Name: 齧歯中枢神経系への薬物の直接脳室内デリバリー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: 学ぶマウスの脳室内への薬物投与法。カテーテル埋め込みとボーラス注射の2手法を解説し、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの中枢神経系薬物デリバリー技術を習得できます。

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我々はASOSと研究室に供給するための全体としてICVボーラスの手術に関連するだけでなく、イシス医薬品のアドバイスを提供するためにイシス医薬品からぞんざいメイザーに感謝したいと思います。さらに、我々はこの記事のレビューにキャリーシェイナーに感謝したいと思います。 TMMとSLDはNIH助成P50AG005681、K08NS074194、そしてR01NS078398によってサポートされています。

下記のプロトコルは、セントルイスにあるワシントン大学の制度動物実験委員会によって承認され、実験動物の使用のための健康ガイドラインの国立研究所に準拠しているされています。これは手術を行うのは初めてであるならば、我々は14を開始する前に、導入などの齧歯類の手術でJoveの記事を見てお勧めします。 ASOSは、浸透圧ポンプの注入および単一ICVボーラス注入の両方を通ってマウスCNSに送達することができる。このため、以下に詳述する手順は、2つのセグメントに分割される。それぞれの方法の長所と短所は、ディスカッションセクションで上触れることになります。プロトコルで使用される座標は、成人C57BL6とB6C3マウス用です。対応するラット座標は表1に見出すことができる。 ALZET浸透圧ポンプ 1。アルゼット浸透圧ポンプの調製<ol><li>無菌DRAPを置くeと直接無菌維持するためには何も触れないように注意しながら、慎重にその上に次の項目をドロップ：浸透圧ポンプ（S）、フローモジュレータ（S）、1 mlの滅菌シリンジ（S）、メスの刃、およびチューブのセクションを（チューブ= 5ポンプの1個）。 14日、28日、および42日（ 図2A）：マウスの場合は、ポンプのための3つのオプションがあります。 </li><li>キャップを取ると15〜20ミリリットル食塩水で滅菌50ミリリットルコニカルチューブを埋める。最大6組み立てポンプはコニカルチューブ毎に添加することができます。 </li><li> 100％エタノールでP60ペトリ皿を埋める。エタノールへのカテーテルの適切な数を追加します。マウスについては、カテーテルの長さは、2.5 mmである。 </li><li>必要に応じて1.5のような多くのmlのエッペンドルフチュー​​ブに各ASOをフィルタリング。とチューブを埋めるために無菌の0.9％生理食塩水で満たされたエッペンドルフチュー​​ブを含む。 </li><li>すべてが準備されると、滅菌手袋を置く。無菌ではない何かに触れていないことを確認してください。必要に応じて手袋を変更してください。 </li><li>各ASOが使用されるために1mlのシリンジを埋める上部の穴に針を入れ、ゆっくりと過剰漏れまで記入してくださいとloadpumps。ポンプのすべてが満たされるまで継続する。 </li><li>フローモジュレータをキャップを取るとポンプに挿入。 3〜5ミリメ​​ートルギャップを残して、ほぼすべての中で道の流れが変調器を押してください。 </li><li>手術用メスの刃を使用し、5等しいセグメントにチューブの各部分をカット。チューブの一枚を取り、1ミリリットルのシリンジを用いて滅菌した生理食塩水でいっぱいにし、チューブの一端に流入変調器の上部を挿入します。その後、エタノールからカニューレを取ると、チューブのもう一方の端に接続します。ポンプが完全に組み立てられている。 </li><li>プライミング用食塩水で滅菌50ミリリットルコニカルチューブに完全に組み立てられたポンプを配置します。プライミングは、薬物送達を開始するために流体に浸るだけでなく、適切な温度に来るようにポンプを可能にします。プライミング時間：14日ポンプ：4-6時間、28日間ポンプ：40時間、42日ポンプ：60時間。ポンプの組み立てが完了したら、きれいにコニカルチューブと場所をキャップ37℃手術までC水浴。 </li></ol> 2。プレ外科手順<ol><li>エリアを殺菌し、無菌のフィールドを作成するテーブルトップとstereotaxに滅菌ドレープを置くために70％エタノールですべてを拭う。全体の手術を通して滅菌野に留意することが重要です。ビーズ滅菌、加熱パッド、ライト、デジタル読み出し、及び酸素/イソフルランシステム（ 図1）は、次の電源をオンにします。 </li><li>我々は日常的にそうであるように、単一の手術や手術のバッチ全体のどちらかをやっている場合、以下の項目が必要になります鉗子の1ペア、1湾曲した止血、小さなはさみの1組、小さな曲がっ鈍化はさみの1ペア、1ラットの骨のカッター、1ストレート止血、5-0ナイロン縫合糸、70％エタノールで1コニカルチューブ、95％エタノールで1円錐管、ヨウ素1コニカルチューブ、過酸化水素と1コニカルチューブ、滅菌綿棒のパッケージ、スーパーの1瓶のり、1チューブ抗生物質軟膏、眼1チューブ潤滑剤、および1電気シェーバー。 </li><li> 15秒のためにビーズ滅菌器にはさみ、鉗子、曲線止血の両方の対の先端を置きます。取り外し、70％エタノールに入れます。複数の外科手術を行う際に、動物の間で器具の先端を再滅菌する。 </li><li> 4％のイソフルランとO 2から0.4 L / minで、チャンバーに直接ガスの流れを回します。我々は麻酔の適切な量を提供していることを確認するために、少なくとも1つの年間キャリブレーション当社イソフルラン/酸素システムを持っている。チャンバー内にマウスを置き、呼吸が著しく遅くなるまで待ちます。マウスを取り外し、マウスは完全に無意識であることを確認するためにつま先のピンチを実行します。 </li><li>目の間で最大の肩の上から毛を剃る。マウスが目を覚ますが開始された場合は、マウスがつま先のピンチで確定、再び完全に無意識になるまで、チャンバー内に戻ってマウスを置きます。 stereotaxに麻酔マウスを置き、鼻の上にノーズコーンを押してください。歯や骨が壊れやすいように穏やかである。 </li><li>マウスを麻酔維持するstereotaxへのガスの流れを演出します。時折マウスは手術全体のつま先のピンチと完全に無意識であることを確認するためにチェックすることが重要です。耳の棒で頭を固定します。私たちは、側脳室を対象とするものの、完全にレベル頭蓋骨が原因心室の大きなサイズにする必要はありません、レベリング耳バーを好む。 </li><li>メンテナンスのために2.0％イソフルランレベルを下げます。それぞれの目の上に軽くたたくの眼軟膏。ビデオで見られるように首と頭のベースのみが露出されるように、マウスを上に滅菌ドレープを築く。次いで、剃毛領域の中心から開始しスワブ綿棒は、ヨウ素に浸した綿、続いて95％エタノールに浸した綿で最初に外側に移動する円を描くように頭と首の上部を払拭して手術領域を消毒する。 </li><li>我々は確実に直腸プローブフィードバック温度制御された加熱システムを使用することをお勧めしますマウスの温度が安定した37℃のままマウスの温度が手術中に低下した場合は、手術後の回復は時間がかかることがあり、その結果低体温は、タンパク質タウ15微小管関連の過剰リン酸化を含め、異常なタンパク質活性につながることができます。暖房システムを設定した後、あなたは今、手術を開始する準備が整いました。 </li></ol> 3。アルゼット浸透圧ポンプの注入<ol><li>手術を開始する前に、滅菌手袋の新しいペアに置く。その後、鉗子とはさみの小さなペアを使用して、目の間に動物の頭蓋骨上記の首の付け根からまで皮膚の切開をする</li><li>上向きに曲線と鈍いはさみを取り、左後肢に向かって戻って首の付け根の皮膚の下にスライドさせます。全く抵抗があってはなりません。がある場合は、ハサミを削除して再度実行してください。これは浸透圧ポンプのための皮下ポケットを形成している。 </li><li>のWiPEは綿棒続い滅菌綿棒できれいに頭蓋骨は、ブレグマを高めるために過酸化水素に浸した。 </li><li>ポンプの無菌性を維持するために、ポンプを含んで50ミリリットルコニカルチューブを拭う。慎重にポンプがコニカルチューブの側面に触れないように余分な世話をして、湾曲した止血剤を使用してコニカルチューブからポンプを取る。鉗子でポンプのベースを持ち、湾曲した止血剤との道の残りのフローモジュレータを押してください。 </li><li>流れ変調器とチューブが湾曲した止血と会うポンプホールド。首の付け根の皮膚の下にポンプを挿入し、それが抵抗なく行く限り左後肢に向かって押し戻す。カテーテルのタッチは何もさせないように注意してください。 </li><li>湾曲した止血剤を使用すると、トップは台座を満たしている溝でカニューレをつかむ。位置にカニューレドライバを移動して、所定の位置に固定します。 </li><li>カニューレのベースにスーパー接着剤の一滴を置きます。膿チューブがまっすぐに指摘されるように、ドライバと位置にカニューレのhがトップ。 </li><li>ブレグマにカテーテル先端をタッチしてデジタル表示上の座標をゼロに。カテーテルを上げ、右後方0.5ミリメートル（ 図2B）に横方向に1.1ミリメートルを移動します。湾曲した止血剤と道の皮膚を差し出す。 </li><li>プラスチックカニューレベースがしっかりと頭蓋骨の上部に押し付けられるまで、頭蓋骨を通して薄い金属カテーテルを駆動します。金属カテーテルは相対薄い頭蓋骨のためマウスで頭蓋骨を介して直接駆動することができます。ラットを用いた場合は、カテーテルを下げる前に、頭蓋骨に穴を開ける。 </li><li>離れて頭蓋骨からその上に接着剤を持っている任意の肌を引き出します。場所にカニューレ/カテーテルを保持カニューレドライバと、完全に乾燥させる接着剤のために1〜2分待ちます。 </li><li>カテーテルの配置を評価するために、練習をすると、チューブ（ 図2C）を通じて2.5％FastGreen染料の20-40μLを注入します。 2〜3分、perfus待ち電子1X PBS 0.03％ヘパリンとマウス、脳を取り外します。カテーテルサイトで冠状カット。カテーテルが心室に配置した場合には、染料は、マウスの脳室系（ 図2D）を通じて灌流される。 </li><li>ドライバを上げながら湾曲した止血剤のある場所でカテーテルを保持します。ゆっくりカニューレが適切に頭蓋骨に固定されていることを保証するために止血剤を放出する。 </li><li>綿棒で、カニューレの上に下に押します。カニューレの上部とベースとの間の木立にラットの骨切りを取り付けます。まだ綿棒で押しながらカニューレの上部を切り取る。バリカンのレベルを試してみて、続けるように頭蓋骨からカニューレをデタッチしない。カニューレが動転来ない場合は、速やかに再接着剤、さらに2分間綿棒で圧力をかける。 </li><li>右カニューレ上の余分な注意を払って、5-0縫合糸、定期的な止血剤、及び鉗子、フルオープンに沿って縫合糸を使用した。私たちはのrunninを使用頭蓋骨の上に大きな切開のためにgの水平マットレス縫合（ 図5を参照）。 </li><li>頭と首の上に抗生物質軟膏のDABを適用します。緩め耳バーとノーズコーンを緩める。回復のための温暖化パッド上stereotaxと場所からマウスを外します。一般的に10〜30分に至るまで、回復の期間に密接したマウスを監視します。マウスの周りを歩いて、自分自身をグルーミング開始されるまで2〜3日毎分をチェックしてください。 </li></ol> 4。術後ケア<ol><li>最初の週のための手術後、毎日マウスを監視します。 </li><li>マウスが痛みや苦痛にあると表示された場合、我々は痛みを和らげるために、最大5日間毎に24時間一度カルプロフェンの5 mg / kgを皮下注射でマウスを提供するお勧めします。 </li><li>感染症があるように表示された場合は、寛大に毎日領域に抗生物質軟膏を適用し、傷が正しく癒していることを確認するために出席する獣医師に相談してください。 </li><li> R5-0ナイロン縫合糸を縫合糸からの刺激を防ぐために、手術後7-10日を残したまま削除。 </li></ol> 5。アルゼット浸透圧ポンプを変更したり、削除するポンプを積極的にASOを注入行われた後、それがどちら変更または完全に除去することができる。 <ol><li>以下の変更と上記のように同じ事前手術手順に従ってください：1）あなたは、湾曲したハサミ、湾曲した止血、ラットの骨のカッター、またデジタル表示を必要としませんし、マウスの代わりに頭を準備中の2）、剃るとポンプとチューブの接合部にマウスの裏を消毒する。 </li><li>鉗子やハサミを使って、ポンプ/チューブ接合に垂直、マウスの背面に1.5センチメートル切開を行います。慎重にカテーテルをJAR可能性があるので大幅にチューブを引っ張っ/押さずに切開のポンプを引き出します。 </li><li>ポンプを削除するには、約0.5センチメートルフローモジュレータ上記チューブをクリップし、チューブをtに瞬間接着剤に触れOシールは、それはシャットダウンします。乾燥させる接着剤のために1〜2分待ちます。切開と縫合閉鎖にチューブバックを置きます。縫合し、皮膚や場所温水回収パッド上のマウスの上に軽くたたく抗生物質軟膏。 </li><li>ポンプを変更するには、新たに95％エタノールでいっぱい10cmディッシュと一緒にポンプの準備ができました。カテーテルは、新しいポンプには必要ありません。 </li><li>ピンセットで新しいポンプをつかむ。エタノールに指を浸し、ポンプを手に取り、フローモジュレータを捨てる。その後、慎重にゆっくりとチューブとカニューレに装着フローモジュレータから古いポンプをやってのける。できるだけ早くそれがオフになっているように、ゆっくりと流れ変調器は、マウスの外側に触れたことがないことを確認し、上に新しいポンプをスライドさせます。 </li><li>背中の皮下パケットに切開を通して新しいポンプを再挿入し、皮膚を縫合。回復パッドの傷や場所マウスで軽くたたく抗生物質軟膏。 </li><li>ただ、ポンプ注入と同様に、電話をチェックするために手術後、毎日マウスを監視AIN /不快と感染。必要と認めるとしてカルプロフェンと抗生物質で治療する。 </li></ol> ICVボーラス 6。プレ外科手順<ol><li> ; 2）滅菌水および負荷と10μlのハミルトンシリンジと針をきれいに1）あなたが湾曲したハサミ、湾曲した止血、またはラットの骨のカッターを必要としません：以下の変更と上記の第2節と同様に手術前の手順に従ってくださいASO、3）カニューレドライバーが位置していた定位固定装置に注​​射器と針を取り付けてください。 </li></ol> 7。 ASOのボーラス注射<ol><li>鉗子とはさみの小さなペアを使用して、目の間にまで首の付け根から切開を行います。 </li><li>綿棒はブレグマを強化するために過酸化水素に浸した綿続い滅菌綿棒、きれいな頭蓋骨を拭きます。 </li><li>所定の場所に注射器/注射針を移動し、固定します。針のベベル部分が後方を向くようにしてください。下段針はブレグマをそれに触れるまで。座標のすべてをゼロ。右1.0ミリメートルと0.3ミリメートル前方（ 図3A）に横方向に針を移動します。 </li><li>針穴が頭蓋骨の上部と同じ高さになるだけになるまでゆっくりと頭蓋骨を通して針を駆動します。繰り返しますが、これはマウスの頭蓋骨の薄さが原因で行うことができます。ゼロのz座標は1mm /秒（ 図3B）の割合で-3.0 mmの針を下げる。針の周りにシールするための脳のために2〜3分待ちます。 </li><li>毎秒1μLの割合でASOの完全10μLを届ける。 2〜3分待ちます。この率が異なる薬剤間で異なるかもしれませんが我々は、心室にASOSは1μlの注入速度を使用しています。練習するとき、2.5％FastGreen染料の10〜20μlのを提供することで、針の適切な配置を確認してください。染料注入後すぐに1X PBS 0.03％ヘパリンとマウスを灌流し、染料が脳室系（ 図3C）にあることを確認するために脳の冠状断面を作る。 </li> &lt;李&gt;針の基部に頭蓋骨に対して綿棒をホールド。毎秒1ミリメートルの割合で針を上げる。とすぐに針が頭蓋骨の外にあるように、針穴の上綿棒を転がし、漏れる任意のASOを防ぐために1分間保持する。 </li><li> 、閉じた皮膚を縫合抗生物質軟膏を適用し、温水回収パッド上の場所のマウス。 ASO濃度に依存し、それは完全に回復するために数時間を20分かかる場合があります。 </li><li>ただ、ポンプ注入と同様に、痛み/不快感や感染を確認するために手術後、毎日マウスを監視します。必要と認めるとしてカルプロフェンと抗生物質で治療する。 </li></ol>

<ol><li>Crooke, S. T., Bennett, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+antisense+oligonucleotide+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Progress in antisense oligonucleotide therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 107-129 (1996).</li>
<li>Sazani, P., Kole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+antisense+oligonucleotides+as+modulators+of+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of antisense oligonucleotides as modulators of alternative splicing.</a> The Journal of Clinical Investigation. 112 (4), 481-486 (2003).</li>
<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+Proteins+in+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease.</a> Science. 296 (5575), 1991-1995 (2002).</li>
<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).</li>
<li>Miller, T. M., Smith, R. A., Kordasiewicz, H., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-Targeted+Therapies+for+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Gene-Targeted Therapies for the Central Nervous System.</a> Archives of Neurology. 65 (4), 447-451 (2008).</li>
<li>Vickers, T. A., Koo, S., Bennett, C. F., Crooke, S. T., Dean, N. M., Baker, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Reduction+of+Target+RNAs+by+Small+Interfering+RNA+and+RNase+H-dependent+Antisense+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient Reduction of Target RNAs by Small Interfering RNA and RNase H-dependent Antisense Agents.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278, 7108-7118 (1074).</li>
<li>Smith, R. A., Miller, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+Oligonucleotide+therapy+for+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Antisense Oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 116 (8), 2290-2296 (2006).</li>
<li>Rosen, D. R., Siddique, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Cu%2FZn+superoxide+disumutase+gene+are+associated+with+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in Cu/Zn superoxide disumutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature. 362, 6415-62 (1993).</li>
<li>Haidet-Phillips, A. M., Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+from+familial+and+sporadic+ALS+patients+are+toxic+to+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Astrocytes from familial and sporadic ALS patients are toxic to motor neurons.</a> Nature Biotechnology. 29, 824-828 (2011).</li>
<li>Furukawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+roles+of+wild-type+Cu%2CZn-superoxide+dismutase+in+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Research+International%22%5BJournal%5D)">Pathological roles of wild-type Cu,Zn-superoxide dismutase in Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Neurology Research International. 2012, 1-6 (2012).</li>
<li>Hua, Y., Sahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes and Development. 24, 1634-1644 (2010).</li>
<li>Passini, M. A., Bu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+Oligonucleotide+Delivered+to+the+Mouse+CNS+Ameliorate+Symptoms+of+Severe+Spinal+Muscular+Atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antisense Oligonucleotide Delivered to the Mouse CNS Ameliorate Symptoms of Severe Spinal Muscular Atrophy.</a> Science Translational Medicine. 3 (72), (2011).</li>
<li>Kordasiewicz, H. B., Stanek, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+Therapeutic+Reversal+of+Huntington%27s+Disease+by+Transient+Repression+of+Huntingtin+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sustained Therapeutic Reversal of Huntington's Disease by Transient Repression of Huntingtin Synthesis.</a> Neuron. 74 (6), 1031-1044 (2012).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+Rodent+Surgery+for+the+New+Surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon.</a> J. Vis. Exp. (47), e2586(2011).</li>
<li>Planel, E., Richter, K. E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+Leads+to+Tau+Hyperphosphorylation+through+Inhibition+of+Phosphatase+Activity+by+Hypothermia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthesia Leads to Tau Hyperphosphorylation through Inhibition of Phosphatase Activity by Hypothermia.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (12), 3090-3097 (2007).</li>
<li>Southwell, A. L., Skotte, N. H., Bennett, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+oligonucleotide+therapeutics+for+inherited+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antisense oligonucleotide therapeutics for inherited neurodegenerative diseases.</a> Trends in Molecular Medicine. , In press, corrected proof (2012).</li>
<li>Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+therapeutics%3A+beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11, 125-140 (2012).</li>
</ol>

著者はイシス医薬品から自分のアンチセンスオリゴヌクレオチドを​​受け取る。

ビデオに示されているようにCNSでグローバルに薬を提供する能力の両方を学び、使いやすい、非常に強力な手法です。慣例により、単一のポンプ注入またはボーラスICVが同時に処理されるようにしたマウスの大集団を考慮して、10分で完了することができる。マウスの行動のためのより大きい数字は有意差を見るのを助けるために重要であるので、これは、行動の読み出しを用いた研究のために特に便利です。 ポンプやボーラス注射経由 ASOSの提供経験に基づいて、我々は、それぞれの方法にいくつかの長所と短所を観察した。これらは私たちの研究室での意見であり、すべてのマウスおよびラットモデルに対して真ではないかもしれないことに注意すべきである。 我々は、ポンプを使用することの利点は、ASOが時間のかなり長い期間にわたって分散されるので、ASOの高い量を送達する能力である見つける。これは通常、アクティブ後長く持続ノックダウンまたはスプライシングに相当ASO注入は、けれども、これは必ずしもそうでないかもしれません。ポンプはまたASO配信の正確な時間枠（14日、28日、または42日）を可能にし、ポンプはさらに長くアクティブASOの注入を可能にするために一度に変更することができます。しかし、複数回のポンプを変更すると、適切に液体を吸収するポンプを防ぐポンプの周りに繊維のポケットの形成に起因するばらつきが増大することに気づいた。ポンプの欠点は、一部のマウスだけでなく、他のポンプなどを許容しないことである。作業しているトランスジェニックラインがより脆弱である場合、ポンプがあまりに面倒かもしれません。ポンプは、また別の手術を追加しました麻酔にマウスを施し、最終的な注入した後に除去する必要があります。行動の仕事をしている場合、ポンプの存在は、マウスのいくつかの挙動に影響を与えるので、ポンプを除去し、回復の少なくとも1〜2週間を可能にするために特に重要である。 ICVボーラス注射で、一つの利点はコストです。があります先行投資は、注射器や注射針を購入するが、購入するためのポンプ/チューブ/カテーテルないが存在しないので、時間をかけて、ボーラス注射はよりコスト効果的です。全体的に、カニューレとポンプの不足のためにICVボーラス注射でアップキープレスがあります。私たちは、ICVボーラスが若いおよび/またはより脆弱なマウスにASOSを配信するために使用することができることもわかります。 ICVボーラスの欠点は、単回注射であることである。できるだけ全体のASOはこの経路を介して配信することができ、使用中のASOの作用持続時間が短い場合、ノックダウン/スプライシング効果も短命になりません。 浸透圧ポンプと同様、ICVボーラス両方はASOSを提供する能力を持っていることができるノックダウンタンパク質または全体のげっ歯類の中枢神経系における遺伝子のスプライシング、複数の神経科学関連分野で幅広い用途を有する技術を変える。あなたは最高のあなたのために適した行政のどのルートが不明な場合、我々は、配信の両方の方法を操縦することをお勧めpecific研究。

いくつかの薬物は、直接中枢神経系（CNS）の配信を要求する、血液脳関門（BBB）を通過することができない。 BBBを回避するために、薬物は、記載された方法を用いて脳内に直接送達することができる。我々の研究室およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの用紙の詳細な明細書フォーカス（ASOS）が、そのような小分子、抗体、遺伝子治療ベクター、 等のような他の薬物は、。、また全く同じアプローチを介して送達することができる。 特定のタンパク質は、神経変性疾患の病因に重要な役割を果たしている。このようなタンパク質は、しばしば有毒種を形成し、集合体に蓄積し、最終的な神経細胞死と3-4その後の神経疾患につながる。これらの疾患の進行を遅らせる、あるいは停止させるための努力で、一つの治療選択肢を直接原因となるタンパク質を標的とし、減少するかもしれない。しかしながら、これらのタンパク質は、しばしば、電子には困難で、CNSを介して発見された遍在<html> ffectively地球規模でそれらをターゲットにしています。 CNS全体にわたって遺伝子を標的とするために、我々はBBBをバイパスする側脳室を介してマウスの脳脊髄液（CSF）中にASOSを管理する。この具​​体的な方法は、ASOSの広範な分布を可能にする、全体の脳と脊髄を浴びるマウスの脳室系を利用する。我々は）18-20 merのRNAのように直接、標的mRNA配列を結合する分子と、ASOの化学修飾に応じて、ノックダウンまたはBにつながるのmRNAを分解する）リクルートのRNase HであるASOSを使用する選択的スプライシング1シフト、2,16,17。なお、複数の分子がshRNAを含む、 インビボで特異的タンパク質をノックダウンするために存在することに留意すべきである。これらの分子は、この記事の焦点ではないので、私たちはより良い細部のノックダウン作用のメカニズムとそれぞれ5-6の長所/短所その記事を確認するためのリーダーを演出します。 jove_content &quot;&gt;前の仕事では、我々は、筋萎縮性側索硬化症（ALS）7（ 図4）のトランスジェニックラットモデルにおいて蛋白質スーパーオキシドジスムターゼ1（SOD1）をターゲットにASOSを使用している。変異SOD1では、すべてのALSの約2％で発生例8は 、それが最近SOD1は発症が大幅に7に増加した後にALSトランスジェニックラット、生存中の総SOD1レベルを減少させることにより同様に9-10。散発ALSにおいて重要な役割を果たしている可能性があるという仮説が立てられているものの、これらの重要なデータは、最初にあったCNSにおけるASO治療は神経疾患モデルに関する深い肯定的な影響を及ぼす可能性があることを示すためにして以来、人間のSOD1をターゲットASOS入力し、正常に最小限の副作用（Clnicaltrails.gov NCT01041222）との第I相臨床試験を完了した、など神経の2012 64 回年次アメリカンアカデミーで発表。II相試験が現在進行中であるフェーズを楽しみにしASOSを移動する予定です。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt; SOD1は、神経疾患の治療にASOSを使用しての最初のデモンストレーションだったターゲットが、他のいくつかの研究はその後さまざまな病気とそれぞれの標的タンパク質を見て行われてきた。 2010年と2011年で、そのASOSは、運動ニューロン2（SMN2）のタンパク質生存のシフトスプライシングは、脊髄筋萎縮（SMA）のトランスジェニックマウスモデルで使用されていたし、病気の表現型11,12の有意な改善をもたらした。これらのスプライシングASOSは、フェーズに今SMA（Clinicaltrails.gov NCT01494701）の子供の私の臨床試験です。また、最近ハンチンチンタンパク質のレベルがベースライン13に戻った後でも、ハンチンチン遺伝子を標的ASOSの過渡投与が劇的にハンチントン病マウスモデルを救出することができたことが示された。 これらの研究の全てにおいて、ASOS、全遺伝子のレベルを減少または遺伝子スプライシングを介して変更する側脳室に配信された全体CNS。浸透圧ポンプと単一のボーラス注入の両方がCSFにASOSを送達するために使用することができる。脳室内（ICV）ボーラスは、高速、一回注入であるのに対し、ポンプは、ゆっくりと、連続的な配信を可能にします。我々は、単一のトランスジェニック系統でポンプとボーラス間の直接比較を報告していないのに私たちは、成功を収めて、これらのメソッドの両方を使用している。 CNSのASOSを使用すると、総タンパク質レベルを減少および/またはいくつかのタンパク質のスプライシングを変更するための強力な方法である。我々は、神経疾患の治療薬として独占的にASOSを使用していますが、私たちは、他の分野でも、この技術の恩恵を受ける可能性があることを認識しています。限り、目的のタンパク質は、CNSで発現させ、究極の目標は、実証技術でASOSを用いた遺伝子発現におけるCNS全体の変更を実現することを目的とするように非常に有用である可能性があります。

<table><tbody><tr><td colspan="4">PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS </td></tr><tr><td>Alzet Osmotic Pump 14日間</td><td>DURECT</td><td>Model 1002</td><td></td></tr><tr><td>Alzet Osmotic Pump 28日間</td><td>DURECT</td><td>Model 2004</td><td></td></tr><tr><td>Alzet Osmotic Pump 42日間</td><td>DURECT</td><td>Model 2006</td><td></td></tr><tr><td>2.5 mm Catheters</td><td>PlasticsOne</td><td>3280PM/SPC</td><td>2.5 mm カテーテル長にカスタムオーダー</td></tr><tr><td>ビニールカテーテルチューブ</td><td>DURECT</td><td>7760</td><td>ID:0.027 "、OD:0.045 "</td></tr><tr><td>0.9%塩化ナトリウム、灌漑、USP</td><td>Baxter</td><td>2F7124</td>ポンプ<td>またはチューブでは使用しないでください</td></tr><tr><td>0.9%塩化ナトリウム、注射、USP</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>p60シャーレ(滅菌済み)</td><td>TRP</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>外科用ブレード(滅菌)</td><td>バトラーシャイン</td><td>#007319</td><td></td></tr><tr><td>ラテックス手術用手袋(滅菌)</td><td>マイクロタッチ</td><td></td><td>CatNoは、必要な手袋のサイズに依存します</td></tr><tr><td>滅菌タオルドレープダイ</td><td>ナレックス</td><td>4410.2um</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>フィルターPALL</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>1mlシリンジ(滅菌)</td><td>BD</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>50mlコニカルチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100%エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan = ">PUMP&ボーラス手術プロトコル</強力></td></tr><tr><td>湾曲した鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11001-12</td><td></td></tr>湾<tr><td>曲止血</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>13009-12</td><td></td></tr>ファイン<tr><td>シャープはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14060-09</td><td></td></tr>湾<tr><td>曲した鈍いはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14029-10</td><td></td></tr>ボーン<tr><td>カッター</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>16104-14</td><td></td></tr><tr><td>ストレート止血ファイン</td><td>サイエンスツール</td><td>12002-12</td><td></td></tr>シ<tr><td>リンジ</td><td>ハミルトン</td><td>7653-01</td><td>10 &mu;l 取り外し可能な針付き気密</td></tr>性 <tr><td>針</td><td>ハミルトン</td><td>7758-04</td><td>26 ゲージ、ポイント スタイル: 2</td></tr><tr><td>5-0 ナイロン縫合糸</td><td>Covidient</td><td>SN-871</td><td></td></tr><tr><td>アルコール パッド</td><td>セレク</td><td>ト#521</td><td></td></tr><tr><td>綿棒 (滅菌)</td><td>ピューリタン</td><td>REF 806-WC</td><td></td></tr><tr><td>瞬間接着剤</td><td>ロックタイト</td><td></td><td>ロングネック ボトル</td></tr><tr><td>注意:FastGreen Dye</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td>この製品を取り扱うときは、アイシールドと手袋を着用</td></tr>してください <tr><td>抗生物質</td>クリーム <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アイ軟膏</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気シェーバー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% プロバドン ヨウ素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3% 過酸化</td><td></td><td></td>ヒドゲン<td></td></tr><tr><td>温暖化パッド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビーズ滅菌器</td><td>SouthPointe Surgical</td><td>GRM5-1450</td><td></td></tr><tr><td>小動物 定位固定装置</td><td>Kopf</td><td>モデル 940</td><td></td></tr><tr><td>ノーズ コーン</td><td>Kopf</td><td>モデル 923-B</td><td></td></tr><tr><td>イヤーバー</td><td>Kopf</td><td>モデル 921</td><td>このモデルはオプションです</td></tr><tr><td>カニューレ ドライバー</td><td>Kopf</td><td>モデル 1966</td><td></td></tr><tr><td>シリンジホルダー</td><td>Kopf</td><td>モデル 1972</td><td></td></tr><tr><td>温度制御システム</td><td>Kopf</td><td>モデル TCAT-2LV</td><td>オプション</td></tr><tr><td>酸素/イソフルランシステム</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

齧歯中枢神経系への薬物の直接脳室内デリバリー

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

血液脳関門を通過できないため、特定の薬物は、直接中枢神経系（CNS）に送達される必要がある。私たちの研究室では、ここにビデオに示す技術もCNSに他の薬剤の茄多を提供するために使用することができますが、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASOS）に特に焦点を当てています。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASOS）はノックダウン配列特異的な目標1と同様に、特定の遺伝子2のシフトアイソ比が能力を持っている。マウスのCNSにおける広範囲の遺伝子ノックダウンまたはスプライシングを達成するために、ASOSは、我々が動画を示すどちらの投与の2つの別個の経路を使用して脳に送達することができる。 最初は、外科的に側脳室に注入されるカテーテルに接続アルゼット浸透圧ポンプを使用しています。これは、ASOSが連続時間の指定期間のCNSに注入することができます。第二は、ハイテクの単回ボーラス注射を含む右側脳室にASOのGH濃度。研究の必要性に応じて、1つの方法は、他よりも好ましいかもしれないが、両方の方法は、全体の脳および脊髄にASOを提供するために、マウス脳の脳室系を使用する。

ポンプ注入またはICVボーラス注射後の指定された時間（私たちは日常的に4週間使用）した後、ASOSの有効性をテストすることが重要である。我々は、両方の定量的リアルタイムPCRと同様に公開され、例えばいずれかのウェスタンブロットまたはELISA（ 図4を用いてタンパク質レベルを使用してmRNAレベルで、標的遺伝子のレベル/アイソフォームを測定するために、脳および脊髄の様々な領域を撮影推薦する）。これは、異なるCNS領域全体ASOの有効性を判断するのに役立ちます。標的タンパク質の半減期が長い場合、我々は最大のタンパク質のノックダウンやスプライシングを評価するためにASOの注入後に長く待つことをお勧めします。 これは、オリゴ分布をテストすることも重要である。同側および対両半球を介して配布をポンプ注入の結果、より高いASO濃度は、多くの場合、脳室系16に近い領域において見られるものの。 ICVボーラス注射はもっとunifoをもたらすCNS〜16オリゴRM流通、効果は長くは続かないかもしれないけれども。私たちは、サウスウェルらのリーダーを演出します。ボーラスオリゴ分布16対ポンプの直接比較を見て。 また、それぞれのASOは、生体内でわずかに異なる動作をしますので、複数回投与と同様ASOSの作用持続時間のテストをお勧めします。 ASOSは、通常数ヶ月後ASO配信を持続ターゲットノックダウンまたはスプライシングと、行動の比較的長い期間を持っている。加えて、いくつかのASOSは他より良い仕事になり、いくつかの遺伝子標的は他よりノックダウンに容易になります。このため、リード候補を決定するために、ASOSをスクリーニングする際、我々は最初のパスとしてASO当たりN = 4-6成体マウスに生体内で少なくとも3-5 ASOSのテストをお勧めします。 ASOS以外の薬物を使用している場合、それはまた、パイロットにとって重要となる理想的な薬物濃度、薬物作用の持続時間、およびCNS薬その具体的な化合物の配布。 <img alt="表1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326table1.jpg" /> 表1。手術座標は。浸透ポンプを移植するだけでなく、脳室内（ICV）ボーラスを行う際にマウスとラットの両方で右側脳室をヒットするために使用される座標。両方の座標は、ポンプとICVボーラスのため、右の側脳室を対象としています。これらは、我々は最も経験があり、ASOの優れたディストリビューションを提供して知っているので、我々は、2つの異なるセットを使用。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig1.jpg" /> 図1。定位セットアップ。アルゼットポンプとボーラス注入の手術のために（A）必要な定位装置。ⅰ）ガラスビーズは、滅菌R。ⅱ）デジタル読み出し。ⅲ）動く腕と定位ベース。ⅳ）温度制御加熱パッド。ⅴ）酸素システム/イソフルラン。ⅵ）イソフルラン商工会議所は、（B）はノーズコーンと耳バーの間近します（C） 2つの添付ファイルが必要です。左：シリンジ/ ICVボーラス注射用針ホルダー。右：浸透圧ポンプ注入のカニューレドライバー。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig2.jpg" /> 図2。浸透圧ポンプ注入アルゼット。マウスについて（A）アルゼット浸透圧ポンプオプション。 14日ポンプ（0.25μL/時）、28日ポンプ（0.25μL/時）、42日ポンプ（0.15μL/時）ブレグマからポンプ注入の（B）座標：後部-0.5ミリメートル、横-1.1ミリメートル（右）、及び腹側-2.5ミリメートル（カテーテルの長さ）。（C）を介して、カテーテルを駆動した後、頭蓋骨と接着カニューレ、色素が側脳室カテーテルの適切な配置を評価するために、カテーテルを介してフラッシュされます（D）灌流脳はすぐに（C）のように投与した後に染料。カテーテルが正常に心室に配置されている場合は、染料は、マウス脳室系全体に分配される。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig3.jpg" /> 図3。脳ボーラス注射。 （）ブレグマからボーラス注射の座標：0.3ミリメートル前方、横-1.0ミリメートル（右）と、腹-3.0ミリメートル（B）腹頭蓋骨-3.0ミリメートルを通して針を駆動した後、染料をシリンジを通じてプッシュされます。ダウンロード（B）のように染料投与後の保存心室。（C）灌流脳内の針の適切な配置を評価する。針が正常心室に配置されている場合染料は、マウスの脳室系全体に分配される。 <img alt="図4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4.jpg" /> 図4。アンチセンスオリゴヌクレオチドは（Smith らから直接取得図7）、in vivoでラットSOD1を減らす。 （AD）アンチSOD1オリゴヌクレオチドはスクランブルr146192またはSODを100μgの/日に正常ラットの右側脳室に28日間注入したSOD。脳と脊髄から（）内因性SOD1 mRNAレベルを定量RT-PCRによって測定された。（ B）SOD1とチューブリンタンパク質のレベルはASOの注入に続く。チューブリンとSOD1用（CとD）のタンパク質レベルは、脳次注入の異なる領域のために定量化した。プレセニリン1またはGSK-3＆ベータに対する（E）ASOS;非トランスジェニックマウスと右前頭/側頭皮質で評価mRNAレベルの右側脳室に2週間にわたって注入した。臨床調査のためのアメリカの社会からの許可を得て複製。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50326/50326fig4large.jpg" target="_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5.jpg" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5highres.jpg"/> 図5。水平マットレス縫合を実行する。5-0ナイロン縫合糸は、カニューレを介してより多くを集中し、前部と後部の作業を開始する、肌の内外に織り込まれている。かつて最も後部点に到達した、縫合糸は、その後、戻って育ち、かつてよりカニューレを介して通される。これは、適切な創傷閉鎖を確保​​し、皮膚を通して働くからカニューレ/チューブを防ぎます。

我々は、カテーテルを注入又はマウスにおける右側脳室へのボーラス注入を実行することにより、中枢神経系に薬物を標的化する方法について述べる。私たちは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配信に特に焦点を当てています。この技術は、他の薬剤に、ラットに容易に適用可能である。

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

本実験の全体的な目的は、本プロトコルに示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの薬剤を側脳室を通じてげっ歯類の中枢神経系へ直接投与することです。これは2つの異なる方法で達成されます。1つ目の方法は、マウスの右側脳室に、浸透圧ポンプに接続された金属カテーテルを外科的に留置する方法です。ポンプによる薬剤投与が完了した後、ポンプを完全に除去して治療を終了させるか、あるいはポンプを交換して積極的な治療を継続させることができます。薬剤を投与する2番目の方法は、右側脳室への単回ボーラス注入によるものです。この方法を用いることで、一定量の薬剤を中枢神経系全体に迅速に注入でき、アンチセンスオリゴヌクレオチドが齧歯類の中枢神経系全体に正常に送達されたことを実証できます。本プロトコルで示すように、オリゴヌクレオチド注入後の複数の異なる脳領域におけるmRNAおよびタンパク質レベルを測定する必要があります。この手法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを中枢神経系へ直接投与する方法についての知見を提供しますが、抗体、遺伝子治療、ベクター、低分子化合物を含む他の薬剤にも適用可能です。すべての外科的手順は、施設および政府のガイドラインに従い、滅菌設備および溶液を用いて、無菌条件下で実施しなければなりません。詳細はテキストプロトコルおよび施設のIACUCガイドラインに記載されています。誘導チャンバー内でイソフルランを用いてマウスを麻酔させた後、マウスを取り出し、足指をつまんでマウスが完全に意識喪失していることを確認してください。肩の頂点から両目の間まで、素早く除毛します。次に、麻酔をかけたマウスを実体顕微鏡下のステージ上に慎重かつ穏やかに配置します。ノーズコーンを鼻にかぶせ、ガスフローをステージ上へ向けます。マウスの麻酔状態を維持するため、イヤーバーで頭部を固定します。ここではレベリングイヤーバーを使用していますが、側脳室を標的とする場合、脳室のサイズが大きいため、頭蓋骨を完全に水平にする必要はありません。麻酔維持のため、イソフルラン濃度を2%に下げ、眼軟膏を塗布します。両眼について、まず95%Ethanolに浸した綿棒で頭頂部と頸部を拭き、続いてヨードに浸した綿棒で拭いて手術部位を滅菌します。また、マウスに滅菌ドレープを掛けます。マウスの体温が37°Cに維持されるようにしてください。ここでは、直腸プローブフィードバックによる温度制御加熱システムを使用します。次に、zatポンプの植込みに進みます。必要な注入日数に応じて適切なポンプを選択し、プロトコルの本文にある手順に従ってポンプを準備してください。首の付け根から両目の間まで切開した後、鈍端剪刀（ずんたんせんとう）の曲線面を上に向け、首の付け根の皮膚の下に滑らかに挿入します。剪刀を左後肢に向かってスライドさせ、わずかに開いて皮下ポケットを作成します。滅菌綿棒で頭蓋骨をきれいに拭き、続いて過酸化水素を浸した綿棒で拭き取ります。bgmaを強化するために、カーブ止血鉗子を用いて、ポンプがコニカルチューブの側壁に触れないように注意しながら、チューブからポンプを慎重に取り出します。ピンセットでポンプの基部を保持し、フローモジュレーターを最後まで押し込みます。カーブ止血鉗子を用いて、フローモジュレーターとチューブが接する部分でポンプを固定します。ポンプを頸部基底部の皮下に挿入し、抵抗がない範囲で左後肢に向かって慎重に押し込みます。湾曲止血鉗子を使用して、カテーテルが何にも触れないよう注意してください。上部と台座が接する溝の部分でカニューレを把持します。カニューラドライバーを所定の位置に移動させ、固定します。次に、カニューラの基部にシアノアクリレート系接着剤を1滴つけ、カニューラの上部をドライバーに押し込み、チューブが真後ろを向くように配置します。迅速に操作し、皮膚を避けて保持しながら、カテーテルの先端をbgmaに接触させ、デジタルディスプレイ上の座標をゼロに設定します。曲がった止血鉗子を用いてカテーテルを持ち上げ、右側方に1.1 mm、後方に0.5 mm移動させます。この図に示されているように、カニューレのベースが頭蓋骨にしっかりと押し付けられるまで、カテーテルを迅速に頭蓋骨に刺入します。マウスの頭蓋骨は比較的薄いため、カテーテルを頭蓋骨およびマウスに直接刺入することが可能です。接着剤が付着している皮膚を頭蓋骨から剥がします。次に、カニューレドライバーでカニューレを固定したまま、接着剤が完全に乾燥するまで1〜2分間待ちます。その後、カーブヘモスタットでカニューレを固定し、ドライバーを持ち上げます。止血鉗子をゆっくりと緩め、カニューレが頭蓋骨に適切に固定されているかを確認します。綿棒を使用してカニューレの上部を押し下げます。滅菌済みのラット用骨鉗子を、カニューレの上部と底部にある溝に水平に合わせながらはめ込みます。綿棒で押し下げたまま、カニューラ上部を固定し、カニューラがスカルクリップから外れないようにします。5-0ナイロン縫合糸、標準的な止血鉗子、およびピンセットを用いて、開口部全体を縫合し、特にカニューラ上の領域に注意して行います。頭部と頸部に抗生物質軟膏を少量塗布します。イヤーバーを緩めて外し、ノーズコーンを緩めます。マウスをステレオタキシック装置から取り出し、回復させるためにウォーミングパッドの上に置きます。手術後は毎日マウスを観察し、痛みや不快感、感染症がないかを確認し、承認されたプロトコルに従ってカルプロフェンなどの鎮痛剤を用いて必要に応じて処置を行います。使用済みのポンプを取り外すには、マウスの背中にあるポンプ接合部に対して垂直に設けた1.5 centimeterの切開口から、チューブを大きく引いたり押したりしないように注意しながら、慎重にポンプを引き出します。次に、フローモジュレーターの約0.5 centimeter上のチューブをクリップで挟み、チューブにシアノアクリレート系接着剤（スーパーグルー）を塗布して密封します。接着剤が乾燥するまで1〜2分間待ちます。チューブを切開部に戻して縫合し、縫合した皮膚に抗生物質軟膏を塗り、マウスを加熱リカバリーパッドの上に置きます。ポンプを交換する場合は、新しいポンプと95% ethanolを満たした10 cmのディッシュを準備しておきます。ピンセットを使用して新しいポンプをつかみます。次に、もう一方の手の指を95% ethanolに浸し、ポンプを保持します。新しいポンプフローモジュレーターを廃棄し、古いポンプをフローモジュレーターから慎重に引き抜きます。古いポンプが外れたらすぐに、新しいポンプをゆっくりとスライドさせて装着させ、その際、フローモジュレーターがマウスの外側に決して触れないようにしてください。新しいポンプを切開口から皮下ポケットへ再度挿入し、皮膚を縫合します。以前と同様に皮膚を縫合した後、創部に抗生物質軟膏を塗り、マウスをリカバリーパッドの上に置きます。手術後、再びマウスを毎日観察し、痛みや不快感、感染症の有無を確認し、必要に応じて鎮痛剤を投与します。脳室内へのボーラス投与を行うため、前回と同様に頭皮を切開し、動物の頭蓋骨を拭いて清浄にした後、過酸化水素で処理します。次に、薬剤を入れたシリンジを所定の位置に移動させます。針の斜面部分を後方に向け、しっかりと固定します。針がbgmaに触れるまでゆっくりと下げます。すべての座標をゼロに設定し、その後、針を右方向に1.0 millimeters、前方（anterior）に0.3 millimeters移動させます。針の刃先の先端が頭蓋骨の表面と水平になるまで、ゆっくりと頭蓋骨に刺入します。繰り返しになりますが、これはマウスの頭蓋骨が非常に薄いため可能です。Z座標を調整し、ニードルを1 mm/sの速度で-3.0 mmまで下げます。ニードルの周囲で脳組織が密閉されるまで2〜3分間待ちます。アンチセンスオリゴヌクレオチド10 µL全量を、1 µL/sの速度で注入します。2〜3分間待ちます。オリゴヌクレオチドを脳室に注入する場合、注入速度は1 µL/sとします。この速度は薬剤によって異なる場合がありますが、針の根元の頭蓋骨に綿棒を当てて固定してください。1 mm/sの速度で針を引き上げます。針が頭蓋骨から出たらすぐに、綿棒で針穴を軽く押さえ、薬剤の漏出を防ぐために1分間保持します。皮膚を縫合して閉じた後、抗生物質軟膏を塗布し、マウスを加熱リカバリーパッドの上に置きます。オリゴヌクレオチド濃度によって、完全に回復するまでに20分から数時間かかる場合があります。同様に、手術後は毎日マウスを観察し、痛みや不快感、感染症の有無を確認し、必要に応じて鎮痛剤を投与してください。この画像は、脳室への投与に向けたZet浸透圧ポンプの挿入座標を確認するため、ファストグリーン染料を投与した直後に灌流した脳を示しています。このビデオで示されているように、カテーテルが脳室に正しく留置されると、ここに見られるように、色素がマウスの脳室系全体に行き渡ります。この画像は、脳室内へのボーラス注入の座標と手順を検証するために、ファストグリーン色素を投与した直後の灌流脳を示しています。針が脳室に正しく留置されていれば、同様に色素がマウスの脳室系全体に行き渡ります。以下の画像は、ラットのSOD1を減少させるためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたin vivoアンチセンス実験の結果を示しています。正常なラットの右側脳室に、SOD1オリゴヌクレオチドを1日あたり100 microgramsの量で28日間投与しました。この画像は、脳および脊髄における内因性SOD1 mRNAレベルが減少していることを示しています。Q-R-T-P-C-Rで測定したSOD1オリゴヌクレオチド投与後、この画像はSOD1タンパク質レベルも低下していることを示しています。ここでのSOD1アンチセンスオリゴヌクレオチド投与後、脳の異なる領域におけるtubulinおよびSOD1のタンパク質レベルを定量したところ、SOD1オリゴヌクレオチドがSOD1のノックダウンに特異的であることが示されました。さらに、非トランスジェニックマウスの右側脳室にプレセニリン1またはGSK3βに対するオリゴヌクレオチドを2週間投与し、mRNAレベルを評価しました。この結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて調節可能な標的が非常に多岐にわたることを示しています。これらの手法を習得すれば、適切に実施することで、ポンプ投与（プラテーション）とボーラス投与のいずれも10分で完了させることができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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出典: ポーランド、R. et al.動機付け行動の分子基質を研究するためのげっ歯類脳マイクロインジェクション。J. Vis.

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このビデオは、マウスモデルでのommayaを介した脳室内注射を示しています。この方法は、潜在的な薬剤候補の局所的な送達を可能にし、血液脳関門を回避します。...

マウスにおける脳室内注射:マウス脳の脳室に薬物を送達するためのOmmaya媒介直接薬物投与法

出典: Chen, Y., et al.ラット中枢神経系におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドのくも膜下腔内送達J. Vis. 経験。...

ラット中枢神経系への試験化合物のくも膜下腔内送達

小児疾患の動物モデルは、早期発症と積極的な疾患の進行を体験することができます。臨床的に若いマウスモデルに関連する治療送達は技術的に困難であることができる。このプロトコルは、人生の最初の2日以内に出生後の新生児マウスのための非侵襲的静脈内注入法を説明しています。...

新生児マウスにおける静脈注射

ここでは、脊椎の腰部内腔にカテーテルを移植してラット中枢神経系に薬物を送出する方法について説明する。私たちはアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達に焦点を当てていますが、この方法は他の治療モダリティの送達にも適しています。...

ラット中枢神経系におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの子宮内送達

神経幹細胞を送達する方法は、注射液または懸濁液に適応可能で、虚血性脳卒中後に一般的な頸動脈(マウス)または外頸動脈(ラット)を介して報告される。注入された細胞は脳のパレンチマ全体に広く分布し、送達後30dまで検出することができる。...

ラットおよびマウス脳への神経幹細胞の動脈内デリバリー:脳虚血への応用

ここでは、フリーハンドアプローチを用いて(すなわち、脳定位装置なしで)マウスに脳室内注射を行うための簡便かつ迅速なアプローチが記載される。...

マウスにおけるフリーハンド脳室内注射

ラットにおける直接迷走神経注射のプロトコルを提示し、注射後の合併症なしに神経に直接薬物送達を可能にします。この方法は、自律神経系の操作を含む前臨床神経学的研究に適用されます。ラットや他の種の他の神経に対する直接神経注射に使用でき、必要な変更を加えることができます。...

ラットのための直接迷走神経注射プロトコル

学ぶマウスの脳室内への薬物投与法。カテーテル埋め込みとボーラス注射の2手法を解説し、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの中枢神経系薬物デリバリー技術を習得できます。

齧歯中枢神経系への薬物の直接脳室内デリバリー

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