Name: の分離熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）後期感染赤血球 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: 学ぼう、Plasmodium falciparum後期感染赤血球の磁気分離法。ヘモゾインの常磁性を利用し、ほぼ100%の純度で感染細胞を分離・濃縮できます。寄生虫の侵襲能を保持し、マラリア研究の精度向上に貢献します。

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この作品は、CSおよびSecretaríaナシオナルデCiencia yをTecnología（SENACYT）からLCに博士課程奨学金、パナマへの助成PRB-009によって賄われていた。

プロトコルのすべてのステップは、遠心分離を除いて、サンプルを無菌に保つためにフード内に実施されるべきである。 1。 Pの後期段階の分離熱帯熱マラリア原虫感染赤血球寄生虫で常磁性を付与hemozoinが、属に共通の代謝物であるので、マラリア原虫感染赤血球のすべての後期段階では、この方法論で区切ることができます。文化の高い寄生虫（3-10％）はこのプロトコルを使用してより良い収率を得るために推奨される、典型的な文化は2-4％のヘマトクリット（赤血球容積率）、1〜8％の寄生虫血症（感染の割合が含まれますが、赤血球）。トレガとヤンセン1で説明したように寄生虫は培養することができる。 <ol><li>シンプル、マルチパートの設定はすべてのシゾント分離手順のために組み立てる必要があります。このために、LSの列、磁気MidiMACSセパレータとミルテニーバイオテク（ 図1からMACS MultiStand </strong&gt;）を使用されています。まず、金属スタンドに磁気分離器をアタッチし、セパレータに磁気カラムを配置します。 </li><li>別のチューブに（全体で50ミリリットルconicalsを使用）、RPMI1640の23.2ミリリットルと作業ソリューションを作成する7.5％の炭酸水素ナトリウム750μlを混合します。廃棄するため手で追加のチューブを持っていると寄生虫文化のフロースルー収集。 </li><li>それを平衡化するために列に作業溶液3mlを追加し、フロースルーチューブには廃棄してください。 </li><li> Pの8ミリリットルを追加列に熱帯熱マラリア原虫は、文化、できるだけ早く作業ソリューションの最後の部分として培養による列から押し出されていることを確認して、受信したチューブは、結合していない文化のリカバリを開始する収集で置き換えられます。これは、任意のさらなる文化を希釈を避けるために必要です。 </li><li>コラムを通じて文化の流れが止まった後、列の残りの赤血球を押し出すために、作業溶液1mlを加える。 </li><li>ステップを洗濯：列に作業ソリューションの別の3ミリリットルを追加し、他のチューブにフロースルーとして保存されている文化を希釈避けるために、 &quot;廃棄&quot;チューブに流れる液体を収集します。 </li><li>溶出：3ミリリットルがカラムを通過した後は、スタンドから後者を切り離し、15 mlチューブの上に置きます。 </li><li>繰り返しになりますが、列に作業溶液3mlを加える。このステップでは、列のビーズに閉じ込められた後期原虫感染赤血球を溶出する。 </li></ol> 注：この時点で、必要に寄生虫の量に応じて、元の文化の中で寄生虫の限界に明らかに被写体コレクションの別のラウンド/ sを開始します。流れが定常状態を維持している列であれば再利用することができます。 <ol start="9"><li>収集された寄生虫の濃度：室温で150×gで5分間溶出液を含む15 mlチューブを遠心寄生された赤血球から濃いペレットを形成する。 </li><li> （以下の手順2を参照してください）​​非常に小さいサンプルを取り、顕微鏡を通して濃度と総収量を決定するのに十分な液体残して上清を取り除きます。 </li><li>後期原虫の分離と回収が十分に達成されている場合は、この時点では、新鮮な培地を再び回収した培養をインキュベートする。 </li><li>その後の実験に必要なボリュームと溶液中で収集された寄生虫を希釈します。 </li></ol> 2。純度や歩留まり解析<ol><li>血球計数器を用いて、光学顕微鏡下でカウントした寄生虫の濃度を確認します。カウントするには、血球計数器のカバースリップの下で収集寄生虫やメディアミックスの10μlを添加する。血球計数器の4つの象限の寄生虫の数を数えて、4で合計数を割る。感染した電子の濃度を得るために、10 4によって、その数を掛けるmlあたりrythrocytes。 </li></ol> ノート：a）混合物の濃度が、多かれ少なかれ、培地を加えて、ペレットを再懸濁した瞬間にユーザによって決定される。作業濃度がμlあたり5.5×10 4 schizontes（これは一般的に収集された寄生虫に100から300μlを添加することによって達成される）が示唆された。この濃度の20μlをメディアや赤血球100μlのミックスの最終容量に追加された場合は、代表的な4％ヘマトクリット文化で約1％の寄生虫血が得られるであろう。 B）血球計算板の下にカウントは、赤血球がチャンバ内の試料が乾燥として溶解開始以来、迅速でなければならない。過半数であるべき感染赤血球は、非感染のものからそれらを区別するダークスポットの内側を、表示されます。 <ol start="2"><li>薄層を実行ギムザ、それらを乾燥させ、10％メタノールで非常に急速にスライドを固定することによって、コレクションの純度を評価するために染色し、tを浸漬ギムザの20％溶液で裾を蒸留水で希釈した染色。彼らは空気で乾燥した後、顕微鏡下で検査できるようになるまでの10分間、スライドを染色する。よく70％以上の寄生虫は達成可能である必要があります。 </li></ol>

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<li>Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+cells+and+subcellular+particles+with+Percoll%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Biophys.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 44 (1-2), 1-30 (2000).</li>
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<li>Trang, D. T., Huy, N. T., Kariu, T., Tajima, K., Kamei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+concentration+of+malarial+parasite-infected+red+blood+cells+and+removal+of+contaminating+white+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells.</a> Malar. J. 3, 7(2004).</li>
<li>Nillni, E. A., Londner, M. V., Spira, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+separation+of+uninfected+erythrocytes+from+those+infected+with+Plasmodium+berghei+and+for+isolation+of+artificially+released+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Parasitenkd%22%5BJournal%5D)">A simple method for separation of uninfected erythrocytes from those infected with Plasmodium berghei and for isolation of artificially released parasites.</a> Z. Parasitenkd. 64, 279-284 (1981).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もない。

マラリア原虫P.の in vitro 培養における熱帯熱マラリア原虫は、より文化の最高増殖時点で感染していない赤血球の半分以下で、限られた寄生虫血症を呈する。ほとんどの研究実験のためには、感染赤血球でのみ動作することが望ましい。この目的を達成するために、分離技術は、感染によると文化を分割することが必要である。便利なメソッドは非感染赤血球11と二つのグループの異なる密度を活用微分遠心のバリエーションのシリーズを透過性とlyzeするストレプトリジンOの使用を含む。これらの方法のいくつかは、ゼラチン浮選12とPlasmion 13の使用を含め、他の赤血球をトラップするために様々な密度の層を作成するために使用される最も一般的な物質は寄生虫14にいくつかの毒性を提示することができる密度勾配媒体パーコールです。 我々はヘクタールVEでもPaulによって記述され、さらにhaemozoin、寄生虫によるヘモグロビンの消化によって産生される活性結晶の常磁性に基づくトラン<sup...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>修正したRPMI 1640ヘペス</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> R4130 </td><td> 10％ヒト血清、2％グルコース、0.2％炭酸水素ナトリウムを補充</td></tr><tr><td> MidiMACSセパレータ</td><td> MACSミルテニーバイオテク</td><td> 130-042-302 </td><td></td></tr><tr><td> MACS MultiStand </td><td> MACSミルテニーバイオテク</td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> LSの列</td><td> MACSミルテニーバイオテク</td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td>血球計</td><td> Grafco </td><td> Grafcoノイバウアー商工会議所</td><td>多くの他のサプライヤーを通じて見つけることができます</td></tr></tbody></table>

の分離<em&gt;熱帯熱マラリア原虫（plasmodium falciparum）</em磁気手段によって&gt;後期感染赤血球

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

他の原虫種とは異なり、P.熱帯熱マラリア原虫は、その研究1を容易に実験室で培養することができる。達成寄生虫は≈40％の限界に達することができますが、治験責任医師は、通常約10％の割合を維持します。多くの場合、それが文化を豊かにし、与えられた実験を続行し、感染していないものから寄生虫含有赤血球細胞（赤血球）を単離することが必要である。 ときはP.熱帯熱マラリア原虫が赤血球に感染する寄生虫が低下し、ヘモグロビン2,3から供給されます。しかし、寄生虫は非常に有毒な鉄を含有するヘム部分4,5に対処する必要があります。寄生虫はhaemozoin 6,7と呼ばれる不活性液晶ポリマーにヘムを変換することによって、その毒性は見逃されている。この鉄含有分子は、その食胞に格納されており、その中に金属がヘム8のものと異なる酸化状態を有している。ヘム鉄の鉄状態ozoinはそれに感染していない赤血球中に存在しない常磁性を付与する。侵略の寄生虫が成熟に達すると、haemozoinの内容もPの最新のステージでさらに常磁性を授けている、9を増加赤血球内部の熱帯熱マラリア 。 この常磁性、Pの最新の段階に基づいてfalciparum感染、赤血球は、磁気ビーズを含むカラムを通して文化を通過させることによって分離することができる。それらを含む列がマグネットホルダ上に配置された場合、これらのビーズは、磁気になる。フロースルーは、ほとんどの部分、非感染赤血球および寄生虫の含有するもの初期段階のため、含まれていながら、常磁性に起因する感染した赤血球は、その後、列の中に閉じ込められます。 ここで、我々は良い寄生虫の生存率10を維持した磁気カラムを持つ後期寄生虫の人口を豊かにするための方法論を記述している。この手順を実行した後、付着していない文化が残っている寄生虫が成長し続けることができるようにインキュベーターに戻すことができます。

図2では、磁気カラムを通過する文化が前（A）と手順（B）後、表示されます。矢印は、 図2Aの感染赤血球を指すと、 図2に示すように、1〜2感染赤血球は通常100X倍率分野で見られる。典型的な手順では、5％の寄生虫血症（ 図2A）で培養を皮切りに、この手順のパフォーマンスは、通常97パーセント-100％（ 図2B）の原虫で赤血球を生成します。 20Xのオーダーの寄生虫の濃縮が容易に達成可能であり、カラムを通して文化のいくつかのパスは、Pの高収率を達成することができる熱帯熱マラリア原虫の後期感染赤血球、必要に応じて、または所望。 <img src="/files/ftp_upload/50342/50342fig1.jpg" alt="図...

hemozoinの常磁性特性は後期を分離するために使用されている<em&gt;熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</em&gt;感染した赤血球は、文化の中で成長しています。方法は、シンプルで早いのが特長です、寄生虫のその後の侵襲的な機能に影響を与えません。

の分離<em&gt;熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</em磁気手段によって&gt;後期感染赤血球

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Plasmodium Falciparumは、赤血球内のみに寄生するヒト寄生虫です。増殖過程において、本寄生虫は赤血球内の分子を栄養源として利用しますが、ヘモグロビン中の鉄分子は寄生虫にとって毒性があるため、これらを回収してヘミンと呼ばれる不活性な結晶に封じ込めます。このヘモ結晶により、寄生虫にはある程度の常磁性が付与されます。この常磁性という特性を利用して、寄生虫を宿さない赤血球から感染赤血球を分離します。磁石を用いることで、寄生率が非常に低い培養物であっても、ほぼ100%の寄生率まで濃縮することが可能です。感染赤血球と非感染赤血球をこのように分離することは、過剰な赤血球による混在要因を排除して、寄生虫の特定の形質を研究する必要がある多くの実験において非常に有用です。ここで示す手法は迅速かつ簡便であり、寄生虫への影響もありません。本日は、Plasmodium falciparumのシゾント期の分離手順について説明します。この多成分構成の装置は、分離を行うたびに組み立てる必要があります。まず、カラムホルダーを金属製スタンドに設置し、次に磁性カラムをセットホルダーに配置します。本手順では、Miltenyi社のLsカラムを使用します。次に、50 mlチューブを用いて、23.2 mlのRPMI 1640と750 µLの7.5%炭酸ナトリウム溶液を添加します。これが本工程を成功させるための作業溶液となります。開始前にカラムの校正を行う必要があります。次に、ワークソリューションを3 mL加え、これを「discard」とラベル付けされた50 mLチューブに流します。続いて、Plasmodium FCI 培養液を8 mLカラムに加えます。培養液によってワークソリューションの最後の一滴がカラムから押し出された直後に、下部の別の50 mLチューブに交換してください。培養液の回収を開始します。カラム内の培養液の流れが止まったら、未吸着の赤血球を押し出すために、ワーキングソリューションを1 mlカラムに加えます。次に、培養液の濃度を変化させないよう、ワーキングソリューションを3 mlカラムに加え、回収先を廃棄チューブに切り替えます。3 mLの溶液がカラムを通過し終えたら、スタンドからカラムを取り外し、15 mLチューブにセットします。次に、3 mLのワーク溶液を加えます。これにより、カラムのビーズにトラップされたchizenが溶出されます。実施する実験に応じて、必要なだけの寄生虫を回収することができます。培養液中の密度が高い場合は、1回目の回収で必要な量を得られる可能性があります。そうでない場合は、カラムの結合容量が培養液中の寄生虫含有量よりも少ないと考えられるため、培養液を繰り返しカラムに通すことで、より多くの寄生虫を回収することが可能です。完了後、15 mlチューブを150

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

の選択熱帯熱マラリア原虫</em人間の脳内皮細胞へのCytoadhesion用>寄生虫

RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析<em&gt; in situで</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

不定冠詞<em&gt;のin vitro</em研究する&gt;共同感染モデル<em&gt;熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</emヒトの第一次単球由来の免疫細胞に&gt;-HIV-1の相互作用

この方法は、血小板の媒介凝集表現型を調査...

の血小板媒介クランピングのためのシンプルなプロトコル<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</emリソース悪い設定で、&gt;感染した赤血球

このビデオでは、単球による標識およびオプソニン化された熱帯熱マラリア原虫感染赤血球を含むフローサイトメトリーベースの食作用アッセイを実演しています。フローサイトメトリーは、単球の蛍光を同定し、食作用によるオプソニン化赤血球の同定に成功したことを裏付けています。...

寄生虫感染赤血球の抗体媒介性食作用の定量化のためのアッセイ

抗体機能を測定することは、 熱帯熱マラリア原虫マラリアに対する免疫を理解するうえで重要です。この方法は、生存可能なメロゾイトの精製を記載し、フローサイトメトリーによるオプソニン化依存性食作用を測定する。...

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ヒトマイクロRNAは、宿主赤血球から熱帯熱マラリア原虫に移行します。ここでは、合成マイクロRNAを宿主赤血球にトランスフェクションし、熱帯熱マラリア原虫からすべてのRNAを単離するために使用される技術について説明します。...

小さなRNAおよびリボソームの占有の調節の役割を調査する方法<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</em

ここでは、検出及び減衰全反射赤外分光光度計と多変量解析を使用して感染した水溶液赤い血液細胞で熱帯熱マラリア原虫の定量化のプロトコルを提案する.

熱帯熱マラリア原虫減衰全反射赤外分光法と多変量データ解析による水溶液赤い血球での検出と定量

この作品は、熱帯熱マラリア原虫感染赤血球によるリリース細胞小胞 (Ev) の役割を調査するプロトコルについて述べる.特に、我々 は EVs...

マラリア感染時の細胞の小胞の機能評価

このプロトコルの全体的な目標は、自然に 熱帯熱マラリア原虫...

フローサイトメトリーベースアッセイによる熱帯 熱マラリア原 虫に対する自然獲得食細胞症誘導抗体の測定

集束イオンビームミリングを使用して、凍結した生物学的サンプルを急落させてクライオ電子線トモグラフィー用にガラス体オングリッドラメラを作成します。...

クライオ電子線トモグラフィー用デュアルビーム走査電子顕微鏡を用いたガラス質生体試料からのラメラの調製(英語)

学ぼう、Plasmodium falciparum後期感染赤血球の磁気分離法。ヘモゾインの常磁性を利用し、ほぼ100%の純度で感染細胞を分離・濃縮できます。寄生虫の侵襲能を保持し、マラリア研究の精度向上に貢献します。

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