齧歯尿生殖洞間充織とヒト幹細胞の組織の組換えを用いたヒト前立腺上皮の形成

この手順の全体的な目標は、げっ歯類の胚からげっ歯類の泌尿生殖器、洞間葉、または UGSM を分離し、ヒトの前立腺上皮を形成できる腎カプセルに組織混合物を移植することです。これは、最初にマウスまたはラットの胚から泌尿生殖器洞を分離することによって達成されます。次に、泌尿生殖器洞間葉を上皮から分離します。

次に、泌尿生殖器洞間葉の単一細胞懸濁液を多能性幹細胞と組み合わせます。最後に、細胞混合物を宿主マウスの腎カプセルの下に移植します。最終的には、ヒト特異的なPSA発現の検証を通じて、マウスの腎臓にヒト前立腺上皮が形成されることを示す結果を得ることができます。

この方法は、前立腺の機能と疾患の開始に関する洞察を提供できますが、ヒト前立腺腫瘍の異種移植や、腫瘍を形成するための毎週の腫瘍形成細胞株の誘導など、他のシステムにも適用できます。時限妊娠したマウスまたはラットを安楽死させ、胚を分離した後、羊水嚢からそれらを分離し、へその緒を切断し、氷のように冷たいハンクを含む50ミリリットルのチューブに移します。塩溶液のバランスを取り、氷の上に保ちます。

胚を100ミリメートルのシャーレに入れ、ハサミを使用してボーラスのレベルで胚を二等分します。胃と小腸を取り出してから、腎臓のコドルポールまたは膀胱のレベルにある男性の精巣にある女性胚の卵巣を見つけます。解剖範囲の下で。

ヴェネツィアのはさみを使用して腹壁をカットし、腹部の膀胱と後壁を露出させます。上部生殖管をアタッチメントから解放し、臍帯を解放します。恥骨を切断し、デュモンの細い先端鉗子で切断します。

単刀直入に、泌尿生殖器洞の前壁から分離します。泌尿生殖器洞の後壁を直腸から分離し、膀胱を下端にして泌尿生殖器洞を切断します。次に、膀胱を泌尿生殖器洞から分離します。

泌尿生殖器洞を保管し、氷冷HBSSでブロックします。泌尿生殖器洞をカルシウムとマグネシウムを含まないHBSSの1%トリプシンを含む50ミリリットルのチューブに移し、摂氏4度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、トリプシンを除去し、10%FBSとDM A MF 12培地を加えて消化を中和します。

次に、針または細い先端の鉗子を使用して、上皮管から粘着性のある間葉スリーブを慎重にからかいます。上皮チューブを無傷に保つと、間葉の上皮細胞汚染の可能性が減少します。これにより、幹細胞由来のヒト腺上皮とともにげっ歯類腺が形成される可能性があります。

UGSMを、10%FBS、1%ペン溶連菌、1%非必須アミノ酸、および1ナノモルを含むDMM F 12培地を含む新しい50ミリリットルチューブに移します。R 1 8 81 チューブを摂氏37度で5%CO2で一晩インキュベートします。翌日、組織を200 Gで遠心分離し、上清を捨て、PBSを使用してペレットを洗浄します。

PBSを除去した後、組織をD-M-A-M-F 12の0.2%コラゲナーゼに再懸濁し、摂氏37度で穏やかに振盪しながら1時間インキュベートし、消化組織を3回激しく渦巻き、均質な単一細胞混合物になるまで、消化組織を3回激しくボルテックスし、10%FBS、1%ペン連鎖球菌、1%非必須アミノ酸、および1ナノモルR 1 8 81を含むD-M-A-M-F 12培地を添加してコラゲナーゼを中和します。細胞を200Gでペレット化し、ResusをHBSSに懸濁して、細胞を3回洗浄します。最後に、DMM F 12 で間葉系細胞を懸濁し、ヘモサイトメーターを使用して移植を行うためにそれらをカウントします。

無菌手術領域を準備し、ケタミンキシラジンのIP注射でオスの裸体マウスに麻酔をかけた後、テキストプロトコルに従って、つま先つまみを行って鎮静レベルを確認します必要に応じて手術部位を剃り、70%アルコールとベタジン溶液の3つの交互のワイプでマウスを洗浄することにより、マウスを外科的に準備します。目の軟膏を塗った後、背中に縦1センチの切開をし、縦0.5センチの切開で腹壁を切開し続けます。腎臓を腹部からそっと絞り出し、滅菌生理食塩水を滴垂らして湿らせます。

次に、27ゲージの注射針を使用して、腎カプセルに優しく穴を開けて、細胞混合物の注射部位を作成します。次に、28ゲージのシリンジ針に10マイクロリットルの細胞混合物を入れ、ゆっくりと穿刺部位に挿入し、腎臓実質を貫通します。腎嚢の下の領域に到達すること。

10マイクロリットルの細胞混合物を注入して、腎臓カプセルの下の腎臓にボーラスを形成し、針を引き抜きます。腎臓を腹腔に戻し、4本のナイロン縫合糸で腹膜の筋肉層を固定します。縫合糸またはステープルで皮膚を閉じ、滅菌生理食塩水を使用して皮膚から血液をきれいにします。

ここに示されているのは、移植後8週間で成長する異種移植片の超音波画像です。丸で囲まれた領域は、腎臓表面の異種移植片を表しています。これらの画像は、腎臓表面での異種移植片の成長を示しています。

12 週間後、泌尿生殖器洞の非存在下で移植されたヒト ES 細胞は、間葉腫大きな奇形腫を形成しますが、単独で移植された泌尿生殖器洞間葉は識別可能な構造を形成できません。中央に表示。この図のパネルは、幹細胞由来のヒト前立腺上皮と成体ヒト前立腺組織の代表的な免疫組織化学的染色です。

左に示すように、腺にはAR陽性の管腔上皮層が含まれています。これは、PSA陽性、P 63陽性の基底上皮細胞層、およびまれなクロモグラニンでもあります。神経内分泌細胞であるこの腺は、宿主去勢時のA-M-A-C-R染色が陰性であることからわかるように、がんではありません。

AR PSA陽性管腔細胞はもはや存在せず、特徴的なアンドロゲン依存性を示しています。この手順を試みるときは、泌尿生殖器洞間葉を上皮から分離する際に細心の注意を払うことを忘れないでください。尿生殖器洞上皮を汚染すると腺が形成され、結果を混乱させる可能性があります。