マイクロ流体チップの作製とインフルエンザを検出する方法

本実験の目的は、マイクロ流体チップを用いてインフルエンザAウイルスを検出することです。まず、ライシスバッファーを含む試料をSPEチャネルに流してウイルスを溶解し、RNAを抽出します。次に、抽出したRNAをRT-PCR試薬に添加し、逆転写チャネルを流してウイルスのRNAをcDNAに変換します。続いて、この混合物をPCRチャネルに流してDNAを増幅させます。最終的に、キャピラリー電気泳動による蛍光信号に基づき、アンプリコンのサイズと濃度を示す結果が得られます。

この技術の主な利点は、患者の未処理サンプルをそのまま使用でき、核酸抽出、精製、逆転写、および増幅を単一のチップに統合している点です。2枚のプラークを作成するには、約9 gのXN Xペレットを金属プレートの中央に均等に配置し、198 °Cに加熱したプレス機に5分間置きます。その後、ゆっくりと2,500 PSIまで圧力をかけ、さらに5分間保持します。次に、1枚のプラークを157 °Cで10分間予熱したエポキシ型の上に配置し、ゆっくりと1,000 PSIまで圧力をかけてさらに10分間保持します。

次に、耐熱手袋を着用して、ホットプレスからプレートと金型を取り出し、冷却される前に金型からプレートを取り外します。エンボス加工されたチップの、マイクロ流路の入口、廃棄ポート、および出口のそれぞれに、3つの穴をドリルで開けます。その後、チップをIPAで洗浄し、続いてRNase-free waterおよび超純水で洗浄します。

チップをエアで乾燥させます。チップを接合するために、まず131 °Cで10分間予熱し、次に350 PSIでさらに10分間加圧します。JB Weldエポキシを使用して、入口廃棄ポートと出口ポートにナノポートを個別に取り付け、15〜24時間硬化させます。製造元の指示に従い、SPEチャネルを50 µLのRNAs awayでリンスした後、100 µLのヌクレアーゼフリーウォーターでリンスします。

次に、メタクリレートを架橋させるため、調製したばかりのグラフト化溶液 4 µL をSPEチャネルにロードし、UVオーブンで10分間インキュベートした後、真空を用いて残留したグラフト化溶液を除去します。蓋を閉めた状態でチューブをタッピングし、乾燥したマイクロスフェアペレットを分散させます。その後、調製したばかりのSPEカラム溶液 100 µL を加え、ボルテックスで混合します。

4 µLのSPE溶液をチャネルに導入し、UV照射により両側から2.5分間架橋させ、不透明な白色の重合SPEカラムを形成させます。チャネルを500 µLの100% methanolで洗浄し、過剰な反応物およびポリマー内部の熱原性溶媒を洗い流します。熱伝導テープを用いて、チップの底部に2つの薄膜ヒーターを取り付けます。

ヒーターの側面をワイドチャネルの端に合わせる必要があることに注意してください。Dene duration（Dene持続時間）向けに、各チップテープの行き止まりとなったオープンサイドチャネルを通じて、5本の熱電対をチップ内に個別に配置します。熱電対の位置を固定するため、1つのチューブに 25 XRNA secure 4 µL と 70% ethanol 96 µL を加え、2つ目のチューブに 100% ethanol を加えます。また、チャネルバッファー 300 µL と溶解バッファー 316 µL を準備します。

溶液を60 °Cで15分間加熱します。これはRNA secureを活性化し、マイクロ流路を平衡化するためです。0.8 mL/hの流速で、SPEチャネルにチャネルバッファーを流します。

次に、37 °CのVTM中にあるfavaテストサンプルを迅速に準備します。サンプルが融解しだい、取り出してください。サンプルを13,000 RPMで10分間遠心分離します。

上清100 µLを300 µLのライシスバッファーに移し、1 µg/µLのキャリアRNAを6 µL加えてボルテックスで混合します。その後、5秒間遠心分離し、溶解液全量をルアーロック式1 ccシリンジに充填します。流速0.8 mL/hで、溶解液をSPEチャネルに通します。

次に、SPEチャネルを70% ethanol 100 µLで洗浄し、続いて100% ethanol 100 µLを1 mL/hの流速で流します。空のシリンジを0.5 mLの目盛りに合わせ、1 mL/hで空気をチャネルに送り込んで乾燥させます。ここで、nuclease free water 67.5 µLを0.5 mL/hの流速でチャネルに流して結合した核酸を溶出し、廃棄ポートのナノポートから13.5 µLを回収します。

R-T-P-C-Rマスターミックスを36.5 µLロードします。ウェストポートにあるナノポート内で混合し、テンプレートRNAと混ぜ合わせて、合計50 µLのR-T-P-C-R反応液とします。その後、緩やかな真空吸引により、R-T-P-C-R混合液をRTチャネルにロードします。

クローズドフィッティングでナノポートを密封します。ヒーター1に35 Vを印加します。ヒーター1が50 °Cで平衡状態に達した後、試薬をRTチャンネル内で30分間保持します。

ヒーター1が95°Cで平衡状態に達した後、試薬をRTチャンネルに15分間保持します。次に、ヒーター1に27V、ヒーター2に50Vを印加し、ヒーター1を60°Cに、ヒーター2を95°Cに平衡化させます。その後、試薬を0.5 µL/minの速度でPCRチャンネルに注入します。

約20分後、試薬がサーペンタインチャネルの終端に到達したら、Agilent高感度DNAテストに適したサイズのピペッターとチップを用いて、出口からPCR産物を回収します。テストの30分前に、Agilent高感度DNAキットを冷蔵庫から出しておきます。バイオアナライザの電源を入れ、2,100 Expertソフトウェアを起動します。

テスト用のPCR産物を1 µLロードし、Agilentのプロトコルに従います。このワークフローでデータを分析し、記録します。患者の鼻咽頭検体を溶解バッファーと混合し、チップに適用します。

市販のキャピラリー電気泳動チップを用いてチップを走らせ、インフルエンザウイルスのPCR産物を検出します。患者ごとの検体に含まれるインフルエンザウイルスの量が異なるため、最終的なPCR産物の濃度は変動します。良好な結果とは、ノイズが少なく、35 bpおよび10、380 bpに明確なラダーピークが認められ、陽性検体において設計上の産物サイズである107 bpに単一の産物ピークが認められる状態を指します。

このビデオを視聴することで、インフルエンザウイルスの検出に向けたマイクロ流体チップの作製および運用方法について十分に理解することができます。