骨髄由来マクロファージを用いたマクロファージ分極の調査

分極解析のための骨髄由来マクロファージの生成。マウスから大腿骨と脛骨を単離し、骨髄細胞を採取します。次に、細胞を成長因子を含む培地で培養し、マクロファージ形成を誘導します。

7日間の培養後、骨髄由来マクロファージを種々の刺激と分極マクロファージで治療します。活性化応答はフローサイトメトリーリアルタイムPCRによって解析され、ウェスタンブロス解析の結果は、M1またはM twoのいずれかに分極した活性化応答を有する高純度の骨髄由来マクロファージを示す結果が得られる。刺激は嘘をつきます。

この技術の意味するところは、インスリン抵抗性やCROsを含む多様性関連疾患の治療または診断に向けて立っていることです。なぜなら、T浸潤マクロファージは、この文脈で主要なプレーヤーであり、骨髄細胞の加速がやや困難であり、収量がマクロファージ形成を誘導するための十分な研究細胞調製を得るために重要であるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です無菌フードで働く。このプロトコルは、組織培養皿で6〜8週齢のマウスから分離された大腿骨と脛骨から開始します。PBSで骨をすすぎ、ハサミで骨の両端を切り開き、鉗子で骨を押さえながら取りすぎないように注意します。

骨の一方の端に2%加熱活性化FBSを含む冷たいPBSを含む10ミリリットルの注射器で21 on 23ゲージの針を挿入します。プランジャーを押して、骨髄を新しい組織培養皿に洗い流します。次に、骨髄を同じ針に4〜6回通して細胞を解離させます。

次に、細胞を70ミクロンのセルストレーナーに注ぎ、細胞の塊、骨、髪の毛、その他の細胞や組織を取り除きます。50ミリリットルの円錐形チューブに流れを集めます。溶液がフィルターを通過したら、0.8%塩化アンモニウムを3容量加え、氷上で10分間インキュベー

インキュベーション後に赤血球を除去するには、細胞をGの500倍で摂氏4度で5分間スピンダウンします。スピン後、細胞ペレットを2%FBSを含む20〜50ミリリットルの冷たいPBSに再懸濁します。ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントします。

細胞をGの500倍で摂氏4度で5分間スピンダウンします。サピネートを注ぎ落とした後。プロトコルの次のセクションに記載されているようにBMDM形成を誘導するために進む BMDM形成Resusを誘導するために、BMDM成長培地中の単離された骨髄細胞を2倍の濃度で懸濁する。

1ミリリットルあたり6個の細胞を10倍から2倍に6個の細胞を6ウェルまたは12ウェルの組織培養プレートの各ウェルに中心に置き、細胞を摂氏37度でインキュベートする。この濃度で播種すると、3日後のフローサイトメトリーの剥離が容易になります。7日目に新鮮なBMDM成長培地に変更します。

成熟BMDMの形成は、フローサイトメトリー分析とフルオロル標識抗体を使用して評価され、CD 11、B、およびF four 80を発現する細胞を検出します。成熟BMDMの形成を確認した後、M1活性化のための10%FBSとLPSまたはLPSとインターフェロンガンマ、またはM2活性化のためのIL4またはIL13を含む新鮮なis coveの修飾ドエコーの培地に変更します。24時間後に細胞を摂氏37度でインキュベー

刺激を受けたb MDMを皿から取り外して収集します。これを行うには、細胞から培地を取り除き、カルシウムやマグネシウムを含まないPBSで洗浄します。次に、0.48ミリモルを含む温かい0.05%トリプシンを加え、EDTAを摂氏37度で10分以内インキュベートして、過剰消化による表面タンパク質の損失を防ぎます。

次に、10%FBSを含むPBSで細胞を2回洗浄し、1.2ミリリットルのサンプルチューブに移します。抗体を使用して、CD 11、BF、four 80、CD 11、C、CD 2 0 6、CD 69、CD 80、またはCD 86などの細胞表面抗原の発現をさまざまな時点で検出します。定量PCRを用いた標準的なフローサイトメトリー染色手順を使用。

IL 1、β、TNF α、IL 6 の発現レベルを決定して M1 の活性化を評価するか、IL 10、IL 13、アルギナーゼ 1、および PPAR γ の発現レベルを決定して M 2 の活性化を評価します。最後に、ウェスタンブロッティングを実施して、M1またはM 2マクロファージの活性化に関与する細胞シグナル伝達経路の活性化を評価し、成熟BMDMの純度を評価します。誘導フローに続いて、CD 11 BF four 80、CD 11 CおよびCD 2 0 6 B.MDMに対する抗体を用いてサイトメトリー解析を行い、最初にFSCおよびSSCにゲートしてDRIおよびコンジュゲートを除去した。

成熟b MDMは、このプロットの右上に見られるCD 11 B陽性F 4 80陽性の亜集団として定義され、マクロファージの分極を評価するためにゲート集団の95〜99%を妥協しました。さらなる分析を行った。まず、組織浸潤したマクロファージ(CD 11 B陽性F 4 80陽性細胞)を同定するためにゲーティングを行った。

これらのM1マクロファージのうち、CD 11 C陽性およびCD 2 0 6陰性は象限2に現れますが、M 2マクロファージは、CD 11 C陰性およびCD 2 0 6陽性である象限4に現れます。マクロファージの活性化を評価するために、細胞をLPSとインキュベートしてM1の活性化を誘導するか、IL 4でM2の活性化をインキュベートしました。活性化すると、マクロファージのサイズは、刺激後24時間でのM1またはM 2つのマクロファージのFSCAのシフトによって証明されるように、未治療のMゼロと比較して増加しました。

マクロファージの活性化に関連する表面マーカーも刺激後に分析しました。早期応答マーカーCD 69は、刺激の5時間後または24時間後に評価され、CD 80およびCD 86マーカーは、刺激の48時間後に分析されました。ここに示されているように、表面CD69、CD80、およびCD86の存在量の増加は、マクロファージの古典的および代替的な活性化を評価するために、刺激されたマクロファージで見られました。

LPSまたはILのいずれかで4回24時間刺激した患者を採取し、ここに示すように定量的リアルタイムPCRによる解析のために全RNAを抽出しました。アルギナーゼ1およびPPARガンマ発現の上昇は、炎症誘発性サイトカインの未治療のマクロファージ発現と比較して、M個のマクロファージで検出されました。P65に対するLPS抗体によるNFκB経路の活性化を評価するために、M1マクロファージで増加したインターロイキン1ベータTNFアルファを、ここに示すようにウェスタンブロット分析で使用しました。

リン酸化P 65に対するより強いバンドは、LPS治療を受けることで見られます。まとめると、これらのデータは、M1またはM 2の刺激に対して分極した活性化応答を持つ骨髄由来のマクロファージを示しています。このビデオを見れば、骨髄由来マクロファージの生成方法と、それに続く偏光活性化分析の方法について十分に理解できるはずです。

この手順を試みる際には、分化したマクロファージの反応をテストする前に、その純度を評価することを忘れないでください。この手順に続いて、遺伝子の一過性トランスフェクションやSHRAのような方法を実行して、遺伝子がマクロファージの活性化の調節にどのように関与しているかなどの追加の質問に答えることができますか?