意識マウスにおける糸球体濾過率の測定のためのハイスループット法

この手順の全体的な目標は、覚醒マウスの腎機能を決定する方法を他の研究者に示すことです。これは、最初に透析、フルオレセインイソチオシアネート、またはFSEイヌリンを24時間観察し、注射用の濃度を決定することによって達成されます。2番目のステップは、マウスの体重を量り、球後注射用の適性イヌリンを正確な量で調製し、マウスに麻酔をかけることです。

次に、Retrobulbar Fitzy イヌリン注射を行い、75 分間で 8 つの血液サンプルを採取します。最後のステップは、マイクロボリューム蛍光分光計を使用してフィッツヌーリンを測定し、二相指数崩壊モデルを使用して腎機能を計算することです。最終的に、Fiti Nulinシングルボーラス注入法の感度とフルオロ分光器の微量機能を組み合わせることで、マウスの遺伝子組み換え、食事の変更、または薬物適用によって引き起こされる腎機能の違いを検出することができます。

この技術の主な利点は、持続注入や麻酔条件などの既存の方法よりも、浸透圧ミニポンプの移植は放射性イヌリンを使用していることです。これは最終実験ではありません。尿を採取する必要はなく、1日あたり最大24Mを測定することが可能です。

私は、私の研究室の研究員であるマリア・アジモと一緒にこの手順を実演します フィッツィーヌーリン注射液を調製するため。5%溶液の2ミリリットルに十分なZIイヌリンを秤量し、標識されたイヌリンを0.85%塩化ナトリウム溶液に溶解し、完全に溶解するまで摂氏90度に加熱します。.20センチメートルの透析膜を二重蒸留水に30分間入れて、膜から残留ナトリウム酸を取り除き、その後数回メンブレンを洗い流し、透析メンブレンを溶解したフィットイヌリンシールで適切にクロージャーで満たし、メンブレン全体を計量します。

溶解した適合イヌリンを0.85%塩化ナトリウム溶液の1リットルで透析し、透析後室温で24時間光からゆっくりと保護して攪拌し、透析膜全体の重量を再度測定し、新しい濃度を計算します。水は浸透圧的に膜内に移動し、結合していないFSIは膜から移動します。したがって、FSIイヌリンの濃度は大幅に減少します。

新しい適合 e イヌリン濃度 この式を使用して計算します(Cは新しい濃度です)。Nは初期適合Eイヌリン量、Vは新しい体積であり、これは透析前後の透析チューブの重量の差に初期適合イヌリン溶液の量を加えたものです。次に、0.22ミクロンのシリンジフィルターによるろ過により、透析溶液を滅菌します。

実験前に光退色を避けるために、常に適性のあるイヌリンを光から保護することを忘れないでください。マウスに4〜5%ISOフッ素で短時間麻酔をかけた後、マウスの体重を測ります。透析したフィッツィーヌリンの体重1グラムあたり2マイクロリットルを吸引し、透析したフィッツィーヌリンの体重1グラムあたり2マイクロリットルを吸引し、半インチの長さの26ゲージ針で気泡を除去し、その後、注射用に半インチの長さの30ゲージ針に切り替えます。

透析したフィッツィイヌリンを眼窩後神経叢に注入します。.マウスが自宅のケージで自然に回復できるようにします。マウスの尾を1mmハサミで1mmカップに入れ、ヘパリンナトリウムミニ毛細血管に注射後、複数の時点で採血します。

採血後のミニ毛細血管をチャシールで密封し、サンプルを光から保護します。密封したミニキャピラリーをヘマトクリットキャピラリーの中に入れ、遠心分離後5分間遠心分離します。ダイヤモンドカッターを使用してミニキャピラリーを破砕し、0.2ミリリットルのチューブにピペッティングして血漿全体を移します。

新しい0.2ミリリットルのチューブに2マイクロリットルのプラズマと18マイクロリットルの0.5モル/リットルのヒープを使用して、1〜10希釈を行います。次に、希釈したサンプルの2マイクロリットルをNanoDrop 3、300で二重に測定し、6匹のマウスのハイスループットを実現します。シングルボーラス注射法で全腎臓GFRを測定するには、テキストプロトコルに記載されているフローチャートプロトコルに従ってください。FSEヌリン注射の3、5、7、10、15、35、56、および75分後に8つの血液サンプルを収集する必要があります。

このフローチャートでは、数字は収集時点を示し、括弧内の数字は縦の赤い線の左側にあるサンプル番号の時点を示しています。各マウスには異なる色でマークされています。連続採血を取得するには、矢印に従ってください。

灰色のボックスは、このプロトコルを使用して注射する前に、次のマウスがisofフッ素麻酔のために準備する必要がある時期を示しています。異なるマウスからの 2 つの採血間の最小時間は、テキスト プロトコルに記載されている標準希釈液を得るために、希釈したマウス血漿を使用して 1 分間希釈した fitzy nulin 注射溶液です。標準の濃度は透析によって異なり、FSIヌリンの調製ごとに常に異なります。

そのため、標準曲線の濃度を都度入力する必要があります。データを分析して、適切なソフトウェアで糸球体濾過率またはGFRを計算するには、意識のあるマウスでGFRを測定するためのテキストプロトコルに詳細で説明されているように、二相指数崩壊関数を使用します。単回投与の静脈内注射後のZIイヌリンの血漿動態は、GFRAの計算に使用され、2コンパートメントモデルでは2コンパートメントモデルが採用されます。

初期の急速な崩壊期は、血管内コンパートメントから細胞外液への適合したイヌリンの再分布を表しています。適合したイヌリン濃度の崩壊が遅い後期は、主に血漿からの全身クリアランスを反映しています。1型糖尿病は、ストレプトゾトシンの腹腔内適用によって誘発されました。

GFRは、1型糖尿病動物の誘導前と5週間後に測定され、糸球体過濾過が明確に示されました。このビデオを見れば、大型マウスでシングルボーラス注入技術を使用し、二相指数DKモデルを使用してGFRを測定する方法について十分に理解できるはずです。