Name: 骨髄由来マクロファージを用いたマクロファージ分極の調査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学ぶマクロファージ分極の調査法。マウス骨髄由来細胞を培養し、LPSまたはIL-4刺激でM1/M2に分極させ、フローサイトメトリーとリアルタイムPCRで活性化応答を解析します。この手法は免疫応答の理解に有用です。

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この作品は、米国心臓協会（博士Beiyan周にBGIA 7850037）によってサポートされていました。

1。骨髄細胞の単離<ol><li> 6-8週齢のマウスからの大腿骨と脛骨の骨を分離し、髪を洗い流した後、骨を開いてカット。 </li><li>冷PBS +2％の熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）（3-5 ML /マウス）に骨髄を洗い流すために21G針とを10mlのシリンジを使用してください。 </li><li>細胞を解離するために21G針を4〜6回を通して骨髄を渡します。 </li><li>細胞塊、骨、毛髪および他の細胞/組織を除去するために70μmのセルストレーナーを通して細胞を渡します。 </li><li> NH 4 Cl溶液（0.8％NH 4 Cl溶液、STEMCELL技術）の3つのボリュームを追加し、赤血球を除去するために10分間氷上でインキュベートする。 </li><li> 4℃で5分間500 xgで細胞をスピンダウン</li><li>冷PBS +2％FBS（20〜50ミリリットル、細胞の量に依存する）で細胞ペレットを再懸濁します。 </li></ol> 2。誘導BMDM形成<ol><li> BMDM成長培地（2×10 6細胞/ mのに孤立した骨髄細胞を再懸濁しL）。 </li></ol> BMDM成長培地： イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）+ 10％FBS + 15％、濾過（0.2μmの）L-929細胞（ATCC、CCL-1）培養上清（単球コロニー刺激因子、M-CSFを含む）または10 ngの/ mlのM -CSF。 注：L-929細胞上清は、M-CSF 18が含まれています。 5 X 10 5 L-929細胞は6-7日間T75センチ2フラスコに播種され、馴化培地の効果的活動を確保するために、馴化培地は、使用前にフィルター0.45μmの収集と渡されます。培地のアリコートを1〜2ヶ月のためにすぐに使用されるか、または-80°Cに保存することができます。 <ol start="2"><li> 6または12ウェル組織培養プレート（実験デザインに応じて）（コーニングコスター）におけるシード細胞。 </li><li> 3日目に新鮮BMDM増殖培地を変更します。 </li><li> 7日目に、成熟BMDMの形成は、フローサイトメトリー分析を用いて評価されると蛍光体結合抗体の、CD11b及びF4/80を発現する細胞を検出する。 </li></ol> 3。 BMDM偏アクティベ<ol><li> 7日目に、新鮮な刺激培地に変更：M1活性化のために、IMDM、50 ngの/ mlのIFNγと10％FBS、100 ngの/ mlのLPSまたは100 ngの/ mlのLPSを含む使用し、M2活性化のために、と10％FBSを含むIMDMを使用10 ngの/ mlのIL-4および/または10 ngの/ mlのIL-13。 </li><li>暖かい0.05％トリプシンを用いて皿からそれらを取り外すことによって刺激さBMDMsを集め、PBS、10％FBSを含有する細胞を2回洗浄した。 </li></ol> 注：差別、0.05％トリプシン溶液（0.48 mMのEDTA、Invitrogen社を含む）または2-5 mMのEDTAのCaおよびMgを含まないPBSまたはハンクス平衡緩衝液（HBSS）の後に成熟したマクロファージをデタッチし、再懸濁するために使用することができます。トリプシンを含む消化媒体を使用する場合、細胞はシュルの損失を避けるために10分未満、37°C​​で処理する顔はオーバー消化のためにタンパク質。 <ol start="3"><li>標準的なフローサイトメトリー染色手順を使用して、様々な時点でのCD11b、F4/80、CD11cは、CD206、CD69、CD80またはCD86を含む細胞表面抗原の発現を検出する抗体を使用。 </li><li>定量RT-PCRを用いたIL-1β、TNF-αおよびIL-6（M1の活性化）、またはIL-10、IL-13、arginase1およびPPARγ（M2活性化）を含む活性化M1とM2マクロファージの特徴的な遺伝子の発現を決定する。ウエスタンブロット分析によってM1またはM2マクロファージの活性化に関与する細胞のシグナル伝達経路の活性化を決定します。 </li></ol>

<ol><li>Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microrna+circuitry+links+macrophage+polarization+to+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis.</a> Circulation. , (2012).</li>
<li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+induces+a+phenotypic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).</li>
<li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+death+and+defective+inflammation+resolution+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).</li>
<li>Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-specific+pparg+controls+alternative+activation+and+improves+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance.</a> Nature. 447, 1116-1120 (2007).</li>
<li>Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+m2+activation+of+kupffer+cells+by+ppard+ameliorates+obesity-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance.</a> Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).</li>
<li>Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+metabolism+and+pgc-1%5Bbeta%5D+attenuate+macrophage-mediated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation.</a> Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).</li>
<li>Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ikk-b+links+inflammation+to+obesity-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance.</a> Nat. Med. 11, 191-198 (2005).</li>
<li>Saberi, M., Woods, N. -B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+cell-specific+deletion+of+toll-like+receptor+4+ameliorates+hepatic+and+adipose+tissue+insulin+resistance+in+high-fat-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice.</a> Cell Metab. 10, 419-429 (2009).</li>
<li>Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte-derived+th2+cytokines+and+myeloid+ppard+regulate+macrophage+polarization+and+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity.</a> Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).</li>
<li>Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pparg+activation+primes+human+monocytes+into+alternative+m2+macrophages+with+anti-inflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties.</a> Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).</li>
<li>Bronte, V., Zanovello, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+immune+responses+by+l-arginine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of immune responses by l-arginine metabolism.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).</li>
<li>Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+regulator+of+macrophage+activation%3A+Mir-223+in+obesity-associated+adipose+tissue+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation.</a> Circulation. 125, 2892-2903 (2012).</li>
<li>Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+and+ultrastructural+analysis+of+alveolar+macrophage+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation.</a> J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).</li>
<li>Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+4+potently+enhances+murine+macrophage+mannose+receptor+activity%3A+A+marker+of+alternative+immunologic+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation.</a> J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).</li>
<li>Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+murine+mononuclear+phagocyte+inflammatory+products+by+macrophage+colony-stimulating+factor.+Lack+of+il-1+and+prostaglandin+e2+production+and+generation+of+a+specific+il-1+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor.</a> J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).</li>
<li>Biswas, S. K., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+interaction+with+lymphocyte+subsets%3A+Cancer+as+a+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm.</a> Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+polarization%3A+In+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されていない。

ここでは、骨髄前駆細胞由来のマクロファージの活性化を誘導するためのシンプルかつインビトロで容易に適応手順を報告する。この手順は、マクロファージの偏光を担当するメカニズムの研究のために使用することができる。成熟したマクロファージの純度は、このプロトコルの平均値を95から99までパーセントを用いて得られ、追加の精製法が必要とされない。マクロファージ分極の文脈における利益の特定の遺伝子の機能を調べるために、異所性発現または遺伝子特異的ノックダウンは、7日目に細胞のトランスフェクション後に行うことができる。このプロトコルは、また形成、成熟およびマクロファージの表現型に影響を及ぼす特定の要因や遺伝子の影響を調査するために7日間培養ウィンドウを提供します。 活性化マクロファージは、様々な刺激3、9、19に対応して大きな可塑性を持つ複雑な細胞および分子のプロファイルを表示します。のためにしかしながら、活性化プロファイルが完全に重なっていない、例えば、LPSは、IFNγまたは腫瘍壊死因子（TNF）およびIL-4およびIL-13 M2活性化を刺激し、両方の存在...

古典的な炎症反応とは異なる、組織に浸潤したマクロファージは、多くの場合、宿主組織の生理機能を1-8の調節に重要な役割を果たしている偏光活性状態を表示します。刺激により、マクロファージの活性化は、古典的な（M1）および代替（M2）の活性化2,4,9に分類することができる。 M1マクロファージの活性化は、例えばTNF-αとし、炎症性サイトカインの産生をもたらす、Toll様受容体（TLR）および核因子カッパB（NFκB）/ c-Jun N末端キナーゼ1（JNK1）の活性化に依存するIL- 1β、例えば、窒化酸化物（NO）10、11などの反応性酸素種の産生増加をもたらすことのiNOSの活性化。対照的に、M2マクロファージ活性化リクルートPPARγ、PPARδ、またはIL-4-STAT6経路は、代替マンノース受容体CD206のアップレギュレーションと関連付けられ、抗炎症性（M2）活性化、およびアルギナーゼ1（Arg1の）6,12につながる- 14 &lt;/&gt;（商標）。 骨髄由来マクロファージ（BMDM）は活性化マクロファージ15の偏光を制御するメカニズムを理解するためのin vitroモデル理想を提示する。 M2マクロファージの偏光IL-4および/またはIL-13によって誘導することができるながら具体的には、M1マクロファージの活性化は、リポ多糖（LPS）刺激によって誘導することができる。成熟した骨髄由来マクロファージおよび活性化マクロファージがCD11bを、F4/80、CD11cは、CD206、CD69、CD80およびCD86 9、16、17を含む表面抗原の発現についてフローサイトメトリー分析によって同定することができる。また、マクロファージ偏光に関連付けられたシグナル伝達経路のサイトカイン産生および細胞の変化は、それぞれ、定量的RT-PCRおよびウエスタンブロットによって測定することができる。要約すると、マウスの骨髄由来マクロファージは、in vitroでマクロファージ分極を研究するため、関連するモデルとしての役割を果たすことができます。

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30259.01</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Invitrogen</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>マウス GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>StemCell Technologies</td><td>7850</td><td></td></tr><tr><td>L-929</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m細胞ストレーナー</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>10 x PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>AP-9009-10</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス CD11b-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス F4/80-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4801-81</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス CD69-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0691-81</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス CD86-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0862-81</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ素プロピジウム</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr></tbody></table>

骨髄由来マクロファージを用いたマクロファージ分極の調査

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

記事では、マクロファージ分極を調査するためのin vitroモデルで容易に簡単に適応を説明しています。 GM-CSF/M-CSFの存在下で、骨髄からの造血幹/前駆細胞は、M1またはM2の刺激に続いて、単球分化に向けられる。活性化状態は、細胞表面抗原、遺伝子発現および細胞シグナル伝達経路の変化によって追跡することができる。

BMDM生成手順の概略的な説明は、（ 図1）提示される。彼らはCD11bを+ F4/80 +細胞の95〜99％（ 図2）を表す場合、成熟マクロファージの高純度は、7日目に観察することができる。偏マクロファージは、フローサイトメトリー分析を行ったCD11b、F4/80、CD11c陽性およびCD206に対する抗体を用いて調べることができる。 図3に示すように、M1マクロファージとして検出されたCD11b + F4/80 +のCD11c + CD206細胞（Q2）、M2マクロファージのCD11b +であるF4/80 +のCD11c-CD206 +細胞（Q4）。 図に示されているように：BMDMアクティベーションステータスが増加し、細胞サイズ（ 図4A、FSCイン右シフト）およびマクロファージの表面抗原CD69、CD80、またはCD86の増加豊富（のCD11b + F4/80 +門）で確認することができる4B。サイトカイン産生、遺伝子発現およ...

記事は容易に簡単に適応を説明<em&gt; in vitroで</emマクロファージ分極を調査する&gt;モデル。 GM-CSF/M-CSFの存在下で、骨髄からの造血幹/前駆細胞は、M1またはM2の刺激に続いて、単球分化に向けられる。活性化状態は、細胞表面抗原、遺伝子発現および細胞シグナル伝達経路の変化によって追跡することができる。

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

分極化解析のための骨髄由来マクロファージを生成します。マウスから大腿骨と脛骨を単離し、骨髄細胞を回収します。その後、成長因子を含む培地で細胞を培養し、マクロファージへの分化を誘導します。7日間の培養後、骨髄由来マクロファージにさまざまな刺激を与え、マクロファージを極性化させます。活性化反応をフローサイトメトリー、リアルタイムPCR、およびウェスタンブロット法で解析した結果、M1またはM2のいずれかに極性化した活性化反応を示す、高純度の骨髄由来マクロファージが得られます。刺激剤を用いて解析します。この手法は、インスリン抵抗性やCROなどの多様な関連疾患の治療や診断に寄与することが期待されます。なぜなら、T細胞浸潤マクロファージがこれらの状況において主要な役割を果たすためです。骨髄細胞の採取には一定の困難が伴い、マクロファージ分化を誘導するための十分な研究用細胞調製を得るためには回収率が極めて重要であるため、本手法を視覚的に提示することは重要です。滅菌フード内で作業を行います。組織培養皿に採取した、6〜8週齢のマウスから分離した大腿骨および脛骨を用いて本プロトコルを開始します。骨をPBSで洗浄し、ピンセットで骨を保持しながら、骨の両端をハサミで切り開きます。この際、切りすぎないように注意してください。冷PBSに2%の熱不活化FBSを添加したものを入れた10 mLシリンジに21〜23ゲージの針を装着し、骨の一端に刺入します。プランジャーを押し、骨髄を新しい組織培養ディッシュに洗い出します。次に、細胞を分散させるため、同じ針を用いて骨髄を4〜6回繰り返し通過させます。次に、細胞を70 micronのセルストレーナーに注ぎ、細胞の凝集塊、骨、毛、およびその他の細胞や組織を除去します。ろ過液を50 milliliterのコニカルチューブに回収します。溶液がフィルターを通過した後、ろ過液に3倍量の0.8% ammonium chlorideを加え、氷上で10分間インキュベートします。インキュベーション後、赤血球を除去するため、細胞を4°Cで500 ×gで5分間遠心分離します。遠心後、細胞ペレットを2%FBSを含む冷PBS 20～50 mLで再懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。細胞を4°Cで500 ×g、5分間遠心分離します。上清を捨てた後、プロトコルの次項に記載されている方法でBMDMの分化誘導を行います。BMDMを分化誘導するために、単離した骨髄細胞を2 × 10⁶ cells/mLの濃度でBMDM増殖培地に再懸濁します。1 mLあたり6×10⁶個の細胞を調整し、6ウェルまたは12ウェルの組織培養プレートの各ウェルに1〜2×10⁶個ずつ播種し、37 °Cでインキュベートします。この濃度で播種することで、3日後のフローサイトメトリーに向けた細胞の回

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