Name: 人間の皮膚生検における侵害受容性表皮内神経線維の三次元イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学ぶ 三次元イメージングによる侵害受容性表皮内神経線維の形態変化解析。コンフォーカル顕微鏡とMRSソフトウェアを用いた人間皮膚生検の免疫組織化学的手法で、疼痛性ニューロパチーの神経線維変化を可視化する。

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この作品は、健康補助K08 NS061039-01A2の国立研究所、ミシガン大学の神経学研究·ディスカバリー、およびA.アルフレッド·トーブマン医学研究所のためのプログラムによってサポートされていました。この作品は、形態と糖尿病および消化器腎臓病研究所から健康グラント5P90 DK-20572の国立研究所によって資金を供給ミシガン糖尿病研究研修センター、の画像解析コアを使用していました。著者らは、侵害受容性バイオマーカーの免疫組織化学技術の初期開発をサポートするために、人間の皮膚のサンプルの彼らの寛大な寄付のためにロビンソンシングルトンとゴードン·スミス（ユタ大学）に感謝したいと思います。

パート：免疫組織化学バックグラウンド染色パンチ皮膚生検の96ウェルプレートおよび予防の作製は、ヒト被験体から採取し、固定液中で12〜24時間（2％113 M L-リジン溶液（pH7.4）中でホルムアルデヒドおよび0.05 mMの過ヨウ素酸ナトリウムなど）とインキュベートする。 4℃で前述したように8。次いで、試料を取り付け、その後メディア最適な切削温度（OCT）、クライオスタットに厚さ50μmのセクションに区分に埋め込まれ、最大1週間のために4で20％グリセロール°Cとリン酸緩衝食塩水（PBS）で凍結保護されています。以下に説明するプロトコルは、8皮膚切片ワン96ウェルプレートに浮遊免疫組織化学を受けることが可能な皮膚切片の最大数に設計されている。 1日目： 1。角質層非特異免疫反応の防止<ol><li>ラベル96ウェルプレート、 図1に示すように。 </lI&gt; <li>画像-IT 96ウェルプレートの1行目の各ウェルにバックグラウンド染色11,12を遮断するための効果的なFX信号（画像-IT）、150μlのを追加します。 </li><li> 96ウェルプレートの2行目と3で各ウェルに1×PBSを150μlを加える。 </li><li> DLで撮影生から1セクション、PTで取ら生から1セクション：患者ごとに2つの50μmのセクションを取得します。接種ループ（LeLoop）は形態的損傷を避けるために、次へのすすぎ1からセクションを転送するために使用されます。そっと画像-ITを含む、よく行1の個体に、接種ループを使用して、各50μmのセクションを転送します。フラットロッカーで室温で30分間画像-ITのセクションをインキュベートする。 </li><li>室温で10分間1X PBS（行2と3）で2回のセクションをすすぐ。リンスの間にフラットロッカーにウェルプレートを置きます。 </li></ol> 2。 5％BSAブロッキング溶液と1％のリンス液の調製<ol><li>生検のセクションでは、画像-ITでインキュベートされていますが、ソリューションをブロック5％を準備る（5％BSAが完全に溶解するまでBSA、0.3％TX-100、0.1 M PBS-渦溶液）。 </li><li> 4行目の各ウェルに5％BSAブロッキング溶液150μlのを追加します。 </li><li>接種ループを使用して、5％BSAブロッキング溶液の個々のウェル内にセクションを転送します。フラットロッカーで室温で1〜2時間で5％BSAブロッキング溶液内のセクションをインキュベートする。 </li></ol> 3。一次抗体の1％BSAリンス液と希釈の調製<ol><li>のセクションでは、5％BSAブロッキング溶液でインキュベートされていますが、1％のリンス液（1％BSA、0.3％TX-100、0.1 M PBS-渦解をBSAが完全に溶解するまで）をご用意。 </li><li>のセクションでは、5％BSAブロッキング溶液でインキュベートされていますが、1％のリンス液に一次抗体を希釈。 <ol><li> 8つのセクション（8×150μlを= 1,200μl）を、1,200μlの合計が必要です。一次抗体は1,500μL（約20％の余分なボリューム）で構成されています。 </li><li>一次抗体の希釈：PGP、1:500; TrkのA、1％BSAリンス液で1:500。 </li></ol></li></ol> 4。一次抗体に区画検のインキュベーション<ol><li> 96ウェルプレート（5行目）の指定されたウェルに希釈した一次抗体を150μlを加える。 </li><li>指定されたプライマリ抗体井戸（5行目）に5％ブロッキング溶液（行4）からセクションを転送します。 </li><li>乾燥および露光を避けるために、パラフィルム及びアルミ箔で96ウェルプレートを密封する。 </li><li>フラットロッカーで96ウェルプレート4でO / N°Cをインキュベートする。 </li></ol> 2日目： 5。 1％BSAリンス液で生検をすすぐ<ol><li>各行6でよく、図7、図8に1％BSAリンス液を150μlを加える。 </li><li> RTで1時間たびに1％BSAリンス液（列6,7、および8）で切片を三回すすぎ。リンスの間にフラットロッカー上のアルミホイルと場所とのウェルプレートをカバーしています。 </li></ol> 6。二次抗体の希釈 &lt;OL&gt; <li> 1％BSAリンス液（行8）のすすぎセクションが最後でインキュベートされているが、1％BSA溶液でリンス二次抗体を希釈する。 <ol><li> 8つのセクション（8×150μlを= 1,200μl）を、1,200μlの合計が必要です。二次抗体は1,500μL（約20％の余分なボリューム）で構成されています。 </li><li>二次抗体の希釈液：1％BSAリンス液でTrkのA（アレクサフルーア647ロバ抗ヤギ、1:250）のためのPGP（アレクサフルーア488ロバ抗ウサギ、1:250）、のために。 </li></ol></li></ol> 7。二次抗体に区画検のインキュベーション<ol><li> 96ウェルプレート（行9）の彼らの指定ウェルに希釈した二次抗体を150μlを加える。 </li><li>よく二次抗体に1％BSAブロッキング溶液（行8）（行9）からセクションを転送します。 </li><li>乾燥および露光を避けるために、パラフィルム及びアルミ箔で96ウェルプレートを密封する。 </li><li>指定した二次抗体Oのセクションをインキュベート4℃/ N°フラットロッカー上のC。 </li></ol> 8。 1％BSAリンス液で生検をすすぐ<ol><li>行10,11、および12の各ウェルに1％BSAリンス液を150μlを加える。 </li><li> RTで1時間たびに1％BSAリンス液（列10,11、および12）で切片を三回すすぎ。リンスの間にフラットロッカー上のアルミホイルと場所とのウェルプレートをカバーしています。 </li></ol> 9。顕微鏡スライドとマウント区分検の準備<ol><li>生検のセクションでは、1％BSAリンス液（行12）の最後のすすぎにインキュベートされていますが、顕微鏡スライドを準備します。 </li><li>一度スライドに1％BSAすすぎ溶液50μlを置きます。 </li><li> 1％BSAリンス液（行12）からセクションを削除し、指定した顕微鏡スライド上の1％BSAリンス液50μlのドロップに配置します。セクションの位置を最適化した後、対策を講じて、球根のガラスピペットで余分な1％BSAリンス液を除去標本に触れないように。 </li></ol> 注：セクションが折り返されていないことを確認し、試料が顕微鏡スライドの表面に平らにする必要があります。 <ol start="4"><li>顕微鏡スライド上に生の近くにDAPIでゴールド退色マウンティング試薬を延長の代わりに1滴。 22x22のmmの顕微鏡カバーガラスを取り、優しく生と延長のドロップDAPIドロップゴールド退色防止剤の上に置きます。各セクションごとに繰り返します。 </li><li>暗闇の中で室温でO / N顕微鏡スライドが乾燥しましょう​​。 </li></ol> 注：ピペットチップを使用して、任意の気泡を取り除きます。 Gold退色防止試薬を延長過剰拭き取り。 パートB：共焦点イメージング 10。共焦点像<ol><li> FluoViewバージョン5.0ソフトウェアと40X油浸（1.3 NA）客観的かつズームで2回共焦点顕微鏡オリンパスFluoView 500レーザーを使用して画像蛍光シグナル。 </李&gt; <li>それぞれ543 nmのヘリウムネオングリーンレーザーと633 nmのヘリウムネオン赤色レーザーを励起するためにアレクサフルーア488とアレクサフルーア647を使用してください。アレクサフルーア488信号が赤LUTによって緑見上げるテーブル（LUT）とアレクサフルーア647で表されます。 </li><li>信号を強化するためには400μmで、各検出器のための共焦点開口部を設定します。シーケンシャルスキャンは1,024×信号分離を最大化するために1,024の解像度で撮影する必要があります。 </li><li>カルマンアベレージ（2フレーム）と1.2μmのZステップの間隔（FluoViewソフトウェアによって計算された最適なスキャンユニットに基づく）を使用して三次元のZシリーズをキャプチャします。 </li></ol>パートC：三次元可視化とアニメーション 11。 3次元（3D）可視化とアニメーション<ol><li> 3D画像セットを可視化するImaris x64のソフトウェアで開くFluoviewファイル（バージョン7.3、ビットプレンAG）。 </li><li>として神経特定の信号のコントラストを向上させるために必要な表示に調整します。 </li><li> suコマンドを作成します。真皮表皮境界を可視化するためにデータポート。境界線を描画する描画モードで等高線ツールを使用します。 </li><li>基礎蛍光シグナルを見るために境界に半透明な表面を割り当てます。 </li><li> 3D映画のスナップショットイメージを作成するために、3D蛍光シグナルの静止画をキャプチャします。 </li><li> 3D映画を作成するためにアニメーション機能を使用します。画像（ 図2、図3、及び図4）別々にマージされた各信号を表示するために360度を数回回転させることができる。毎秒15フレームでアニメーション化された200のフレームで構成されるムービーを作成するためにアニメーションを設定します。生のAVIファイルとして各ムービーを保存します。 </li><li> VirtualDubのソフトウェア（バージョン1.9.4）で最終AVIムービーを圧縮します。 </li></ol>

<ol><li>Lauria, G., Holland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+innervation%3A+changes+with+aging%2C+topographic+location%2C+and+in+sensory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy.</a> J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).</li>
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<li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+swellings+predict+the+degeneration+of+epidermal+nerve+fibers+in+painful+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies.</a> Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).</li>
<li>Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+nerve+fiber+density%2C+axonal+swellings+and+QST+as+predictors+of+HIV+distal+sensory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy.</a> Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).</li>
<li>Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+27%3A+Neural+plasticity+after+nerve+injury+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).</li>
</ol>

宣言するために特別の利害関係はありません。

IENFDの測定は広く末梢神経障害13,14の程度を決定するために使用されている。現時点では、最も一般的に使用されるプロトコルは、表皮の基底膜を貫通する神経線維の密度を測定し、それは考慮に軸索の分岐および/または神経の形態学的変化を取ることはありません。また、電流IENFD分析はPN 15の痛みの存在とIENFD相関することが示されていない。 我々は以前侵害IENFD数の増加は、DB / dbマウスにおける疼痛行動、2型糖尿病5のマウスモデルに関連付けられていることを報告した。そのレポートでは、まず侵害IENFを研究するための二重免疫蛍光プロトコルを適用した。現在の研究では、PNの患者から、ヒトの皮膚への我々のプロトコルを展開します。二重免疫蛍光分析は、仲介IENFsのサブセットで、合計IENF及び侵害IENF両方の測定値を提供します痛み。これらの侵害IENFはTrkのAや他の侵害受容神経ペプチド5のために主に陽性である。痛みを伴う神経障害のために類似した二重免疫蛍光分析はラウリアら...

現在のところ、それは小さなファイバ神経障害、3つ6-8を診断するために使用され得る皮膚パンチ生検から、表皮内神経線維密度、（IENFD）を定量化する医師にとって一般的である。生検は、遠位脚（DL）、外果より10センチメートル、および近位大腿（PT）、前腸骨棘9 20以下CMから取得されます。すべてIENFは、タンパク質遺伝子産物9.5（PGP）、パン神経マーカー10-12を使用してラベルが付いています。現在のところ、明視野顕微鏡6 PGP染色によって決定IENFD用いた小型光ファイバ神経障害を診断するための標準的な方法です。さらに、いくつかの研究グループは、PGP免疫組織化学7-9用免疫のプロトコルを使用している。小さな繊維神経障害は、一般的に神経因性疼痛に関連付けられています。さらに、痛みの処理のために不可欠IENFの役割を理解するために、我々は、痛みを生成繊維で共標識合計IENFに技術を開発した。 NocicepTIVE IENFは、特にAδおよびC線維、PGPでIENFの共同ラベリングと侵害受容性マーカー、トロポミオシン受容体キナーゼ（Trkは）5を通して研究することができる。ムーブ痛覚の開発に必須である神経成長因子に対する高親和性受容体である。 TrkはA陽性侵害受容神経線維はペプチド性繊維であることを明示サブスタンスP（SP）およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）。以前は、ラウリアらはPN、侵害受容性マーカー10との共同標識PGP陽性IENFを研究する二重標識法を適用した。我々の以前の研究では、我々はTrkの陽性IENFを実証しなく、Trkの陰性IENF、痛みを伴う糖尿病性神経障害5の動物モデルにおいてアップレギュレートされた。この共同標識法はIENFDとPNに関連付けられている形態学的変化を研究する能力を合計する侵害受容IENFDの定量化を比較する機能を提供します。侵害受容IENFとコンパを可視化する機能侵害IENFDにIENFD合計の定量化を再度客観的疼痛の存在の証拠、そしておそらくPNに伴う痛みの重症度に関する洞察を提供することができます。また、この手法は、動物モデルの皮膚に適用可能である。以前の研究と比較して、現在のプロトコルは、2D画像解析で発生するエラーを回避する機会を作成し、3次元画像解析のための方法が記載されている。

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-4</td><td>To make up 1X PBS</td></tr><tr><td>Image-IT FX Signal</td><td>Invitrogen</td><td>I36933</td><td>Image-IT</td></tr><tr><td>Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit)</td><td>AbD Serotec</td><td>7863-0504</td><td>PGP</td></tr><tr><td>Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat)</td><td>R&D Systems</td><td>AF1056</td><td>Trk A</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ロバ &-ウサギ</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>AF488 ロバ &-ヤギ</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 ロバ &-ヤギ</td><td>Invitrogen</td><td>A21447</td><td>AF647 ロバ &-ヤギ</td></tr><tr><td>アルブミン、ウシ血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Triton X- 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>TX-100</td></tr><tr><td>未校正ループ</td><td>LeLoop</td><td>MP 199025</td><td>接種ループ</td></tr><tr><td>96ウェルアッセイプレート</td><td>コーニングインコーポレイテッド</td><td>3603</td><td>ウェルプレート</td></tr><tr><td>Prolong Gold 退色防止試薬 DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス 22x22 mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-541-B</td><td>カバースリップ</td></tr><tr><td>スーパーフロストプラス 顕微鏡スライド</td><td>フィッシャー科学</td><td>12-550-15</td><td>顕微鏡スライド</td></tr><tr><td>オリンパス Fluoview レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FV500</td><td>共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>最適切断温度</td><td>さくら</td><td>4583</td><td>OCT</td></tr><tr><td>ライカ クライオスタット</td><td>ライカ</td><td>CM1850</td><td>クライオスタット</td></tr></tbody></table>

人間の皮膚生検における侵害受容性表皮内神経線維の三次元イメージング

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

皮膚パンチ生検は、一般に周辺多発神経1,2の診断のための表皮内神経線維密度（IENFD）を定量化するために使用される。現在のところ、遠位脚部（DL）と長さに依存する多発3の評価のための近位大腿（PT）からの3mm皮膚生検を採取するのが一般的である。しかし、IENFsの多方向性質のために、2次元（2D）イメージングの分析を通して神経構造を重複検査する困難である。あるいは、三次元（3D）画像化は、このジレンマのためのより良い解決策を提供することができる。 現在のレポートでは、痛みを伴う神経障害（PN）を研究するために3D画像を適用するための方法を提示する。 IENFsを識別するために、皮膚サンプルをタンパク質遺伝子産物9.5（PGP）、パンニューロンマーカーの免疫蛍光分析のために処理される。現在のところ、それはIENFDが阻止用いた小型光ファイバ神経障害を診断するための標準的な方法です明視野顕微鏡4を使用してPGPの免疫組織化学によって採掘。現在の研究では、PGPを使用して、合計IENFDを識別するために二重免疫蛍光分析を適用し、侵害受容IENF、神経成長因子5（TrkのA）、高親和性受容体トロポミオシン受容体キナーゼを認識する抗体を使用することによって。 PGPとTrkの抗体との共染色IENFの利点は明らかにPGP陽性、侵害受容繊維を染色することによって、PNの研究に利益をもたらす。これらの蛍光信号はPNと関連付けIENFの侵害IENFD及び形態学的変化を決定するために定量することができる。蛍光画像は、共焦点顕微鏡で取得し、3次元解析のために処理されます。 3Dイメージングは​​さらにPNに関連付けられている形態学的変化を分析するために、回転力を提供します。まとめると、蛍光共染色、共焦点イメージング、3次元解析が明らかにPNの研究に利益をもたらす。

私たちは、PNの患者からPTとDL皮膚生検でIENFの形態を研究する現在のプロトコルを適用した。皮膚は、3名の被験者から、PNに関連付けられた病理形態を実証するためにユタ大学で集めた。被験者が含まれます：ケース1：2型糖尿病のPNの歴史（期間：14ヶ月、疼痛スコア：51）;と51歳の男性ケース2：PNの歴史を持つ56歳の男性をとケース3：2型糖尿病（期間：42ヶ月、疼痛スコア：46）のPNの歴史を持つ66歳の男性、2型糖尿病（：;疼痛スコア108ヶ月47期間）の。定量的な官能試験及び神経伝導研究を含む神経学的検査履歴とは、末梢神経障害を評価するために実施した。疼痛スコアは、0〜100のビジュアルアナログ痛みのスケールに基づいて決定した。 このプロトコルを使用して、我々は、ヒトの皮膚におけるIENFs（ 図2）の3次元構造を研究することができる。 図2の</strオングは&gt;、PGP陽性IENFsは緑色信号によって同定された、とTrkの陽性IENFsは赤信号で標識した。すべてTrkはA陽性IENFsはPGPにもプ...

痛みを伴う神経障害（PN）における侵害受容性表皮内神経線維（IENFs）の変化を調べるために、我々が直接侵害受容IENFsで観察された三次元形態学的変化を調べることができるプロトコルを開発した。 IENFsの三次元解析はPNでIENFの形態学的変化を評価するための可能性を秘めている。

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

本手順の全体的な目的は、ヒト皮膚生検切片に免疫組織化学染色を施し、3次元イメージングを通じて、疼痛性ニューロパチーに関連する表皮内神経線維の形態学的変化を研究することです。まず、個々のヒト皮膚生検切片に対して3日間の浮遊切片免疫組織化学プロトコルを実施します。次に、共焦点顕微鏡を用いて、厚さ50 micronの皮膚切片をイメージングします。次に、MRSソフトウェアを用いてフロービュー画像ファイルを処理し、元の免疫蛍光画像の3次元ムービーファイルを作成します。最終ステップとして、vdwソフトウェアまたは同様のソフトを使用してムービーファイルを圧縮します。最終的に、これらの3次元画像解析結果により、疼痛性ニューロパチーに伴う形態学的変化を研究することが可能になります。現在、術中の表皮神経線維密度は、ニューロパチーを診断するための定量的な手法として用いられています。これらの真皮内神経線維と侵害受容バイオマーカーを共染色することで、この合併症に伴う痛みを解明できる可能性があります。現在の二次元イメージングプロトコルには、神経線維の重なりなど、多くの限界があります。対照的に、3次元イメージングは、軸索の腫脹や白濁など、ニューロパチーに関連する形態学的変化のさらなる解析や、軸索体積の測定を可能にします。疼痛性ニューロパチーへの洞察を得るために、有意義な3次元アニメーションを作成するための高品質な画像を取得するための措置を講じることが重要です。また、この手法は、厚い臓器培養や3次元細胞培養などの他のサンプルにも適用でき、3次元的な形態の複雑な変化を観察および測定することができます。本プロトコルの本文に記載されている手順に従ってヒト皮膚生検組織の固定および切片作成を行った後、この画像に示すように、染色のために使用する96ウェルプレートにラベルを貼ります。次に、ラベルを貼った96ウェルプレートの1行目の各ウェルに ITFX signal を 150 µL ずつ加え、2行目と3行目のすべてのウェルに 1 XPBS を 150 µL ずつピペットで分注します。白金ループを用いて、患者の下腿遠位部生検組織から採取した 50 mm の切片を、image が入ったウェルのいずれかに移します。次に、同一患者の近位部から採取した50 mmの切片を、画像を含む次のウェルに移します。この手順を、さらに3名の患者から採取した下腿遠位部および大腿近位部の切片で繰り返します。切片をフラットロッカーで30分間インキュベートし、その間に生検切片のインキュベートを行いながら、5%ブロッキング溶液を調製し、BSAが完全に溶解するまでボルテックスで撹拌します。切片を2行目のPBSに移し、10分間揺盪させた後、3行目のPBSで10分間洗浄します。再び揺盪させながら、4行目の各ウェルに5%BSAブロッキング溶液を150 µLずつ分注し、切片をこれらのウェルに移します。切片を5%BSAブロッキング溶液中で、室温のフラットロッカーを用いて1〜2時間インキュベートします。このインキュベーションの間に、BSAが完全に溶解するまでボルテックスして1%洗浄溶液を調製し、この溶液を用いて一次抗体を必要濃度まで希釈します。次に、96ウェルプレートの5行目のウェルに、希釈した一次抗体を150 µLずつ加えます。インキュベーション時間が経過した後、ブロッキング溶液中の切片を適切な一次抗体ウェルに移動させます。続いて、乾燥と光曝露を防ぐためにプレートをパラフィルムとアルミホイルで密閉し、フラットロッカーを用いて4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、6行目、7行目、および8行目の各ウェルに1% BSA洗浄液を150 µLずつ加え、室温でロッキングしながら1時間かけて切片をこれらの洗浄工程に通過させます。このとき、各洗浄ステップにおいてプレートが遮光されていることを確認してください。切片が最後の1% BSA洗浄液でインキュベートされている間に、プロトコルの記述部分の指示に従って、二次抗体を1% BSA洗浄液で希釈します。インキュベーション時間が経過した後、96ウェルプレートの9行目の指定されたウェルに、希釈した二次抗体を150 µLずつ加えます。切片をこれらのウェルに転送し、プレートをパラフィルムとアルミホイルで覆い、フラットロッカーを用いて4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、10行目、11行目、および12行目の各ウェルに1% BSA洗浄液を150 µLずつ加え、前述と同様に、それぞれの溶液で切片を1時間ずつ洗浄します。生検切片を1% BSA洗浄液の最終洗浄液中でインキュベートしている間に、顕微鏡スライド1枚につき1% BSA洗浄液を50 µLずつピペッティングして、スライドを準備します。最終洗浄液から切片を取り出し、指定した顕微鏡スライド上の1% BSA洗浄液 50 µLの液滴の中に配置します。切片の位置を最適化した後、検体に触れないよう注意しながら、バルブ付きガラスピペットを用いて過剰な1% BSA洗浄液を除去します。顕微鏡スライド上の生検組織の近くに、DPIを含むProlong Gold封入剤を1滴滴下します。次に、22 × 22 mmのカバーガラスを取り、生検組織と封入剤の滴の上にそっと被せます。ピペットチップを用いて気泡を取り除き、余分なProlong Goldを拭き取ります。Antifa試薬を用いてください。各セクションについてこの操作を繰り返し、顕微鏡スライドを室温・暗所で一晩乾燥させ、翌日に観察します。共焦点顕微鏡を用いて蛍光信号を撮像します。ここでは、40倍油浸対物レンズを備えたOlympus FlowView 500 レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用し、FlowView version 5.0 ソフトウェアを用いて2倍のズームで撮像しています。Alexa 4階88およびAlexa 6階47を使用して、それぞれ543 nanometerのヘリウムネオン緑色レーザーと633 nanometerのヘリウムネオン赤色レーザーを励起させます。信号を増強するため、各検出器のコンフォーカルアパーチャを400 micronsに設定します。シーケンシャルスキャンは、10 24 × 10 24の解像度で実施してください。信号の分離を最大化するため、MRSX 64ソフトウェアまたは同等のソフトウェアでまずオープンフロービューファイルを開き、カルマン2フレーム平均化を用いてフロービューソフトウェアにより算出された最適スキャンユニットに基づき、1.2 micronのZステップ間隔で3次元Zシリーズをキャプチャします。3D画像セットを可視化するには、神経特異的信号のコントラストが高まるよう、必要に応じてディスプレイを調整してください。真皮表皮境界を可視化するためにサーフェスを作成します。描画モードの輪郭ツールを使用して、境界線を描画します。下層の蛍光信号を確認し、3D蛍光信号の静止画をキャプチャするために、境界線に半透明のサーフェスを割り当てます。3D動画のスナップショット画像を作成するには、アニメーション機能を使用して3Dムービーセットアニメーションを作成し、1秒あたり15フレームでアニメーション化された200フレームで構成される動画を作成します。各動画をRAW AVIファイルとして保存し、最終的なAVI動画をVirtualDubまたは同様のソフトウェアで圧縮してください。このビデオでは、侵害受容性表皮内神経線維の3D画像を示しています。最初の画像では、緑色にラベル付けされたPGP陽性の表皮内神経線維（全表皮内神経線維を表す）と、赤色にラベル付けされたTRKA陽性の表皮内神経線維（侵害受容性表皮内神経線維を表す）が表示されています。最後に、症例1の皮膚サンプルにおけるPGP陽性の侵害受容性表皮内神経線維を示す画像が表示されました。スケールバーは20 micronsを表しています。次のビデオでは、痛みを伴うニューロパチーの表皮内神経線維における軸索腫脹の3D画像を示します。皮下神経叢内で緑色のシグナルによりPGPで標識された表皮内神経線維に沿って、矢印で示された軸索腫脹が確認できます。症例2の皮膚サンプルにおいて、スケールバーは10 micronsを表しています。この3D画像は、痛みを伴うニューロパチーにおける表皮内神経線維の軸索分枝を示しています。症例3の皮膚サンプルでは、緑色の信号でPGPにより標識された表皮内神経線維に沿って、矢印頭で示される軸索分枝が確認できます。スケールバーは20 micronsを示しています。この手法に習熟すれば、免疫組織化学染色に1日3時間半をかけて4日間、共焦点イメージングおよび3Dアニメーションにサンプルあたり35分で完了させることができます。本手順を行う際は、検体サンプルが破れたり裂けたりしないよう注意を払い、組織を適切に移行および固定することが重要です。本手順に続き、皮膚の神経支配を評価するための3次元tric解析などの他の手法を用いることで、さらなる疑問を解消させることが可能です。腹部神経線維の分枝は、痛みを伴うニューロパチーの発症において重要な役割を果たしているのでしょうか？

three-dimensional-imaging-nociceptive-intraepidermal-nerve-fibers

Research

JoVE Journal

Medicine

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表皮内神経線維内のミトコンドリアの可視化

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三次元画像と人間の表皮内神経線維内のミトコンドリアの解析

シングルファイバー記録は、中枢および末梢神経系に適用可能な効果的な電気生理学的手法である。付着した坐骨神経を持つ無傷のDRGの調製と共に、伝導障害のメカニズムが調べられる。両方のプロトコルは、末梢神経系と痛みとの関係の理解を向上させます.

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複数の蛍光染色および組織クリアリングアプローチを使用した3Dパターンでの毛状およびグラブラス皮膚神経支配の実証

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マウス皮膚における触覚感覚軸索形態のバイタル2光子イメージング

学ぶ 三次元イメージングによる侵害受容性表皮内神経線維の形態変化解析。コンフォーカル顕微鏡とMRSソフトウェアを用いた人間皮膚生検の免疫組織化学的手法で、疼痛性ニューロパチーの神経線維変化を可視化する。

人間の皮膚生検における侵害受容性表皮内神経線維の三次元イメージング

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