Name: 不定冠詞インビトロモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学ぶ人末梢血単球の密度勾配遠心分離と負ビーズ分離によるマクロファージ分化法。M1・M2分極マーカーの定量PCR解析により、炎症性疾患の免疫応答メカニズムを解明する。

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1。プロトコル<ol><li>次のようにバッファを準備します。 <ol><li> PBMCの分離のためのバッファを準備します。PBS中= 0.02％EDTAを（使用0.5 M EDTA） &quot;バッファを洗う&quot;。 </li><li>単離のためにバッファを準備します。 &quot;MACSすすぎバッファ&quot; = 0.5％BSA（250 mg）を+ 2mMのEDTA（200μlの）+ PBS（50ミリリットル）。ドガバッファ。 </li><li> &quot;FACSバッファー&quot; PBS中= 10％FCSと &quot;固定バッファ&quot; PBS中= 1％PFA：細胞のFACS染色および保管するためのバッファを準備します。 </li></ol></li><li>前腕静脈から30ミリリットルの全血を引く。抗凝固剤としてEDTAを使用してください。 </li><li>次のようにPBMC（HISTOPAQUE）を単離： <ol><li> 2無菌の50mlチューブ（無ポリ - スチレン）を準備します。 </li><li> PBS 1:1でステップ2から血液を希釈します。 </li><li> + 25ミリリットルの全血/ PBSチューブあたり25ミリリットルのHISTOPAQUEを追加します。 HISTOPAQUEと血が混ざらないことを確認してください。 </li><li> RT、ブレーキなしで30分間400×gで遠心分離します。 </li><li>血漿および廃棄を吸引。 </li><li>クリーンの50ml浴槽に不透明なインターフェイスとピペットを吸引電子。 </li><li> PBS中0.02％EDTAを20mlを加える。 </li><li> 4℃で5分間、250×gで遠心</li><li>上清を捨てます。 </li><li> PBS中0.02％EDTAを10mlを加える。 </li></ol></li><li>次のようにセルを数える。 <ol><li> 10秒間ボルテックスでよく混ぜる。 </li><li> 200μlの細胞懸濁液+ 300μlのPBS中0.02％EDTA +トリパンブルー（200-500 cells/10正方形、そうでない希釈率を変更します）の500μLを取る。 </li></ol></li><li>次のように単球の負の分離を実行します。 <ol><li> 10分、120×gのためにステップ3.10で得られた細胞を遠心分離。上清を捨てます。 </li><li> 10 mlのPBS + 0.02％EDTA、10分間、120×gで遠心を追加することで、細胞ペレット2倍を洗ってください。 </li><li> 1ミリリットル10X PBSを加え、3秒間9ミリリットル滅菌水を追加します。 </li><li> PBS + 0.02％EDTAでもう一度洗浄し、10分間、120×gで遠心。 </li><li>遠心分離中数える。 </li><li> 5×10 7 / mlでEasySepバッファーに希釈します。 </li><li> 50ミリリットル/μlの単球濃縮コックを追加尾。 </li><li> 4℃で10分インキュベート</li><li> 30秒間ボルテックスビーズ。 </li><li> 50μL/ mlのビーズを追加します。 </li><li> 4℃で5分間インキュベート</li><li> 2.5ミリリットルの容積を完了するEasySepバッファーでいっぱい。解決策は今茶色がかった表示されます。 </li><li>磁石に入れ。 </li><li>室温で2.5分待ちます。この間磁気ビーズに結合した非単球細胞が管壁に移動し、そこに固執する。 </li><li>フレッシュ無菌チューブに非結合単球とバッファを注ぐ。このソリューションでは白っぽく見えます。 </li><li> PBS + 0.02％EDTAで一回洗浄し、10分間、120×gで遠心します。 </li></ol></li><li> 0.5×10 6個/ cm 2の密度でプラスチックの皿または多層プレートのプレートの細胞。培地/ 1×10 6個の細胞を1 mlを加える。 </li><li> 6-14日間興味のある条件下での培養細胞。 </li><li> （詳細については表1を参照）は、新鮮なメディアでのメディアの50％を置き換えることにより、3日後にメディアを変更してください。 </li><li>後の6日は、mRNAの分離、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット法、 等のための細胞を回収。 </li></ol>

<ol><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Gordon, S., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+plasticity+of+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes.</a> European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).</li>
<li>Ingersoll, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gene+expression+profiles+between+human+and+mouse+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets.</a> Blood. 115, 10-19 (2010).</li>
<li>Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+aldose+reductase+during+foam+cell+formation+as+possible+link+among+diabetes%2C+hyperlipidemia%2C+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).</li>
<li>Gleissner, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCL4+downregulates+the+atheroprotective+hemoglobin+receptor+CD163+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages.</a> Circ. Res. , (2009).</li>
<li>Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXC+chemokine+ligand+4+induces+a+unique+transcriptome+in+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages.</a> J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+human+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+polarization%3A+New+molecules+and+patterns+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression.</a> J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).</li>
<li>Verreck, F. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+il-23-producing+type+1+macrophages+promote+but+il-10-producing+type+2+macrophages+subvert+immunity+to+%28myco%29bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).</li>
<li>Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+monocyte-derived+macrophages+under+serum-free+conditions+improves+their+tumor+promoting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions.</a> PLoS One. 7, e42656(2012).</li>
<li>Boyle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+intraplaque+hemorrhage+evokes+a+novel+atheroprotective+macrophage+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype.</a> American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).</li>
<li>Cho, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+dendritic+cell-like+phenotype+in+macrophages+during+foam+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation.</a> Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).</li>
<li>Vogt, G., Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+human+macrophages+with+enhanced+antimycobacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).</li>
<li>Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+low+density+lipoprotein+exposure+alters+the+transcriptional+response+of+macrophages+to+inflammatory+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).</li>
<li>Qin, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).</li>
<li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+pma-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5, e8668(2010).</li>
<li>Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWahl%2C+LM+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li>
<li>Martín-Fuentes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+variation+of+scavenger+receptor+expression+in+human+macrophages+with+oxidized+low-density+lipoprotein+is+associated+with+a+differential+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response.</a> The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).</li>
</ol>

著者は利益相反を開示する必要はありません。

単球由来マクロファージは自然免疫系の主要な細胞型を表す。それらは、アテローム性動脈硬化症または癌2を含む多くの炎症性疾患において重要な役割を果たす。したがって、マクロファージ生物学を研究することは、多くの疾患の病態生理に知識を増大させるために不可欠であり、新規な治療法の開発を可能にする。 多くの研究は、マウスモデルの過剰発現を適用したり、興味のある特定の遺伝子を欠いた。単球由来マクロファージの場合、これはマウスおよびヒト単球および単球由来細胞4との間に実質的な違いがあるので、ヒトの疾患に関連するプロセスを研究するための最良の方法ではないと思われる。従って、一次ヒト細胞を利用して有効なモデルは、マクロファージの分化の疾患関連のメカニズムを研究するための優れた代替手段と思われる。 ここで紹介するin vitroモデルの明確な利点は、それがimmortaliに依存していないということですTHP-1や他の人のような14-15 ZED細胞株。細胞株は容易...

単球由来のマクロファージは自然免疫系の重要な細胞成分を表し、多くの急性または慢性炎症プロセス1に貢献しています。マクロファージは、アテローム性動脈硬化症や癌2のような多くの炎症性疾患において重要な役割を果たしている。マクロファージは、可塑性の高度を示し、局所微小環境3に応じて、異なる表現型を想定することができます。したがって、マクロファージの分化と異質性を研究することは、多くの疾患の病態生理学の知識を増大させるために不可欠であり、新たな治療標的とする新規治療法の開発の識別を可能にする。 多くの場合、マウスモデルは、特定の疾患の病態を研究するために使用される。しかし、マウスモデルを用いたマクロファージ生物学を勉強するいくつかの欠点が付属しています：（1）peripにおける白血球サブセット数の割合（ すなわち、単球および顆粒球）マウスやヒトのheral血がかなりマウスおよびヒトの病態生理における単球のさまざまな役割を示唆しているとは異なります。 （2）健康および疾患4の間に、それらの機能の実質的な差異を示唆するマウスおよびヒト末梢血単核球との間の遺伝子発現の実質的な違いがある。 （3）マウス単球およびマクロファージを識別するために使用されるマーカーの数（F4/80、LYC など ）、ヒト状況にマウスモデルにおいて調査結果の転送はむしろ困難になる、ヒト骨髄細胞には存在しない。 したがって、ヒトの疾患におけるマクロファージの分化と異質の理解を高めるために、我々は、ヒトマクロファージでの作業モデルを利用する必要がある。したがって、我々は、ここで使用することは簡単ですし、別のマクロファージPOの結果、様々な条件下でのin vitroでのヒト単球由来マクロファージの研究を可能にするヒト初代マクロファージ世代のモデルを記述larizationタイプ。いくつかの研究において、我々は、マクロファージ生物学および5-7ヒトアテローム性動脈硬化症への潜在的な関連性を分析するために単球由来の初代ヒトマクロファージのin vitroモデルにおいて使用している。 にもかかわらず、完全に死後得動物やヒト組織を用いた実験を交換しない、ここで説明するモデルは、病気のメカニズムや様々なヒト疾患との関連性が高いかもしれない治療標的の同定と検証を可能にします。

<table><tbody><tr><td>50 ml 遠心分離チューブ (滅菌)</td><td>Fisher</td><td>055398</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1X)、液体 (カルシウムまたはマグネシウムなし)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-8806</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>Fisher</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Macrophage-SFM (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>12065-074</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma</td><td>P-4458</td><td></td></tr><tr><td>Nutridoma-SP</td><td>Roche</td><td>11011375001</td><td></td></tr><tr><td>human M-CSF 10 &mu;g</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレート 6-well</td><td>Fisher</td><td>07-200-80</td><td></td></tr></tbody></table>

不定冠詞<em&gt;インビトロ</emヒトマクロファージの分化と偏光の不均一性を研究するために&gt;モデル

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

単球由来マクロファージは自然免疫系の重要な細胞型を表す。マクロファージ生物学を勉強して、マウスのモデルは、マウスおよびヒト単球由来マクロファージの間で表現型および機能の違いに苦しんでいます。したがって、我々はここでin vitroモデル初代ヒトマクロファージを生成して勉強するについて説明します。簡単に言えば、前腕静脈から引き出さ末梢血の密度勾配遠心分離後、単球は、負磁気ビーズ分離を使用して末梢血単核細胞から単離される。これらの単球は、その後、マクロファージの分化又は異なる種類の偏光を誘導するように特定の条件の下で6日間培養する。モデルは使いやすく、マウスと人間の間に種特異的な違いに起因する問題を回避。また、不死化細胞株の使用よりもインビボ条件下に近い。結論として、ここで説明するモデルはmacrophag勉強するのに適している電子生物学は、病気のメカニズムと新規治療標的を識別します。にもかかわらず、完全に死後得動物やヒト組織を用いた実験を交換しない、ここで説明するモデルは、病気のメカニズムや様々なヒト疾患との関連性が高いかもしれない治療標的の同定と検証を可能にします。

上記のプロトコルを使用して、我々は日常的に25.1×10 6±2.2×10 6 monocytes/100 mlの血液を（26の独立した実験の平均値±標準誤差、 図1A）を取得。 CD14のためにフローサイトメトリー染色によって決定された単球純度は日常的に、95％以上（97.1±0.4％、3つの独立した実験、 図1Bからの平均±標準誤差）である。トリパンブルー染色により決定される新たに単離した単核細胞の細胞生存率は95％であった（データは示さず）よりも日常的に大きくなる。最初に細胞は丸い形とフロートですが、彼らは通常、数時間以内に付着し始める。密着性が&quot;目玉焼き&quot;や紡錘状（ 図2）に向かって形状変化に関連付けられています。酸化LDL（最後の24時間は100μg/ ml）を加えての有無にかかわらず、M-CSF（100 ngの/ ml）をとの文化の中で6日後、細胞の約80％がoxLDLのにさらされていないTREのに対し、実行可能であるoxLDLのとatmentは約70％の生存細胞（ ...

単球由来のマクロファージは自然免疫系の重要な細胞である。ここでは、使用して簡単に説明する<em&gt; in vitroで</emこれらの細胞を生成するために&gt;モデル。勾配遠心分離、負ビーズ単離および特異的な細胞培養条件を使用して、単球由来マクロファージは、表現型および機能的研究のために生成することができる。

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

次の実験の全体的な目標は、ヒト末梢血から単球を分離し、それらをさまざまなマクロファージ分極タイプに区別することです。これは、最初に密度勾配遠心分離によってヒト末梢血単核細胞を単離することによって達成されます。第2のステップとして、ネガティブビーズ単離を行い、純粋なCD14陽性単球を得る。次に、単球を特定の条件下で培養して、特異的に分極したマクロファージを誘導します。最終的に、マクロファージ分極マーカーの培養条件に応じた差次的発現は、定量的PCRによって決定できます。この方法は、マクロファージの異なる分極タイプへの分化を解剖するのに役立ちます。アテローム性動脈硬化症などの炎症性疾患において非常に重要な特徴です。ボランティアから前腕静脈から30ミリリットルの全血を採取した後、血液を2本の非ポリスチレン50ミリリットルの円錐管に均等に分割します。次に、各チューブの血液を10ミリリットルのPBSで希釈します。次に、各チューブの25ミリリットルの全血とPBSに25ミリリットルのヒストパックを加え、ヒストパックと血液が混ざらないように注意します。その後、チューブを400G、室温で30分間、休憩なく遠心分離します。スピン後、まずプラズマ層を吸引し、次に不透明な界面層を新しい50ミリリットルのチューブに移します。界面から細胞を20ミリリットルのPBSとCDTAで250Gおよび4°Cで5分間洗浄します。次に、上清を廃棄した後、ペレットを10ミリリットルのPBSとCDTAに懸濁し、10秒間ボルテックスして細胞をよく混合します。次に、200マイクロリットルの細胞懸濁液を300マイクロリットルのPBSとEDTAで希釈し、500マイクロリットルのトライアムブルーで希釈します。10平方あたり約200〜500個の細胞を達成するために、ヘモサイトメーターは、細胞を120Gで10分間3回スピンダウンすることにより陰性単離を開始する。次に、細胞を洗浄してもう一度カウントした後、10 XPBSの1ミリリットルを追加し、1ミリリットルあたり7個の細胞のうち10の5倍で簡単にセットできる緩衝液で希釈します。次に、単球濃縮カクテルの1ミリリットルあたり50マイクロリットルで、細胞を摂氏4度で10分間インキュベートします。インキュベーションボルテックスの最後の1分間、単球濃縮ビーズを30秒間セプトします。次に、ビーズ1ミリリットルあたり50マイクロリットルを細胞に加え、ビーズを細胞懸濁液中でさらに5分間インキュベートします。2回目のインキュベーション後、細胞溶液の量を最大2.5ミリリットルにします。EEPバッファーを増やすと、溶液は茶色がかった色に見えるようになります。次に、チューブをEEP磁石に室温で2分半入れます。ビーズ結合細胞が付着する機会を得た後、非結合単球を含む緩衝液を新鮮な滅菌チューブに注ぎます。結合していない細胞をPBSとEDTAで一度洗浄し、細胞をマルチウェルプレートに移し、6つの細胞を培養プレートに1×10回あたり1ミリリットルの培養培地を加えると、溶液は白っぽい色に見えるようになります。最後に、目的の実験条件下で細胞を6日間培養し、マクロファージの分化を誘導します。3 日後にメディアの半分を 6 日後に新しいメディアと交換します。目的の実験的分析のために細胞を採取します。上記のプロトコルを使用して、6つの単球のうちの約25倍10は、CD14のフローサイトメトリー染色によって決定される100ミリリットルの血液単球純度から日常的に得られ、最初に培養物に添加すると95%より日常的に大きくなります。単球は最初は丸い形をしており、数時間以内に浮かびます。しかし、彼らは付着し、6日後には目玉焼きや紡錘のような外観になります。MCSF単独の培養、または酸化LDLを添加した培養では、過去24時間、または酸化LDLに曝露されていない細胞の約80%が、ヨウ化プロピジウムによって決定されるように生存可能です。一方、酸化LDLによる染色処理では、6日間の培養後に約70%の細胞生存率が得られます。MCSFフローでは、サイトメトリー解析により、細胞が白血球マーカーCD 45 roを発現し続ける一方で、単球マーカーCD 14をダウンレギュレーションすることが示されています。細胞培養中にマクロファージの分極を誘導する可能性のある特定の条件に応じて、分極を成功させるためには追加のマーカーが必要です。特定の条件により、マクロファージの分極が誘導される可能性があります。例えば、M1分極マクロファージはIL 6やTNF αなどの典型的なマーカーを発現し、M 2分極マクロファージはCD 36やCD 2 0 6を発現するため、マクロファージは機能実験でさらに研究することができます。例えば、酸化LDLの取り込みは、蛍光標識LDLを用いて研究することができます。この実験では、細胞を1ミリリットルあたり10マイクログラムのDII標識酸化LDLに4時間曝露し、核をdpiで再染色しました。このヒストグラムは、MCSF誘導マクロファージによるDII酸化LDL取り込みのフローサイトメトリー測定を示しており、未処理のコントロール細胞を表す灰色の単色のヒストグラムと黒色のオープンヒストグラムが示されています。酸化LDL処理マクロファージを発現後。この技術により、研究者はヒトマクロファージの分化と不均一性を研究することができます。これにより、動脈硬化症などの炎症性疾患を研究し、新たな疾患メカニズムや新規治療標的を特定することができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、初代単球のマクロファージへのプライミングを示しています。初代ヒト単球は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を使用してM1様炎症誘発性表現型に、またはマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を使用してM2様抗炎症表現型に単離および分化することができます。...

初代単球のin vitro培養とマクロファージへの分化

このビデオでは、末梢血由来の単球をM1またはM2マクロファージに分化および分極させる手順を示します。顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、リポ多糖、およびインターフェロン-γとのインキュベーションは炎症誘発性M1マクロファージを産生し、マクロファージコロニー刺激因子およびインターロイキン-4とのインキュベーションは抗炎症性M2マクロファージ産生を誘導します。...

単球由来細胞のマクロファージ様細胞への分化と分極

記事は容易に簡単に適応を説明...

骨髄由来マクロファージを用いたマクロファージ分極の調査

私たちは、ヒトマクロファージの生成のための簡単​​かつ効率的なプロトコルを提示する。バフィーコートは、二重密度勾配遠心分離によって処理され、単離された単球は、次いで、テフロンコーティングした細胞培養バッグ中でマクロファージに分化される。これは、マクロファージ収量を最大化し、その後の実験のために細胞の回収を容易にします。...

ダブル勾配遠心、テフロンコーティングされた細胞培養バッグ中のマクロファージへの分化によるヒト単球の単離

ここで提示するプロトコルは、顕微鏡法および蛍光染色を用いて生細胞培養におけるマクロファージ細胞外トラップ(MET)産生を検出するプロトコルである。このプロトコルは、免疫蛍光染色によって特異的なMETタンパク質マーカーを調べるためにさらに拡張することができる。...

分化ヒト単球由来マクロファージにおける細胞外トラップ放出のIn Vitro刺激と可視化

このプロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞からのマクロファージの堅牢な生成とその後の特性評価のための方法を記述する。細胞表面マーカー発現、遺伝子発現、および機能アッセイは、これらのiPSC由来マクロファージの表現型および機能を評価するために使用される。...

多能性幹細胞からのヒトマクロファージの生成と特性

このプロトコルは、ヒトM1-またはM2偏光マクロファージにおける 結核...

ヒト単球由来M1とM2の分極化と 結核 菌感染時のフローサイトメトリーによる解析

M2様腫瘍関連マクロファージ(TAM)は、がんにおける腫瘍の進行および予後不良に関連している。このプロトコルは、14日以内にTHP-1単球様細胞をM2様マクロファージに再現的に分化し、偏光するための詳細なガイドとして機能します。このモデルは、腫瘍微小環境内におけるTAMの抗炎症効果を調べる基礎となる。...

ヒト単球様THP-1白血病細胞株を用いたM2様表現型へのマクロファージ分化と分極化

ここでは、 in vitroでのインプラント表面の免疫調節能力を評価するための詳細なプロトコルを提示し、現在のプロトコルの信頼性と再現性を向上させ、さらなる研究を促進することを目的としています。血中単球由来マクロファージを用いて分泌性サイトカインプロファイル、mRNA発現、細胞表面マーカーをモニターし、チタン上に培養されたマクロファージの分極を調べました。...

インプラント表面上のM1およびM2ヒト単球由来マクロファージの分極と特性評価 

単球とマクロファージは、健康と病気に不可欠な非常に可塑的で再プログラム可能な免疫細胞です。彼らは、特定の分化プログラムと表現型を採用することにより、幅広い刺激を感知し、反応します。私たちは、マクロファージの分極とリプログラミングを研究するためのin-vitroモデルを標準化し、研究に貴重なツールを提供しています。...

In-vitroアッセイのためのヒト単球由来マクロファージのリプログラミングモデル

学ぶ人末梢血単球の密度勾配遠心分離と負ビーズ分離によるマクロファージ分化法。M1・M2分極マーカーの定量PCR解析により、炎症性疾患の免疫応答メカニズムを解明する。

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