Name: 骨髄由来マクロファージを用いたマクロファージ分極の調査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学ぶマクロファージ分極の調査法。マウス骨髄由来細胞を培養し、LPSまたはIL-4刺激でM1/M2に分極させ、フローサイトメトリーとリアルタイムPCRで活性化応答を解析します。この手法は免疫応答の理解に有用です。

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この作品は、米国心臓協会（博士Beiyan周にBGIA 7850037）によってサポートされていました。

1。骨髄細胞の単離<ol><li> 6-8週齢のマウスからの大腿骨と脛骨の骨を分離し、髪を洗い流した後、骨を開いてカット。 </li><li>冷PBS +2％の熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）（3-5 ML /マウス）に骨髄を洗い流すために21G針とを10mlのシリンジを使用してください。 </li><li>細胞を解離するために21G針を4〜6回を通して骨髄を渡します。 </li><li>細胞塊、骨、毛髪および他の細胞/組織を除去するために70μmのセルストレーナーを通して細胞を渡します。 </li><li> NH 4 Cl溶液（0.8％NH 4 Cl溶液、STEMCELL技術）の3つのボリュームを追加し、赤血球を除去するために10分間氷上でインキュベートする。 </li><li> 4℃で5分間500 xgで細胞をスピンダウン</li><li>冷PBS +2％FBS（20〜50ミリリットル、細胞の量に依存する）で細胞ペレットを再懸濁します。 </li></ol> 2。誘導BMDM形成<ol><li> BMDM成長培地（2×10 6細胞/ mのに孤立した骨髄細胞を再懸濁しL）。 </li></ol> BMDM成長培地： イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）+ 10％FBS + 15％、濾過（0.2μmの）L-929細胞（ATCC、CCL-1）培養上清（単球コロニー刺激因子、M-CSFを含む）または10 ngの/ mlのM -CSF。 注：L-929細胞上清は、M-CSF 18が含まれています。 5 X 10 5 L-929細胞は6-7日間T75センチ2フラスコに播種され、馴化培地の効果的活動を確保するために、馴化培地は、使用前にフィルター0.45μmの収集と渡されます。培地のアリコートを1〜2ヶ月のためにすぐに使用されるか、または-80°Cに保存することができます。 <ol start="2"><li> 6または12ウェル組織培養プレート（実験デザインに応じて）（コーニングコスター）におけるシード細胞。 </li><li> 3日目に新鮮BMDM増殖培地を変更します。 </li><li> 7日目に、成熟BMDMの形成は、フローサイトメトリー分析を用いて評価されると蛍光体結合抗体の、CD11b及びF4/80を発現する細胞を検出する。 </li></ol> 3。 BMDM偏アクティベ<ol><li> 7日目に、新鮮な刺激培地に変更：M1活性化のために、IMDM、50 ngの/ mlのIFNγと10％FBS、100 ngの/ mlのLPSまたは100 ngの/ mlのLPSを含む使用し、M2活性化のために、と10％FBSを含むIMDMを使用10 ngの/ mlのIL-4および/または10 ngの/ mlのIL-13。 </li><li>暖かい0.05％トリプシンを用いて皿からそれらを取り外すことによって刺激さBMDMsを集め、PBS、10％FBSを含有する細胞を2回洗浄した。 </li></ol> 注：差別、0.05％トリプシン溶液（0.48 mMのEDTA、Invitrogen社を含む）または2-5 mMのEDTAのCaおよびMgを含まないPBSまたはハンクス平衡緩衝液（HBSS）の後に成熟したマクロファージをデタッチし、再懸濁するために使用することができます。トリプシンを含む消化媒体を使用する場合、細胞はシュルの損失を避けるために10分未満、37°C​​で処理する顔はオーバー消化のためにタンパク質。 <ol start="3"><li>標準的なフローサイトメトリー染色手順を使用して、様々な時点でのCD11b、F4/80、CD11cは、CD206、CD69、CD80またはCD86を含む細胞表面抗原の発現を検出する抗体を使用。 </li><li>定量RT-PCRを用いたIL-1β、TNF-αおよびIL-6（M1の活性化）、またはIL-10、IL-13、arginase1およびPPARγ（M2活性化）を含む活性化M1とM2マクロファージの特徴的な遺伝子の発現を決定する。ウエスタンブロット分析によってM1またはM2マクロファージの活性化に関与する細胞のシグナル伝達経路の活性化を決定します。 </li></ol>

<ol><li>Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microrna+circuitry+links+macrophage+polarization+to+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis.</a> Circulation. , (2012).</li>
<li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+induces+a+phenotypic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).</li>
<li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+death+and+defective+inflammation+resolution+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).</li>
<li>Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-specific+pparg+controls+alternative+activation+and+improves+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance.</a> Nature. 447, 1116-1120 (2007).</li>
<li>Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+m2+activation+of+kupffer+cells+by+ppard+ameliorates+obesity-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance.</a> Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).</li>
<li>Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+metabolism+and+pgc-1%5Bbeta%5D+attenuate+macrophage-mediated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation.</a> Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).</li>
<li>Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ikk-b+links+inflammation+to+obesity-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance.</a> Nat. Med. 11, 191-198 (2005).</li>
<li>Saberi, M., Woods, N. -B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+cell-specific+deletion+of+toll-like+receptor+4+ameliorates+hepatic+and+adipose+tissue+insulin+resistance+in+high-fat-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice.</a> Cell Metab. 10, 419-429 (2009).</li>
<li>Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte-derived+th2+cytokines+and+myeloid+ppard+regulate+macrophage+polarization+and+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity.</a> Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).</li>
<li>Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pparg+activation+primes+human+monocytes+into+alternative+m2+macrophages+with+anti-inflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties.</a> Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).</li>
<li>Bronte, V., Zanovello, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+immune+responses+by+l-arginine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of immune responses by l-arginine metabolism.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).</li>
<li>Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+regulator+of+macrophage+activation%3A+Mir-223+in+obesity-associated+adipose+tissue+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation.</a> Circulation. 125, 2892-2903 (2012).</li>
<li>Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+and+ultrastructural+analysis+of+alveolar+macrophage+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation.</a> J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).</li>
<li>Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+4+potently+enhances+murine+macrophage+mannose+receptor+activity%3A+A+marker+of+alternative+immunologic+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation.</a> J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).</li>
<li>Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+murine+mononuclear+phagocyte+inflammatory+products+by+macrophage+colony-stimulating+factor.+Lack+of+il-1+and+prostaglandin+e2+production+and+generation+of+a+specific+il-1+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor.</a> J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).</li>
<li>Biswas, S. K., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+interaction+with+lymphocyte+subsets%3A+Cancer+as+a+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm.</a> Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+polarization%3A+In+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されていない。

ここでは、骨髄前駆細胞由来のマクロファージの活性化を誘導するためのシンプルかつインビトロで容易に適応手順を報告する。この手順は、マクロファージの偏光を担当するメカニズムの研究のために使用することができる。成熟したマクロファージの純度は、このプロトコルの平均値を95から99までパーセントを用いて得られ、追加の精製法が必要とされない。マクロファージ分極の文脈における利益の特定の遺伝子の機能を調べるために、異所性発現または遺伝子特異的ノックダウンは、7日目に細胞のトランスフェクション後に行うことができる。このプロトコルは、また形成、成熟およびマクロファージの表現型に影響を及ぼす特定の要因や遺伝子の影響を調査するために7日間培養ウィンドウを提供します。 活性化マクロファージは、様々な刺激3、9、19に対応して大きな可塑性を持つ複雑な細胞および分子のプロファイルを表示します。のためにしかしながら、活性化プロファイルが完全に重なっていない、例えば、LPSは、IFNγまたは腫瘍壊死因子（TNF）およびIL-4およびIL-13 M2活性化を刺激し、両方の存在...

古典的な炎症反応とは異なる、組織に浸潤したマクロファージは、多くの場合、宿主組織の生理機能を1-8の調節に重要な役割を果たしている偏光活性状態を表示します。刺激により、マクロファージの活性化は、古典的な（M1）および代替（M2）の活性化2,4,9に分類することができる。 M1マクロファージの活性化は、例えばTNF-αとし、炎症性サイトカインの産生をもたらす、Toll様受容体（TLR）および核因子カッパB（NFκB）/ c-Jun N末端キナーゼ1（JNK1）の活性化に依存するIL- 1β、例えば、窒化酸化物（NO）10、11などの反応性酸素種の産生増加をもたらすことのiNOSの活性化。対照的に、M2マクロファージ活性化リクルートPPARγ、PPARδ、またはIL-4-STAT6経路は、代替マンノース受容体CD206のアップレギュレーションと関連付けられ、抗炎症性（M2）活性化、およびアルギナーゼ1（Arg1の）6,12につながる- 14 &lt;/&gt;（商標）。 骨髄由来マクロファージ（BMDM）は活性化マクロファージ15の偏光を制御するメカニズムを理解するためのin vitroモデル理想を提示する。 M2マクロファージの偏光IL-4および/またはIL-13によって誘導することができるながら具体的には、M1マクロファージの活性化は、リポ多糖（LPS）刺激によって誘導することができる。成熟した骨髄由来マクロファージおよび活性化マクロファージがCD11bを、F4/80、CD11cは、CD206、CD69、CD80およびCD86 9、16、17を含む表面抗原の発現についてフローサイトメトリー分析によって同定することができる。また、マクロファージ偏光に関連付けられたシグナル伝達経路のサイトカイン産生および細胞の変化は、それぞれ、定量的RT-PCRおよびウエスタンブロットによって測定することができる。要約すると、マウスの骨髄由来マクロファージは、in vitroでマクロファージ分極を研究するため、関連するモデルとしての役割を果たすことができます。

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30259.01</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Invitrogen</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>マウス GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>StemCell Technologies</td><td>7850</td><td></td></tr><tr><td>L-929</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m細胞ストレーナー</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>10 x PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>AP-9009-10</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス CD11b-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス F4/80-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4801-81</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス CD69-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0691-81</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス CD86-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0862-81</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ素プロピジウム</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr></tbody></table>

骨髄由来マクロファージを用いたマクロファージ分極の調査

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

記事では、マクロファージ分極を調査するためのin vitroモデルで容易に簡単に適応を説明しています。 GM-CSF/M-CSFの存在下で、骨髄からの造血幹/前駆細胞は、M1またはM2の刺激に続いて、単球分化に向けられる。活性化状態は、細胞表面抗原、遺伝子発現および細胞シグナル伝達経路の変化によって追跡することができる。

BMDM生成手順の概略的な説明は、（ 図1）提示される。彼らはCD11bを+ F4/80 +細胞の95〜99％（ 図2）を表す場合、成熟マクロファージの高純度は、7日目に観察することができる。偏マクロファージは、フローサイトメトリー分析を行ったCD11b、F4/80、CD11c陽性およびCD206に対する抗体を用いて調べることができる。 図3に示すように、M1マクロファージとして検出されたCD11b + F4/80 +のCD11c + CD206細胞（Q2）、M2マクロファージのCD11b +であるF4/80 +のCD11c-CD206 +細胞（Q4）。 図に示されているように：BMDMアクティベーションステータスが増加し、細胞サイズ（ 図4A、FSCイン右シフト）およびマクロファージの表面抗原CD69、CD80、またはCD86の増加豊富（のCD11b + F4/80 +門）で確認することができる4B。サイトカイン産生、遺伝子発現およ...

記事は容易に簡単に適応を説明<em&gt; in vitroで</emマクロファージ分極を調査する&gt;モデル。 GM-CSF/M-CSFの存在下で、骨髄からの造血幹/前駆細胞は、M1またはM2の刺激に続いて、単球分化に向けられる。活性化状態は、細胞表面抗原、遺伝子発現および細胞シグナル伝達経路の変化によって追跡することができる。

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

分極化解析のための骨髄由来マクロファージを生成します。マウスから大腿骨と脛骨を単離し、骨髄細胞を回収します。その後、成長因子を含む培地で細胞を培養し、マクロファージへの分化を誘導します。7日間の培養後、骨髄由来マクロファージにさまざまな刺激を与え、マクロファージを極性化させます。活性化反応をフローサイトメトリー、リアルタイムPCR、およびウェスタンブロット法で解析した結果、M1またはM2のいずれかに極性化した活性化反応を示す、高純度の骨髄由来マクロファージが得られます。刺激剤を用いて解析します。この手法は、インスリン抵抗性やCROなどの多様な関連疾患の治療や診断に寄与することが期待されます。なぜなら、T細胞浸潤マクロファージがこれらの状況において主要な役割を果たすためです。骨髄細胞の採取には一定の困難が伴い、マクロファージ分化を誘導するための十分な研究用細胞調製を得るためには回収率が極めて重要であるため、本手法を視覚的に提示することは重要です。滅菌フード内で作業を行います。組織培養皿に採取した、6〜8週齢のマウスから分離した大腿骨および脛骨を用いて本プロトコルを開始します。骨をPBSで洗浄し、ピンセットで骨を保持しながら、骨の両端をハサミで切り開きます。この際、切りすぎないように注意してください。冷PBSに2%の熱不活化FBSを添加したものを入れた10 mLシリンジに21〜23ゲージの針を装着し、骨の一端に刺入します。プランジャーを押し、骨髄を新しい組織培養ディッシュに洗い出します。次に、細胞を分散させるため、同じ針を用いて骨髄を4〜6回繰り返し通過させます。次に、細胞を70 micronのセルストレーナーに注ぎ、細胞の凝集塊、骨、毛、およびその他の細胞や組織を除去します。ろ過液を50 milliliterのコニカルチューブに回収します。溶液がフィルターを通過した後、ろ過液に3倍量の0.8% ammonium chlorideを加え、氷上で10分間インキュベートします。インキュベーション後、赤血球を除去するため、細胞を4°Cで500 ×gで5分間遠心分離します。遠心後、細胞ペレットを2%FBSを含む冷PBS 20～50 mLで再懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。細胞を4°Cで500 ×g、5分間遠心分離します。上清を捨てた後、プロトコルの次項に記載されている方法でBMDMの分化誘導を行います。BMDMを分化誘導するために、単離した骨髄細胞を2 × 10⁶ cells/mLの濃度でBMDM増殖培地に再懸濁します。1 mLあたり6×10⁶個の細胞を調整し、6ウェルまたは12ウェルの組織培養プレートの各ウェルに1〜2×10⁶個ずつ播種し、37 °Cでインキュベートします。この濃度で播種することで、3日後のフローサイトメトリーに向けた細胞の回収が容易になります。7日目に新鮮なBMDM増殖培地に交換してください。成熟したBMDMの形成は、CD11bおよびF4/80を発現する細胞を検出するために、フローサイトメトリー分析と蛍光標識抗体を用いて評価します。成熟BMDMの形成を確認した後、10% FBSを含む新鮮なIs cove's modified DMEMに交換し、M1活性化にはLPSまたはLPSとインターフェロンガンマを、M2活性化にはIL-4またはIL-13を添加します。その後、細胞を37°Cで24時間インキュベートします。刺激したb MDMsをディッシュから剥離させて回収します。まず、細胞から培地を除去し、カルシウムおよびマグネシウム不含のPBSで洗浄します。次に、0.48 mM EDTAを含む加温した0.05%トリプシンを加え、37 °Cで10分以内にインキュベートします。これは、過剰な消化により表面タンパク質が失われるのを防ぐためです。次に、10% FBS含有PBSで細胞を2回洗浄し、1.2 mlのサンプルチューブに移します。CD 11b, F4/80, CD 11c, CD 206, CD 69, CD 80、またはCD 86を含む細胞表面抗原の発現を、さまざまな時点で抗体を用いて検出します。定量PCRを用いた標準的なフローサイトメトリー染色手順に従って行います。IL-1β、TNF-αおよびIL-6の発現レベルを測定してM1活性化を評価し、あるいはIL-10、IL-13、アルギナーゼ1およびPPARγを測定してM2活性化を評価します。最後に、ウェスタンブロッティングを行い、M1またはM2マクロファージの活性化に関与する細胞シグナル伝達経路の活性化を評価することで、成熟BMDMの純度を確認します。誘導後、CD11b、F4/80、CD11cおよびCD206に対する抗体を用いてフローサイトメトリー分析を実施しました。BMDMは、まずFSCおよびSSCでゲートをかけ、死細胞および凝集物を除去しました。成熟したb MDMは、CD 11 B陽性かつF four 80陽性のサブポピュレーションとして定義され、本プロットの右上に表示されており、マクロファージの分極を評価したゲート内細胞集団の95～99%を占めていました。さらに解析が行われました。まず、組織浸潤マクロファージであるCD 11 B陽性かつF four 80陽性細胞を特定するためのゲーティングが行われました。これらのM1マクロファージのうち、CD 11 C陽性かつCD 2 0 6陰性のものは第2象限に現れ、一方、CD 11 C陰性かつCD 2 0 6陽性のM2マクロファージは第4象限に現れます。マクロファージの活性化を評価するため、細胞をLPSで処理してM1活性化を誘導するか、またはIL 4で処理してM2活性化を誘導しました。活性化に伴い、未処理のM0と比較して、刺激後24時間におけるM1またはM2マクロファージのFSCAのシフトからわかるように、マクロファージのサイズが増大しました。刺激後、マクロファージの活性化に関連する表面マーカーについても解析を行いました。早期応答マーカーであるCD 69は刺激後5時間または24時間で評価し、CD 80およびCD 86マーカーは刺激後48時間に解析しました。ここに示すように、刺激されたマクロファージにおいて表面CD 69、CD 80、およびCD 86の発現増加が認められ、これによりマクロファージの古典的活性化および代替活性化を評価しました。LPSまたはIL-4で24時間刺激した細胞を回収し、ここに示すように定量リアルタイムPCRによる解析のために全RNAを抽出しました。未処理のマクロファージと比較して、M2マクロファージではarginase 1およびPPAR gammaの発現上昇が検出されました。一方、M1マクロファージでは、炎症性サイトカインであるinterleukin 1 betaおよびTNF alphaが増加しました。LPSによるNF kappa Bパスウェイの活性化を評価するため、ここに示すように、P65およびリン酸化P65に対する抗体を用いてウェスタンブロット解析を行いました。LPS処理を行うことで、リン酸化P65に対するより強いバンドが認められます。以上のデータは、骨髄由来マクロファージがM1またはM2刺激に対して極性化した活性化応答を示すことを示唆しています。このビデオを視聴することで、骨髄由来マクロファージの作製方法と、それに続く極性化活性化解析について十分に理解できるはずです。この手順を試みる際は、応答性をテストする前に、分化したマクロファージの純度を評価することが重要であるという点を忘れないでください。この手順に続き、遺伝子の一過性 transfection や SHRA などの方法を行うことで、「マクロファージの活性化調節にどの遺伝子が関与しているか」といったさらなる疑問に対する検討が可能です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

マクロファージは、多くの組織の恒常性と病理学の中心的な役割を果たしています。ここで紹介するプロトコルは、マクロファージを枯渇させるための方法について説明します...

マウスのマクロファージの枯渇と再構成

このビデオでは、末梢血由来の単球をM1またはM2マクロファージに分化および分極させる手順を示します。顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、リポ多糖、およびインターフェロン-γとのインキュベーションは炎症誘発性M1マクロファージを産生し、マクロファージコロニー刺激因子およびインターロイキン-4とのインキュベーションは抗炎症性M2マクロファージ産生を誘導します。...

単球由来細胞のマクロファージ様細胞への分化と分極

単球由来のマクロファージは自然免疫系の重要な細胞である。ここでは、使用して簡単に説明する...

不定冠詞<em&gt;インビトロ</emヒトマクロファージの分化と偏光の不均一性を研究するために&gt;モデル

私たちは、ヒトマクロファージの生成のための簡単​​かつ効率的なプロトコルを提示する。バフィーコートは、二重密度勾配遠心分離によって処理され、単離された単球は、次いで、テフロンコーティングした細胞培養バッグ中でマクロファージに分化される。これは、マクロファージ収量を最大化し、その後の実験のために細胞の回収を容易にします。...

ダブル勾配遠心、テフロンコーティングされた細胞培養バッグ中のマクロファージへの分化によるヒト単球の単離

代謝リプログラミングは、M1およびM2マクロファージの分極のための特性的かつ前提条件です。この原稿では、マウス骨髄由来マクロファージにおける解糖系とミトコンドリア機能の基本パラメータを測定するためのアッセイについて説明します。このツールは、特定の要因がマクロファージの代謝と表現型にどのように影響するかを調査するために適用できます。...

リアルタイム細胞外フラックス分析を用いた偏光M1、M2の骨髄由来マクロファージの代謝特性評価

人間の大食細胞のプロテオーム署名を取得し、これをマクロファージ偏波に低酸素環境の影響の定量に適用するためのプロトコルを提案します。...

低酸素環境下におけるヒトのマクロファージ偏光のプロテオーム解析

このプロトコルは、ヒトM1-またはM2偏光マクロファージにおける 結核...

ヒト単球由来M1とM2の分極化と 結核 菌感染時のフローサイトメトリーによる解析

M2様腫瘍関連マクロファージ(TAM)は、がんにおける腫瘍の進行および予後不良に関連している。このプロトコルは、14日以内にTHP-1単球様細胞をM2様マクロファージに再現的に分化し、偏光するための詳細なガイドとして機能します。このモデルは、腫瘍微小環境内におけるTAMの抗炎症効果を調べる基礎となる。...

ヒト単球様THP-1白血病細胞株を用いたM2様表現型へのマクロファージ分化と分極化

本プロトコールは、マウスからの骨髄由来マクロファージの単離および培養について記載している。...

マウス由来骨髄由来マクロファージの単離と培養

ここでは、 in vitroでのインプラント表面の免疫調節能力を評価するための詳細なプロトコルを提示し、現在のプロトコルの信頼性と再現性を向上させ、さらなる研究を促進することを目的としています。血中単球由来マクロファージを用いて分泌性サイトカインプロファイル、mRNA発現、細胞表面マーカーをモニターし、チタン上に培養されたマクロファージの分極を調べました。...

インプラント表面上のM1およびM2ヒト単球由来マクロファージの分極と特性評価 

学ぶマクロファージ分極の調査法。マウス骨髄由来細胞を培養し、LPSまたはIL-4刺激でM1/M2に分極させ、フローサイトメトリーとリアルタイムPCRで活性化応答を解析します。この手法は免疫応答の理解に有用です。

骨髄由来マクロファージを用いたマクロファージ分極の調査

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