のシグナル伝達を調節することにより、背や腹前駆細胞に分化させることができる。背前駆細胞はさらに、グルタミン酸作動性ニューロンに分化することができる電子fficiently 27。また、このプロトコルはまた、作用機序、ならびに疾患の大規模な配列のための潜在的な治療法を模索するために利用することができる患者固有ニューロンの生成を可能にする人間性IPSC 28日からのグルタミン酸作動性ニューロンの生成に適しています。また、我々のシステムはまた、終脳の多様なニューロンタイプの開発と仕様を探るためのプラットフォームを提供します。

<table><tbody><tr><td>F12栄養混合物(DMEM / F12)を含むダルベッコの修飾イーグル培地</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清代替品</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン(200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr>非<tr><td>必須アミノ酸</td><td>Gibco</td><td>1140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercapt&#8211;タノール (14.3 M)</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>神経基礎培地</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>Σ</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-オルニチン臭化水素酸塩 (ポリオルニチン)</td><td>Σ</td><td>116K5103</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン (ヒト)</td><td>Sigma</td><td>L-6274</td><td></td></tr><tr><td>Laminin (mouse)</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cellテクノロジー</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 阻害剤</td><td>ステムジェント</td><td>04-0012</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>ステムジェント</td><td>04-0010</td><td></td></tr><tr><td>ドルソモルフィン</td><td>ステムジェント</td><td>04-0024</td><td></td></tr><tr><td>線維芽細胞成長因子 2 (FGF2, bFGF)</td> <td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン阻害剤</td><td>ギブコ</td><td>17075</td><td></td></tr><tr><td>0.1% ゼラチン</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Foxg1 抗体</td><td>Dr. Y. Sasai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoxb4 抗体 (1:50)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>I12</td><td></td></tr><tr><td>Pax6 抗体 (1:5000)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>PAX6</td><td></td></tr><tr><td>Nkx2.1 抗体 (1:200)</td><td>Chemicon</td><td>MAB5460</td><td></td></tr><tr><td>Tbr1 抗体 (1:2000)</td><td>Chemicon</td><td>AB9616</td><td></td></tr><tr><td>vGLUT1抗体 (1:100)</td><td>Synaptic Systems</td><td>135302</td><td></td></tr><tr><td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF)</td><td>株式会社プレポテック</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>グリア由来神経栄養因子(GDNF)</td><td>プレポテック株式会社</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>インスリン成長因子1(IGF1)</td><td>株式会社プレポテック</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>サイクリックAMP (cAMP)</td><td>Sigma</td><td>D-0260</td><td></td></tr><tr><td>ソニックヘッジホッグ (SHH)</td><td>R&D</td><td>1845-SH</td><td></td></tr><tr><td>50 ml チューブ</td><td>ベクトン ディキンソン (BD)</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>15 ml チューブ</td><td>BD</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>BD</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>BD</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>T25 フラスコ (未処理)</td><td>BD</td><td>353009</td><td></td></tr><tr><td>T75 フラスコ (未処理)</td><td>BD</td><td>353133</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>Chemiglassライフサイエンス</td><td>1760-012</td><td></td></tr><tr><td>6 cmシャーレ</td><td>BD</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>9インチガラスピペット</td>フィ<td>ッシャー13-678-20D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriflipフィルター(0.22 &mu;M)</td><td>ミリポア</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>ステリカップフィルター 1,000 ml (0.22 &mu;M)</td><td>ミリポア</td><td>SCGPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>位相差顕微鏡(オブザーバーA1)</td><td>ツァイス</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>二酸化炭素インキュベーター(Hera Cell 150)</td><td>サーモエレクトロンコーポレーション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティフード(Sterilgard III Advance)</td><td>ベーカーカンパニー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機(5702 R)</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト多能性幹細胞から終脳のグルタミン酸作動性ニューロンの仕様

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

ここでは、効率的にヒト多能性幹細胞（PSCの）から終脳のグルタミン酸作動性ニューロンを生成するための段階的な手順が記載されている。分化過程は、細胞が浮遊培養に置かれたときに凝集体を形成するために切り上げ塊に人間のPSCを壊すことによって開始されます。凝集体は、その後自発的分化を可能にするために日1月4日からのhESC培地で栽培されています。この間、細胞は三胚葉のいずれかになるための能力を持っている。日5月8日から、細胞は、神経系統にプッシュした神経誘導培地に置かれます。 8日目ごろ、細胞を6ウェルプレートに取り付け、その間神経上皮細胞の形の間を区別するために許可されています。これらの神経上皮細胞は、17日目に単離することができる。彼らはカバースリップ上に播種できるようになるまで細胞はその後ニューロスフェアとして保持することができる。任意caudalizing要因なしに基本的な培地を用いて、神経上皮細胞はspecifieアールその後、さらに効率的に背側終脳前駆細胞とグルタミン酸作動性神経細胞に分化させることができる終脳前駆体にD。全体的に、我々のシステムは、これらのニューロンの開発とそれらに影響を与える疾患を研究する研究者のための人間のグルタミン酸作動性ニューロンを生成するためのツールを提供しています。

ここでは、いくつかの重要な工程を経て終グルタミン酸作動性ニューロンへの人間のPSCを区別するために、プロトコル：終脳のニューロンへのPSC凝集体の形成、神経上皮細胞の誘導、終脳前駆細胞の生成、およびこれらの前駆細胞の最終分化（ 図1）があります記載されて。このシステムは、終脳前駆細胞とグルタミン酸作動性ニューロンの生成に堅牢かつ効率的です。例（ 図2）として、caudalizing因子を添加することなく、ヒトES細胞は、神経系統27に分化させた。 24日後の分化では、神経前駆細胞の大半はFOXG1（終脳によって発現する転写因子）が陽性であったが、HOXB4に負（後脳と脊髄細胞のマーカー）終脳前駆細胞を示唆して成功した（ 図2D）を生成した。これらの前駆細胞は終脳の電話<html> PAX6（背前駆細胞によって発現されるマーカー）（ 図2E）ではなく、NKX2.1（腹前駆細胞のマーカー）（ 図2F）の発現によって示されるように、背の表現型をosses...

この手順では、人間の発達の間に観察されるものと類似しているチェックポイントを通過することによって終脳のニューロンを生成します。細胞は、自発的に区別するために許可されている神経系統に向かってそれらをプッシュする要因にさらされて、分離され、最終分化と成熟を可能にするためにカバーガラス上にメッキが施されています。

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

この手順の全体的な目的は、ヒトの発生過程で観察されるチェックポイントと同様の過程を経ることで、ヒト胚性幹細胞（hESCs）から頭部ニューロンを生成することです。まず、hESCsをhESC培地中で浮遊状態で自然分化させ、次いで神経誘導培地に移してより選択的に分化させることでこれを達成します。その後、胚体（embryoid bodies）またはPSC凝集体を組織培養処理済みのプレートに接着させ、細胞を増殖させて単層へと分化させます。中心部において、形態学的にキロメーター細胞に類似した神経上皮細胞が形成されます。次に、神経上皮細胞を単離して浮遊培養し、ニューロスフィアを形成させます。最後に、ニューロスフィアをカバーガラス上に播種し、さらに分化させます。最終的に、免疫染色や電気生理学的な手法を用いることで、形成されたニューロンの具体的な種類を示す結果を得ることができます。この技術の意義は、多種多様な遺伝性疾患にまで及びます。なぜなら、人工多能性幹細胞から患者特異的なニューロンを生成することができ、そこから作用機序や潜在的な治療法を解明できるためです。また、本手法は、多能性幹細胞からの視床下部ニューロン亜型の分化に関する知見を提供することが可能です。本手法は、視床下部神経細胞に関連するヒト疾患などの他のシステムにも適用可能です。ヒト多能性幹細胞凝集塊を作製するには、まずヒト多能性幹細胞を、basic FGFを添加したHESC培地を用いてマウス胚性線維芽細胞フィーダー上で5〜7日間培養します。コロニーは大きくなりますが、未分化の状態が維持されます。コロニーが適切な段階に達したら、50 mLチューブを用意します。プロトコールに従い、D-M-E-M-F 12培地を用いて1 mg/mLのdis bays溶液を調製してください。細胞から培地を吸引し、D-M-E-M-F 12で1回洗浄します。洗浄液を除去した後、各ウェルにdis baysを1 mL添加し、37 °Cで3〜5分間インキュベートします。3分が経過した時点で、顕微鏡下で端が少し暗く見え、丸まっている箇所がないか確認してください。必要に応じて、細胞をより長くインキュベートします。細胞の準備が整ったら、剥離溶液を除去し、D-M-E-M-F 12で細胞を1回洗浄した後、細胞を遊離させ分散させるため、洗浄液を1.5 millilitersのHESC mediumに交換します。10 milliliterのガラスピペットの先端を、ウェルの右下壁側の細胞の上に配置し、小さく上下に動かしながらウェルの反対側まで移動させ、その後逆方向に再び戻します。すべての細胞を懸濁させた後、15 milliliterチューブに入れ、200 Gで2分間遠心分離し、ペレットから培地を除去します。HESC mediumを用いて、細胞を培養用フラスコに移します。例えば、HSCの6ウェル分から得られた細胞の場合、50 millilitersのHESC mediumを入れたT 75フラスコ1本を使用します。細胞を37 °Cで12時間インキュベートします。次に、細胞の破片を除去するため、細胞と培地を50 mLチューブに移し、細胞を1回洗浄した後、50 mLの新鮮な培地と共に新しいフラスコに移します。5日目まで、この方法で細胞の継代飼育を続けてください。5日目に、細胞を遠心分離して回収し、新しいT 75フラスコに移します。50 mLの神経誘導培地（NIM）を用い、毎日NIMの半分を交換しながら2〜3日間培養します。培養プレートへの細胞の接着を促進するため、ラミニンまたはFBSを用いて細胞を播種します。FBSを用いる場合は、細胞を含む培地を各プレートに1.5 mLずつ加えます。プレートを静かに揺らして凝集塊を分散させ、一晩置いて細胞を接着させます。翌日、37 °Cにおいて、各ウェルの培地をすべて2 mLのNIMに交換します。1〜2日間培養すると、各凝集塊が広がり単層を形成し、数日以内に、ほとんどの細胞の中心部が形態学的にcolumer細胞に類似した外観になります。14日から17日頃になると、柱状細胞がより緻密になります。細胞が隆起やリング状の形態をとり、内部に可視的な腔（ルーメン）が形成されることがあります。細胞を単離する前に、非EU上皮細胞が混在していないか確認し、ピペットチップを用いてそれらを掻き出してください。コロニーの中央に存在する神経上皮細胞を単離します。マイクロピペットと滅菌済みの1 mLフィルター付きピペットを用い、コロニーの中央に圧力をかけて剥離させます。この際、コロニーの外周部分まで剥離させないよう注意してください。分離した2プレート分の細胞を15 mLチューブに移し、200 Gで2分間遠心分離します。培地を除去した後、10 mLのNIMを含む非組織培養処理T 25フラスコに細胞を移します。B 27を添加して一晩インキュベートすると、翌日には細胞が球状の形態を示します。時に周辺細胞も単離され、それらは通常、フラスコの底に接着します。このような場合は、接着した細胞を培養容器に残したまま、球状の細胞を新しいフラスコに移してください。神経球をNIMB 27中で1週間懸濁培養し、細胞の生存維持と増殖を促進させます。cyclic AMPとインスリン様成長因子1を添加します。1週間後、ニューロスフィアには頭部前駆細胞が含まれ、最終分化のためにカバーガラスに播種できる状態になります。24ウェルプレートにポリウレタンラミニンコーティング済みのカバーガラスを準備するには、まず、清浄なカバーガラスを0.1 mg/mLのポリウレタン溶液で37 °Cにて一晩コーティングし、次いで神経分化用ラミニン溶液20 µg/mLを50 µL用いてカバーガラスをラミニンでコーティングします。各ポリウレタン処理済みカバーガラスに培地を加えます。この際、液体がカバーガラス自体のみに接触するように注意してください。37 °Cで1～2時間インキュベートします。ラミニンによるインキュベーション後、ニューロスフィアを回収し、D-M-E-M-F 12で洗浄します。細胞が大きすぎて適切に接着しない場合は、Accutaneを約2 mL加え、37 °Cで3分間インキュベートします。次に、同量のトリプシン阻害剤を加え、200 ×gで3分間遠心分離した後、溶液をNDMに置換し、P 200を用いて細胞を小さなクラスター状に分散させます。これらをあらかじめコーティングしたカバーガラスの上に配置し、培地の大部分を吸引除去します。その後、プレコートされたカバーガラスからラミニンを除去することなく選択しやすくするため、少量の培地を用いて細胞を6 cmのペトリ皿に移します。各カバーガラスに約4〜5個のニューロスフェアを転移させます。B 27 cyclicを添加した神経分化培地0.5 mLを加える前に、ニューロスフェアを少なくとも2〜4時間付着させます。隔日で培地の半分をMPおよび神経栄養因子で交換します。ここで示すように、細胞は数ヶ月間にわたって維持することが可能です。本プロトコルでは、いくつかの重要なステップを経て、ヒトPSCを尾側頭方グルタミン酸作動性ニューロンへと分化させる方法について説明します。PSC凝集体の形成は、神経上皮細胞の誘導、頭部前駆細胞の生成、そしてこれらの前駆細胞から頭部ニューロンへの最終分化を促進します。このシステムは、例えば頭部前駆細胞やグルタミン酸作動性ニューロンの生成において、堅牢かつ効率的です。分化誘導因子の添加なしでは、HSCsは神経系へと分化し、分化後24日となりました。神経前駆細胞の大部分は、頭部で発現する転写因子であるFox G1陽性であり、後脳および脊髄細胞のマーカーであるHOXB4は陰性であったことから、終脳前駆細胞が正常に生成されたことが示唆された。これらの終脳前駆細胞は、背側前駆細胞で発現するマーカーであるPAX6を発現し、腹側前駆細胞のマーカーであるNKX2.1は発現していないことから、背側の表現型を有している。 さらなる分化の後、これらの頭部背側前駆細胞はグルタミン酸作動性ニューロンへと分化し、グルタミン酸作動性マーカー陽性となりました。TBR1陽性を維持したTBR1ニューロンは、ニューロンマーカーであるbeta three tubulinまたはmap2に対しても陽性でした。これらの細胞は、成熟したグルタミン酸作動性ニューロンのマーカーであるvesicular glutamate transporter 1（Vglut1）も発現しており、培養系において頭部グルタミン酸作動性ニューロンが効率的に生成されたことが示唆されました。本手順に続き、これらのニューロンが他の細胞とシナプス接続を形成できるかといった追加の疑問を解消するために、電気生理学などの他の手法を実施することが可能です。このビデオを視聴することで、十分な理解が得られるはずです。そこでは、いくつかの重要なステップを経て、ヒト多能性幹細胞を頭部グルタミン酸作動性ニューロンへと分化させる方法について解説しました。多能性幹細胞凝集体の形成、神経上皮細胞の誘導、頭部前駆細胞の生成、およびこれらの前駆細胞から頭部ニューロンへの最終分化。

the-specification-telencephalic-glutamatergic-neurons-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

私たちは、人間の神経前駆細胞の大量供給と神経修復のための開発CNSにおける神経細胞の種類の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接、神経芽細胞の誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

多能性ヒト幹細胞の神経分化（hPSCs）のためのプロトコルは、多くの場合、時間がかかり、実質的な細胞培養のスキルを必要とします。ここでは、制御された方法で人間の神経細胞の、簡便、迅速、かつ効率的に生成できるように、multititreプレートフォーマットへの小分子ベースの分化手順を適応している。...

Multititreプレートフォーマットでヒト多能性幹細胞から神経細胞の迅速かつ効率的な生成

このビデオは、胚様体(EB)を神経上皮凝集体に分化させ、その後のニューロン細胞とグリア細胞への分裂のプロセスを示しています。この方法により、in...

ヒト人工多能性幹細胞由来胚様体からのニューロンおよびグリア細胞の生成

このビデオでは、テトラサイクリン応答性エレメントの制御下で神経原性転写因子遺伝子を保有する遺伝子操作レンチウイルスをトランスフェクションすることにより、ヒト多能性幹細胞をニューロンに分化誘導し、その後、テトラサイクリン誘導体および成熟培地で処理するプロセスを示しています。...

人工レンチウイルスを用いたニューロンにおけるヒト多能性幹細胞分化

私たちは、発生生物学からの知識と公開された研究に基づいて、ヒト胚性幹細胞とヒト人工多能性幹細胞の両方からA9中脳ドーパミン作動性ニューロンを効率的に生成するための最適化されたプロトコルを開発しました。これは、パーキンソン病の疾患モデリングと細胞補充療法に役立ちます。...

ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督

錐体ニューロンの樹状突起棘は、哺乳類の脳皮質の中で最も興奮性シナプスのサイトです。この方法は、人工多能性幹細胞由来のヒト皮質錐体グルタミン酸作動性ニューロンにおける脊椎形態の3次元定量分析を記載します。...

ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

ヒトが誘導する多能性幹細胞（hiPSC）は、薬物および化学物質のスクリーニングならびに神経毒性を含む毒性試験のための新しいインビトロモデルの開発のための強力なツールと考えられている。ここでは、hiPSCをニューロンおよびグリアに分化させるための詳細なプロトコールが記載されている。...

神経毒性試験のための、ヒト誘導多能性幹細胞のニューロンとグリアの混合培養物への分化のためのプロトコール

このプロトコルの結合解離ひと多能性幹細胞由来神経細胞の再現性のある手法を目指して、アストロ サイト 3 D...

ひと多能性幹細胞からのニューロンとアストロ サイトの三次元共培養系によるシナプス局所回路におけるモデリング

ミトコンドリアの輸送および形態の障害は、様々な神経変性疾患に関与している。提示されたプロトコルは、遺伝性痙攣対麻痺におけるミトコンドリア輸送および形態を評価するために、誘導多能性幹細胞由来前脳ニューロンを使用する。このプロトコルは、軸索に沿ったミトコンドリア人身売買の特徴付けとその形態の分析を可能にし、神経変性疾患の研究を容易にする。...

遺伝性痙性対麻痺におけるヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンにおけるミトコンドリア輸送と形態学の解析

ヒト誘導多能性由来のアストロサイトとニューロンおよびそれらの共培養を電気生理学的記録のために脊髄に分化させる方法を記載する。...

領域特異的ヒト多能性幹細胞由来アストロサイトおよびニューロンを用いたALSモデリングのための電気生理学的基盤の確立

ヒト多能性幹細胞(hPSC)から腸神経系(ENS)系統を導出することで、ENSの発生と疾患を研究し、再生医療で使用するためのスケーラブルな細胞源を提供します。ここでは、化学的に定義された培養条件を使用してhPSCから腸管ニューロンを誘導するための詳細な in vitro...

ヒト多能性幹細胞からの腸管神経系系統の分化

学ぶヒト多能性幹細胞から終脳グルタミン酸作動性ニューロンへの分化プロトコル。神経誘導培地を用いた選択的分化とニューロスフェア形成により、発達生物学の知見を得る方法を解説します。

ヒト多能性幹細胞から終脳のグルタミン酸作動性ニューロンの仕様

さらに動画を探す