Name: 蛍光共焦点ビデオ顕微鏡を使用して腫瘍血管新生のin vivoイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: 学ぶ蛍光共焦点ビデオ顕微鏡法でマウス結腸腫瘍モデルの微小循環を定量化する方法。機能的毛細血管密度と血管透過性を評価し、がん治療薬の効果測定に応用できる。

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1。造影剤の調製<ol><li> FITC-デキストラン70kDaのために、注射用量は500 mg / kgの（FITC-デキストラン10mgを体重20gのマウスについての生理食塩水を0.1mlに希釈した）である。 </li><li>エージェントは、光に長すぎるさらしてはならない。漂白を回避するために、アルミホイルでチューブを覆うことが推奨される。 </li></ol> 2。麻酔<ol><li>マウスをキシラジンの1:4の混合物の腹腔内注射により麻酔した（ロンプン2％、バイエル、ピュトー、フランス）とケタミン（ケタミン500、Virbacの、カロス、フランス）、それぞれ66 mg / kgで264 mg / kgの20グラムのマウス用。 </li></ol> 3。関心のある器官の調製<ol><li>私たちは、（例えば、皮下腫瘍の上）興味のある場所でマウスを剃毛。動物の毛は、多くの場合、白の自動蛍光性である。ときは黒、それが光を吸収する。 </li><li>画像化される器官に面する皮膚を切開した。それはbleedinまで待つことが重要ですGは、それ以外の場合は、血液中に漏出し、画像を汚染する、造影剤を注入する前に停止しました。 </li></ol> 4。買収<ol><li>造影剤は、頚静脈又は尾静脈のいずれかを介して注射した。蛍光造影剤の非存在下で観察される器官でないか、またはほとんどバックグラウンド信号が存在しない。 </li><li>プローブは、画像化される器官の前方に配置した。我々の研究では、これは腫瘍であった。 </li><li>レーザーは、腫瘍を照射し、毛細血管の蛍光を見るためにスイッチを入れた。 </li><li>腫瘍は毛細血管網を可視化するために記録しながら非常にゆっくり移動プローブを移動させることにより手動で調査した。これは、着実に手を維持することが重要であり、この技術はほとんど経験が必要です。我々の研究では、この最初のステップは、機能的な毛細管密度の定量化を可能にした。 </li><li>第二段階は、時間の経過とともにダイナミックな買収だった。この研究のために、我々は70kDaのFITC-デキストランを使用。ほとんどの正常臓器には間質漏れはありませんが、腫瘍であります。 （我々の場合のように）時間をかけて同じ場所の画像を取得するためには、関心領域にプローブを維持するためにシステムを設定することが重要です。これは、プローブを保持するために手作りのサポートを使用することにより、前記プローブの先端に超音波ゲルのビットを配置することによって行った。記録する前に、時間は、腫瘍と接触して配置されているプローブを安定化するために費やされた。位置を固定した後、マウスの呼吸のために最小限の動きがありました。レーザは毛細血管漏出の存在を検出するために20分間3画像30秒毎に記録するためにスイッチを入れた。これは、造影剤の退色を低減するために、各記録の間にオフにされた。 </li><li>我々の実験において、マウスを腫瘍の組織学的分析のための手順の終了時に屠殺した。 </li></ol>

<ol><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+concepts+of+the+angiogenic+process%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Fundamental concepts of the angiogenic process.</a> Curr Mol Med. 3 (7), 643-651 (2003).</li>
<li>Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibered+confocal+fluorescence+microscopy+%28Cell-viZio%29+facilitates+extended+imaging+in+the+field+of+microcirculation.+A+comparison+with+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Res%22%5BJournal%5D)">Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy.</a> J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).</li>
<li>Charnley, N., Donaldson, S., Price, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 467, 25-51 (2009).</li>
<li>Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+contrast+enhanced+optical+imaging+of+capillary+leakage%5BTitle%5D)+AND+%22Technol+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage.</a> Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).</li>
<li>Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+nitric+oxide+production.+Mechanisms+of+vascular+albumin+leakage%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage.</a> Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).</li>
<li>Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+capillary+leakage+is+involved+in+the+onset+of+anaphylactic+hypotension%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension.</a> Anesthesiology. , (2012).</li>
<li>Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).</li>
<li>Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+tumour+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Disrupting tumour blood vessels.</a> Nat Rev Cancer. 5 (6), 423-435 (2005).</li>
<li>Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+antitumor+treatment+by+means+of+fluorescence+molecular+tomography+with+an+annexin+V-Cy5.5+conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).</li>
<li>Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+quantification+of+optical+contrast+agent+dynamics+in+rat+tumors+by+use+of+diffuse+optical+spectroscopy+with+magnetic+resonance+imaging+coregistration%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration.</a> Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

腫瘍微小循環の研究は、腫瘍成長、播種および治療​​1への応答の病態生理学を理解する上で必要不可欠となっている。光学イメージングは​​、蛍光造影剤を用いて毛細血管を観察し、形態学的（機能的毛細血管密度）および機能（インデックス漏れ）のパラメータを定量化するために使用することができる技術の一つである。 我々は本研究で使用した蛍光顕微鏡イメージングは​​、利点および限界の両方を有する。一つの利点は、使用される造影剤のサイズを選択することができることである。ここでは、70kDaのFITC-デキストランと、実験開始時内皮障壁を通る漏れは、私たちは初期形態観察を可能にした、最小限であった（くねり、アナーキーネットワーク、等 。）との間に良好なコントラストが血管の血管および間質8、及び遅延の後、観察した20分かけて造影剤の漏出。面内（xY）の解像度は、私たちの代わりに、他のほとんどのイメージング技術（MRI、CT、超音波、PET ...）と同様に、巨視的レベルで、顕微鏡レベルで血管や間質を可視化するために可能にした、（3.5μm）で高...

血管新生は、既存の血管からの新たな血管の形成を含む複雑なプロセス1である。細動脈、毛細血管、および細静脈からなる組織の微小循環における病理学的変化は、例えば、癌、炎症、または糖尿病などの疾患の広い範囲に関与している。これは、定量的に微小血管の構造および機能を評価するための方法を開発することが不可欠である。画像化は、リアルタイムでおよびインビボで 、又は非マイクロ侵襲的に微小血管の研究を可能にし、同じ動物において2時間にわたって反復測定。 現在、ダイナミック造影（DCE）イメージング3は、一般的に、組織の微小循環を評価するために使用される。ダイナミック造影画像化を経時的に静脈内注射したトレーサーの生体内分布を、以下の技術である。この買収により、定量的なパラメータは、組織の血管新生を反映して抽出することができる。 DCEイメージング最も頻繁にCT、MRIまたは超音波で使用されている。しかし、これらのイメージング技術は、特定の実験装置を用いた以外、その解像度は、ほとんどの場合、巨視的なままであるため、微小血管の直接観察することはできません。 本論文では、繊維質共焦点ビデオ顕微鏡で、ダイナミック造影光学イメージングを用いて微細なスケールでそして生体内で腫瘍血管系を研究することを提案する。我々は、その分子量および組織の内皮細胞の特性を研究し4によれば、間質への内皮バリアを介して血管又は漏れ内で排他的に残る高分子造影剤（FITC-デキストラン）を使用した。これが漏れて間質に蓄積することにより、正確に血管を描出することにより、両方の微小血管構造の研究、および毛細血管の透過性を可能にした。

<table><tbody><tr><td>インスリンserynge Myjector 1ml 29G</td><td>テルモヨーロッパ</td><td>BS-05M2913</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセインイソチオシアネート-デキストラン 70 kDa </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01619HH</td><td>100 mg/mL 生理食塩水で希釈</td></tr><tr><td>ファイバー共焦点ビデオ顕微鏡</td><td>Cellvizio - MaunaKea Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr>LEICAFCM1000 Leica Microsystems<td>用キャリブレーションおよびクリーニングキット</td><td></td><td>LSU-488</td><td>4 °Cで保管。C</td></tr><tr><td>プローブ ProFlexTM Z</td><td>MaunaKea Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>モザイクソフトウェア</td><td>MaunaKea Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>船舶検出ソフトウェア</td><td>MaunaKea Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光共焦点ビデオ顕微鏡を使用して腫瘍血管新生のin vivoイメージング

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

光ファイバ束と繊維質共焦点蛍光in vivoイメージング、蛍光共焦点顕微鏡と同じ原理を使用しています。それは、光ファイバを介してその場要素で蛍光を励起し、同じ光ファイバを介して 、放出された光子のいくつかを記録することができます。光源は、ファイバ束内の要素を介して励起光を送信し、それが試料上を走査するように、画素によって画像画素を再現レーザである。このスキャンは、専用の画像処理ソフトウェアと組み合わせることにより、非常に高速であるように、12フレーム/秒の周波数にリアルタイムで画像を得ることができる。 我々は、共焦点蛍光ビデオ顕微鏡装置を用いて、定量的にキャピラリーの形態及び機能を特徴付けるための技術を開発した。我々の実験の最初のステップは、毛細血管網を視覚化するために、腫瘍の4象限に5秒の動画を撮影することでした。すべての映画は、ソフトウェア（Iを用いて処理したmageCell、選ばれた直径（ここでは10ミクロン）の周囲に血管の自動化されたセグメント化を行い、マウナ·ケア·テクノロジー、パリフランス）。したがって、我々は、総血管面積画像の総面積との比である「機能毛細血管密度を &#39;、定量化できた。このパラメータは、通常、病理学ツールを使用して測定し、微小血管密度の代理マーカーであった。 第二段階は、間質への毛細血管壁を介して高分子造影剤の漏出を定量化するために20分間かけて腫瘍の映画を記録することであった。血管におけるその上間質におけるシグナル強度の比を測定することによって、「インデックスリーク &#39;が毛細血管の透過性のための代理マーカーとして働く得た。

収集したデータを用いて、定量的に微小循環を反射異なるパラメータを分析することができる。 我々は、（高分子蛍光造影剤フルオレセインイソチオシアネート-デキストランの注射後、 インビボ繊維質共焦点蛍光ビデオ顕微鏡システム（Cellvizio、マウナケア技術、パリ、フランス2）を用いてのbalb-cマウスに移植された結腸腫瘍の末梢血管ネットワーク内を研究70kDaの（シグマアルドリッチ、サンカンタンFallavier、フランス）は、それぞれ488 nmおよび520 nmの励起波長と発光波長との（私たちのイメージングシステムとの互換性のため）の分子量を有するFITC-デキストラン）。 我々の実験の最初のステップは、毛細血管網を視覚化するために、腫瘍の4象限のそれぞれに5秒の動画を撮影することでした。これは、腫瘍の血管新生の代表サンプリングを可能にした。すべての映画は、ソフトウェア（はImageCell、マウナを用いて処理したケアテクノロジー、パリフランス）は、直径5〜20μmの...

本論文では、ダイナミック造影蛍光ビデオ顕微鏡を用いてインビボで腫瘍の微小血管を分析する手法を提案する。二つの定量的なパラメータを取得した：機能性腫瘍の血管分布を反映した毛細血管密度、および内皮の壁の漏出インデクス反映漏れ。

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

本実験の全体的な目的は、共焦点蛍光ビデオ顕微鏡システムを用いて、マウス大腸がんモデルにおける微小循環を定量化することです。まず、造影剤を静脈内に注入し、腫瘍の微小血管の動画を記録します。その後、腫瘍の4つの領域を画像化し、機能的毛細血管密度を定量化します。次に、内皮壁の透過性を反映する毛細血管漏出指数の定量化のため、血管から間質への造影剤の移行を観察します。最終的に、腫瘍血管の形態学的および機能的特性を定量化することで、腫瘍モデル間の差や標的治療後の変化を検出することが可能になります。このダイナミック造影光学的イメージング技術により、腫瘍の微小循環の解析が行えます。毛細血管の密度と透過性を定量化することで、腫瘍血管の構造と機能を反映させます。この手法は腫瘍生理学への知見を提供しますが、アナフィラキシーショック、炎症、心血管疾患、糖尿病などの他の系にも適用可能です。まず、麻酔をかけたマウスの目的部位を剃毛します。止血後、イメージング対象となる臓器に面するように皮膚を切開します。機能的毛細血管密度を定量化するために、造影剤を注入します。まず、イメージング対象の臓器の前面にプローブを配置します。次に、臓器を照射するレーザーを点灯させます。その後、手を安定させたまま、蛍光毛細管ネットワークが可視化されるのに合わせて、プローブをゆっくりと動かしながら記録します。経時的な動的収集を安定させるため、プローブの先端に超音波ジェルを少量塗布し、プローブをハンドメイドサポートに設置します。プローブを目的の臓器に接触させた後、プローブを固定します。位置が安定したら、毛細血管漏出の有無を検出するため、レーザーを30秒ごとに3枚の画像を20分間記録するように設定します。関心領域である臓器の4つの象限それぞれで5秒間の動画を撮影した後、造影剤の退色を抑えるために、各記録の間にレーザーをオフにします。毛細管ネットワークのプロセスを視覚化するため、適切なソフトウェアを用いて動画を確認し、選択した直径に基づいて画像内の血管を自動セグメンテーションし、機能的毛細管密度（総血管面積と画像総面積の比率）を定量化します。次に、毛細管漏出の有無を検出するために行ったダイナミック撮像において、0、5、10、20分の時点で、毛細管内に3つの関心領域（ROI）を、間質に3つの関心領域をそれぞれ設定します。最後に、3つの異なる毛細管および隣接する間質領域内の信号強度を平均し、漏出指標のパーセンテージを算出します。この公式において、IPを血管周囲または間質の強度、IIを血管内強度とすると、機能的毛細血管密度パラメータは、通常は病理学的ツールを用いて測定される微小血管密度の代替マーカーとなります。ここでは、得られた画像の種類と血管セグメンテーションの結果の例を示します。この例では、機能的毛細血管密度は36%と測定されました。これらの画像では、造影剤投与後0分、5分、10分、および20分における、漏出指数1.47の間質への造影剤漏出の例が示されています。いずれの画像においても、造影剤の注入直後には、血管が高信号の線状構造として描出されます。間質には信号は見られません。しかし、時間が経過するにつれて、造影剤が異常な腫瘍を通じて間質へと漏出していく様子が観察されます。この手順を習得するには、内皮バリアに関する経験が必要です。ただし、一度習得すれば、適切に実施することで30分以内に完了させることができます。

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