圧力筋運動記録法を用いたマウス抵抗動脈機能を評価

本実験の全体的な目的は、生理的条件に近い状態で、マウス抵抗動脈のリアルタイムな血管反応性をin vitroで測定することです。これは、血管の短いセグメントを2本のマイクロカニューレに固定し、生理的な管腔内圧を維持することによって達成されます。その後、α1受容体作動薬であるフェニレフリンを用いて血管を収縮させ、任意の薬物が血管を拡張させる能力を検討します。

アセチルコリンを用いて収縮した血管に負荷をかけることで、内皮依存性メカニズムを介した血管拡張能をリアルタイムで評価します。結果は、アセチルコリンに対する内腔径の変化率として示され、SGC alpha one 欠損が内皮依存性血管拡張能の低下を招くことを検証します。ワイヤーマイオグラフィーなどの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、プレッシャーマイオグラフィーによって、より大きな伝導血管よりも血圧恒常性の維持に深く関与している小さな微小血管の特性評価が可能である点にあります。

この手法は、大動脈抵抗血管が重要な役割を果たす高血圧など、心血管分野における主要な疑問の解決に役立ちます。まず、ペントバルビタールを用いてマウスを安楽死させます。次に、腹腔を開き、腸間膜組織の摘出を開始します。

次に、第3分岐の腸間膜動脈を特定し、結合組織および脂肪組織から分離します。微小血管レベルでは、血管内に血液がない場合、動脈と静脈の区別が困難になります。そのため、生存個体でこの操作を行うことが望ましいです。

次に、3次腸間膜動脈を2～3 mmの長さで切り取り、heaps PSS緩衝液を含むディッシュに入れます。この動脈セグメントに分枝が含まれていないようにしてください。

入口バルブと出口バルブから、10 mLシリンジを用いてPSS溶液をゆっくりと注入し、カニューレ内を満たしてmyoチャンバーを準備します。この際、過剰な圧力をかけるとカニューレに接続された脆弱なトランスデューサーを損傷する可能性があるため注意してください。カニューレ内を完全に満たした後、両方のバルブを閉じます。次に、単離した動脈セグメントをチャンバー内に移し、血管の一端を右側のカニューレに固定します。

シリンジを用いてフラッシュし、流入バルブからHEPES溶液を血管内に満たしながら、細いナイロン縫合糸で慎重に結紮します。次に、血管のもう一方の端を左カニューレに取り付け、ナイロン縫合糸でカニューレを血管に固定します。チャンバーに最大10 millilitersのHEPES溶液を満たします。

シリンジを用いて、入口バルブからヒープ溶液をゆっくりと押し込み、漏れがないか確認します。次に、チャンバーをビデオカメラの下に設置します。入口バルブを閉じた状態で酸素を供給し、チャンバーを37 °Cに加熱します。なお、バルブは最初のヒープ溶液リザーバーからのP1チューブに接続されています。

チューブ内に気泡がなくなるまで、気泡と溶液を流します。その後、バルブを開きます。チューブP2を用いて、チャンバーの左側のバルブに接続します。

圧力レギュレーターから続く系全体に、気泡や漏れがないことを確認します。myoインターフェースパネルまたはソフトウェアの圧力メニューに移動し、フローをオフにした状態でポンプをオンにします。プログラムを開き、「collect」をクリックします。

血管腔の直径および壁厚のモニタリングと解析が可能になりました。腔内圧を徐々に上昇させるには、P1プレッシャーを選択し、昇圧シーケンスを入力します。5から60 mmHgまでの値を用います。圧力を上昇させている間に血管がねじれたり屈曲したりすることがあるため、垂直方向または縦方向のマイクロポジショナーを使用して、適宜テンションまたはストレインを調整してください。

圧力を 60 millimeters に、バスを 37 °C に設定した後、平衡化期間として血管を少なくとも 45 分から最大 1 時間平衡化させます。この間に、バス溶液をあらかじめ温めておいた溶液に 1 回交換します。動脈切片の平衡化が完了したら、37 °C の塩化カリウム脱分極溶液を 10 mL 投与します。

平滑筋は完全に脱分極し、最大収縮に達します。安定した収縮が得られた後、浴槽をHEPB溶液で10分間隔に3回洗浄します。次に、血管の生存能と内皮の完全性を確認します。

まず、フェニレフリンを10⁻⁵ Mまで添加して血管を事前収縮させます。安定した収縮が得られたら、アセチルコリンを10⁻⁹ Mから10⁻⁵ Mまで段階的に濃度を上げて添加し、累積濃度血管拡張反応曲線を測定します。最後のアセチルコリン投与後、HEPES溶液で10分間隔で3回洗浄します。

次に、1 Lあたり2 mmolのEGTAを含むカルシウムフリーPSSを投与し、記録されたトレースから受動的な内腔径を決定します。各用量反応における内腔径を測定し、これをすべてのパラメータの算出に使用します。アセチルコリンによる弛緩反応は、アゴニストによる処理とカルシウムフリーバッファーによる処理を比較し、それぞれがフェニレフリン誘発性の収縮から内腔径をどれだけ変化させたかとして表します。

野生型およびS6およびB6背景のSGC alpha oneノックアウトマウスから単離し、フェニレフリンで事前収縮させた腸間膜抵抗動脈における、アセチルコリンに対する血管弛緩を調べるために、定圧マイオグラフィーを用いた。SGC alpha oneの欠損は、研究したマウスの遺伝的背景にかかわらず、アセチルコリンによる血管弛緩誘導能の低下に関連していた。しかし、SGC Alpha one欠損マウスの内皮依存性弛緩は、B6背景よりもS6背景においてより顕著に損なわれていた。

以上の知見を総合すると、血管内皮依存性弛緩に対する血管系の感受性の低下が、SGC Alpha oneノックアウトマウスにおける株特異的な高血圧に寄与している可能性が示唆されます。この手法を習得すれば、適切に行うことで1〜2時間で完了させることができます。また、本手順に加えて、生体血管に対して共焦点顕微鏡などの他の手法を同時に実施することも可能です。これにより、例えば細胞内鉄濃度の測定が可能となり、潜在的なシグナル伝達メカニズムの特定に役立てることができます。