光音響膀胱造影

本手順の目的は、非毒性の光学的濁度トレーサーとして近赤外光吸収を利用し、生体内での非電離光音響膀胱造影法を実証することです。まず、実験動物に麻酔を施します。次に、腹部の除毛を行い、特製の動物ホルダーの上にラットを配置し、カテーテルを挿入し、イメージング領域に超音波ゼリーを塗布することで、イメージングに向けた準備を整えます。

次に、光吸収剤を膀胱に注入する前と後で、光音響膀胱造影システムを用いて腹部領域の画像を取得します。最終的に、このプロセスにより、電離放射線曝露がなく、造影剤の長期的な蓄積もない、非電離かつ非侵襲的な光音響膀胱造影システムを用いたラット膀胱のイメージングが可能になります。音響トモグラフィーは、強力な光吸収コントラストと、生物学的組織における高い超音波空間分解能を持つため、主要な生物医学的イメージング手法となっています。光トモグラフィーの主な利点は、電離放射線が完全に排除されていること、注入された薬剤が膀胱内に蓄積しないこと、そして迅速かつ費用対効果が高いことです。

本手順では、532 nmの光を発生させるために波長変換（第2高調波発生）を行ったQスイッチNd:YAGレーザーを使用します。レーザー出力は、波長可変範囲が680 nmから2,500 nmである光パラメトリック発振器（OPO）を通過させます。まず、OPOのパルス幅をレーザーショットあたり5 nsに設定し、繰り返し周波数を10 Hzに設定します。

次に、メチレンブルー造影剤に使用するため、光学波長を667 nanometersに設定します。別の造影剤を使用する場合は、この波長を変更する必要があるかもしれません。OPOから出射される光を直角プリズム経由で、自作の球面円錐レンズに導入します。

円錐レンズは、直径2.5 centimeterのBK7レンズを用いて、円錐角152度で製作します。次に、拡散したドーナツ状の光ビームを、透明アクリル製の厚さ2.5 centimeterの最適コンデンサーに通して方向を変えます。コンデンサーの上面および底面の直径は、それぞれ6.1 centimeterおよび4.8 centimeterです。

ビームパターンが完全なリング状であることを確認してください。ドーナツ状のビームパターンが適切に生成されていない場合、皮膚表面から発生する光音響信号が支配的になります。その結果、深部組織のイメージングを達成することが困難になります。

次に、動物とレーザー間の音響結合を強化するための小型の水容器を準備します。底部の開口部は、光学的におよび音響的に透過性のある、透明で薄いポリエチレンフィルムで覆われています。黒色の絶縁テープを使用して、線状の光を超音波の焦点領域に同軸上に合わせます。

これらが適切に整合されていない場合、システムの信号対雑音比（S/N比）が低下します。次に、光音響波を検出するために、球面集束超音波トランスデューサを取り付けます。ここでは、Olympus NDT社製 V 3 0 8 浸漬トランスデューサを使用します。

データ収集は5 MHzで行われ、横方向および軸方向の分解能はそれぞれ590 µmおよび144 µmです。次に、トランスデューサを広帯域超音波パルス受信機に接続して光音響波を増幅させ、これをオシロスコープに接続します。システムのセットアップが完了したら、オシロスコープで光音響波の到達時間を測定することにより、ALINE画像と呼ばれる1次元時間分解画像を取得します。

次に、LabVIEWを用いてリニアラスターステージを機械的に制御し、2次元Bスキャンおよび3次元光音響画像を取得します。2.5 cm × 2.4 cm × 1.5 cmの領域で3D画像を取得する場合、3次元イメージングには1サンプルあたり約25分かかります。ステージを制御するためのLabVIEWプログラムをセットアップしてください。

X方向にステップサイズ 0.2 millimeters で125サンプル、Y方向にステップサイズ 0.4 millimeters で60サンプル、そしてZ方向にサンプリングレート 50 megahertz で500データポイントを取得します。最後に、MathWorks MATLAB ソフトウェアシステムを構築し、生データを取得・変換して、体積データを表す一連の断面 bcan 画像へと処理します。記録された画像は、2D 最大振幅投影画像として表示されます。

ラットをイメージングの準備にするため、体重200～250 gの雌性Sprague-Dawleyラットにケタミンとキシラジンの混合液を腹腔内投与して麻酔をかけます。次に、除毛クリームを用いて腹部周辺の5 cm四方の被毛を除去します。その後、ラットを特製の動物ホルダーの上に配置します。

次に、22ゲージのカテーテルに潤滑剤を塗布して挿入の準備をし、カテーテルのハブが開口部に達し、カテーテルから尿の排出が始まるまで、カテーテルの遠位端を尿道に水平に挿入します。最後に、光音響膀胱造影システムの写真において、動物ホルダーの上かつ水容器の下にラットを配置します。イメージングを開始するため、in vivo光音響イメージング実験の間、気化イソフルランを用いてラットを完全に麻酔します。

次に、音響結合を改善するため、動物の皮膚表面とプラスチック膜の間に超音波ジェルを塗布します。続いて、準備したMathWorks MATLABプログラムを実行し、造影剤注入前のコントロール用3次元光音響画像を取得します。コントロール画像の取得後、1 mLシリンジを用いて、カテーテル経由でメチレンブルー水溶液を膀胱内に注入します。

投与後48時間まで、12時間ごとに一連のin vivo光音響イメージングを行います。次に、ペントバルビタールを150 mg/kgの過剰量投与してラットを安楽死させます。その後、膀胱と腎臓を取り出し、ガラスプレートの上に置きます。

ex vivoイメージングのコントロールとして、未注射個体の膀胱および腎臓を使用してください。光音響膀胱造影システムの水容器の下にガラスプレートを配置し、イメージング中の音響結合を改善するために、摘出した臓器とプラスチック膜の間に超音波用ジェルを塗布します。ここに示されている画像は、メチレンブルー注入前に667 nanometerのレーザー光を用いて撮影した、ラットの腹部の2次元XYスキャン画像です。

ここでは、血液が光を吸収して光音響信号を生成するため、血管を容易に観察できますが、造影剤がないため膀胱は視認できません。メチレンブルー造影剤の注入から12時間後に撮像すると、膀胱全体に非常に強い振幅が現れ、膀胱が容易に視認できるようになります。24時間後および48時間後に再度測定すると、造影剤は体外に排出されており、光パラメトリック発振器で光学波長を850 nanometersに変更すると、メチレンブルー造影剤はエネルギーを吸収しなくなり、不可視となります。

これにより膀胱を効果的に消失させることができ、システムのもう一つのネガティブコントロールとして機能します。ここに示す点線に沿ったZ平面から得られた深度分解画像は、ここに示すように関心領域に沿った追加の深度データを提供し、あるいは画像全体に対して行うことで、その領域を三次元的に記述することが可能です。本ビデオでは、光音響顕微鏡（Photoacoustic microscopy）と呼ばれる、in vivoでの膀胱イメージングにおける非侵襲的かつ非電離プロセスの実現可能性を実証しました。

当社の光音響イメージングシステムを用いて、光学的エフェクトトレーサーを注入し充填させた左膀胱のイメージングに成功しました。将来的には、この技術を小児患者における膀胱尿管逆流などの泌尿器科的問題のモニタリングに、低放射線量で適用できる可能性があります。本手法の携帯性と低コストである点は、この種のアプリケーションに最適です。