マイクロ流体チップの作製とインフルエンザを検出する方法

次の実験の全体的な目標は、マイクロ流体チップを使用してインフルエンザAウイルスを検出することです。まず、溶解バッファーを含むサンプルをSPEチャネルに通してウイルスを溶解し、RNAを抽出し、抽出したRNAをR-T-P-C-R試薬にロードし、逆転写チャネルを走らせてウイルスRNAをCDNAに変換します。次に、DNAを増幅するために混合物をPCRチャネルに流し、キャピラリー電気泳動からの蛍光シグナルに基づいてアンプリコンのサイズと濃度を示す結果が得られる。

この技術の主な利点は、生の患者サンプルを受け入れ、核酸抽出、精製、逆転写、増幅を1つのチップに統合していることです 2つのプラークを作成するには、約9グラムのXN Xペレットを金属板の中央に均等に分配し、摂氏198度の加熱プレスに5分間置きます。次に、さらに 5 分間、 2 、 500 PSI までゆっくりと圧力をかけます。次に、1つのプラークをエポキシ金型に1つのプラークを配置し、摂氏157度で10分間予熱し、さらに1000PSIにゆっくりと圧力をかけます。

次に、サーマルグローブを着用して、ホットプレスからプラークとカビを取り除き、次にプラークが冷える前にカビからプラークを取り除きます。エンボス加工されたチップに3つの穴を開けます(入口、廃棄物ポート、およびマイクロ流体チャネルの出口にそれぞれ1つずつ)。次に、チップをIPAで洗い、続いてRNAを取り除き、ダイアナの水で洗います。

チップを空気で乾燥させてチップを接着し、最初に摂氏131度で10分間予熱し、次に350PSIでさらに10分間プレスします。JB Weld Epoxyを使用して、入口廃棄物と出口ポートにナノポートを取り付け、15〜24時間別々に硬化させます。製造元の指示に従って、SPEチャネルを50マイクロリットルのRNAで洗い流し、続いて100マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水ですすぎます。

次に、SPEチャネルに4マイクロリットルの新たに調製したグラフト溶液をロードして、メタクリレートをUVオーブンで10分間インキュベートし、残留グラフト溶液を真空で除去します。蓋を閉めた状態でチューブを軽くたたいて、乾燥したマイクロスフィアペレットを砕きます。次に、調製したばかりのSPEカラム溶液100マイクロリットルを加え、ボルテックスで混合します。

4マイクロリットルのSPE溶液を、両側に2.5分間のUV照射により同じチャネル架橋にロードすると、不透明な白色重合SPEカラムが得られます。500マイクロリットルの100%メタノールでチャネルを洗浄し、余分な反応物とポリマー内の発熱性溶媒を洗い流します。チップの底面に2つの薄膜ヒーターを熱伝導性テープで取り付けます。

ヒーターの側面は、Dene持続時間のために幅の広いチャネルの端と位置合わせする必要があり、個別にひざまずく必要があることに注意してください、各チップテープのデッドエンドのオープンサイドチャネルを介してチップに5つの熱電対を配置します。熱電対の位置を固定するには、1本のチューブに96マイクロリットルの70%エタノールに4マイクロリットルの25XRNAセキュアを追加し、2本目のチューブに100%エタノールを追加します。また、300マイクロリットルのチャネルバッファーと316マイクロリットルの溶解バッファーを調製します。

溶液を摂氏60度で15分間加熱します。RNAを活性化し、次にマイクロ流体チャネルを平衡化します。チャネルバッファをSPEチャネルに0.8ミリリットル/時の流量で流します。

今度は37°CのVTMで素早い海賊テストサンプル。解凍後すぐにサンプルを取り出します。サンプルを 13, 000 RPM で 10 分間遠心分離します。

上清100マイクロリットルを溶解緩衝液300マイクロリットルに移し、1マイクロリットルキャリアにつき1マイクログラムの6マイクロリットルを加え、RNAボルテックスを混合する。その後、5秒間回転させ、ライセート全体をルアーロック1CCシリンジにロードします。ライセートをSPEチャネルに0.8ミリリットル/時の流速で流します。

次に、SPEチャネルを100マイクロリットルの70%エタノールで洗浄し、続いて100マイクロリットルの100%エタノールを1時間あたり1ミリリットルで洗浄します。空のシリンジを0.5ミリリットルのマークに置き、チャネルに空気を押し込んで1時間あたり1ミリリットルで乾燥させます。次に、67.5マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水をチャネルに流して、結合した核酸を1時間あたり0.5ミリリットルで溶出し、廃棄物ポートのナノポートから13.5マイクロリットルを収集します。

R-T-P-C-Rマスターの36.5マイクロリットルをロードします。廃棄物ポートのナノポートで混合し、テンプレートRNAと混合して50マイクロリットルのR-T-P-C-R反応を行います。次に、R-T-P-C-R混合物を穏やかな真空でRTチャネルにロードします。

ナノポートを閉じたフィッティングで密封します。ヒーター1に35ボルトを印加します。ヒーター1が摂氏50度で平衡化した後、試薬をRTチャネルに30分間保持します。

ヒーター1が摂氏95度で平衡化した後、試薬をRTチャネルに15分間保持します。次に、ヒーター1に27ボルト、ヒーターに50ボルト、ヒーターを平衡化するために2ボルトを印加し、1つは摂氏60度で、2つはヒーターを摂氏95度で印加します。試薬を毎分0.5マイクロリットルでPCRチャネルに押し込みます。

約20分後、試薬が蛇行チャネルの端に近づいたら、適切なサイズのピペッターとチップを使用して出口でPCR産物を回収し、Agilentの高感度DNA検査を行います。Agilent高感度DNAキットは、試験の30分前に冷蔵庫から取り出してください。バイオアナライザーの電源を入れ、2, 100エキスパートソフトウェアを開きます。

PCR産物を1マイクロリットルの検査用にロードし、Agilentプロトコルに従ってください。このワークフローでは、データを分析して記録します。患者の鼻咽頭サンプルを溶解バッファーと混合し、チップに塗布します。

このチップを動かし、市販のキャピラリー電気泳動チップを用いてインフルエンザウイルスのPCR産物を赤色にします。各患者の検体に含まれるインフルエンザウイルスの量が異なるため、PCR産物の最終濃度は異なります。良好な結果を得るには、35 と 10、380 塩基ペアのラダー ピークをクリアするための低ノイズと、正のサンプルの設計製品サイズ 107 塩基ペアの 1 つの製品ピークが必要です。

このビデオを見れば、インフルエンザA型ウイルスを検出するためのマイクロ流体チップの製造方法と実行方法について十分に理解できるはずです。