Name: 組換えコアヒストンおよびヌクレオソームポジショニングDNAからのヌクレオソーム配列の組み立て (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 学ぶヌクレオソーム配列の組み立て法。組換えコアヒストンとヌクレオソームポジショニングDNAを用いて、沈降速度実験と原子間力顕微鏡で飽和度を評価する。クロマチン構造と遺伝子制御の理解に貢献します。

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この作品は、NIHの助成金GM45916およびGM66834 JCHし、この作品をAKための国際レット症候群財団のフェローシップでサポートされていたにもNIHがGM088409とハワードヒューズ医学研究所のKLへの貢献を助成金によって支えられて

<ol><li>Luger, K., Mader, A., Richmond, R., Crystal Sargent, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 7, (1997).</li>
<li>Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+the+chromatin+fiber+in+solution%3A+determinants%2C+mechanisms%2C+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of the chromatin fiber in solution: determinants, mechanisms, and functions.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 361-392 (2002).</li>
<li>McBryant, S., Adams, V., Hansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+architectural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Chromatin architectural proteins.</a> Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).</li>
<li>Hansen, J. C., Ausio, J., Stanik, V. H., van Holde, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+reconstituted+oligonucleosomes%2C+evidence+for+salt-dependent+folding+in+the+absence+of+histone+H1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Homogeneous reconstituted oligonucleosomes, evidence for salt-dependent folding in the absence of histone H1.</a> Biochemistry. 28 (23), 9129-9136 (1989).</li>
<li>Szerlong, H. J., Prenni, J. E., Nyborg, J. K., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activator-dependent+p300+acetylation+of+chromatin+in+vitro%3A+enhancement+of+transcription+by+disruption+of+repressive+nucleosome-nucleosome+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Activator-dependent p300 acetylation of chromatin in vitro: enhancement of transcription by disruption of repressive nucleosome-nucleosome interactions.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (42), 31954-31964 (2010).</li>
<li>Cirillo, L. A., Lin, F. R., Cuesta, I., Friedman, D., Jarnik, M., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+of+compacted+chromatin+by+early+developmental+transcription+factors+HNF3+%28FoxA%29+and+GATA-4%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4.</a> Molecular Cell. 9 (2), 279-289 (2002).</li>
<li>Nguyen, C., Gonzales, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((chromatin+structure+associated+with+methylation-induced+gene+silencing+in+cancer+cells%3A+correlation+of+accessibility%2C+methylation%2C+MeCP2+binding+and+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation.</a> Nucleic Acids Research. 29 (22), 4598-4606 (2001).</li>
<li>Cuesta, I., Zaret, K. S., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forkhead+factor+FoxE1+binds+to+the+thyroperoxidase+promoter+during+thyroid+cell+differentiation+and+modifies+compacted+chromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The forkhead factor FoxE1 binds to the thyroperoxidase promoter during thyroid cell differentiation and modifies compacted chromatin structure.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (20), 7302-7314 (2007).</li>
<li>Simpson, R. T., Stafford, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+features+of+a+phased+nucleosome+core+particle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural features of a phased nucleosome core particle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 80 (1), 51-55 (1983).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li>
<li>Lowary, P., Widlund, H., Cao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+motifs+and+free+energies+of+selected+natural+and+non-natural+nucleosome+positioning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences.</a> Journal of Molecular Biology. 288, 213-229 (1999).</li>
<li>Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Core+Histone+N-terminal+Tail+Domains+Function+Independently+and+Additively+during+Salt-dependent+Oligomerization+of+Nucleosomal+Arrays+%2A%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Core Histone N-terminal Tail Domains Function Independently and Additively during Salt-dependent Oligomerization of Nucleosomal Arrays *.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 33701-33706 (2005).</li>
<li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+histones+and+nucleosome+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 119 (4), 1-16 (1999).</li>
<li>McBryant, S. J., Klonoski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+histone+H4+N-terminal+domain+function+during+nucleosomal+array+oligomerization%3A+roles+of+amino+acid+sequence%2C+domain+length%2C+and+charge+density%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Determinants of histone H4 N-terminal domain function during nucleosomal array oligomerization: roles of amino acid sequence, domain length, and charge density.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16716-16722 (2009).</li>
<li>Ma Shogren-Knaak,, Fry, C. J., Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+native+peptide+ligation+strategy+for+deciphering+nucleosomal+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A native peptide ligation strategy for deciphering nucleosomal histone modifications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15744-158 (2003).</li>
<li>Lu, X., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+H3K79+dimethylation+and+H4K20+trimethylation+on+nucleosome+and+chromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The effect of H3K79 dimethylation and H4K20 trimethylation on nucleosome and chromatin structure.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (10), 1122-1124 (2008).</li>
<li>Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+Ultracentrifugation+for+the+Analysis+of+Chromatin+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analytical Ultracentrifugation for the Analysis of Chromatin Structure.</a> Biophysical Chemistry. 86 (2-3), 141-153 (2000).</li>
<li>Hansen, J., Kreider, J., Demeler, B., Fletcher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+and+agarose+gel+electrophoresis+as+tools+for+studying+chromatin+folding+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation and agarose gel electrophoresis as tools for studying chromatin folding in solution.</a> Methods. 12 (1), 62-72 (1997).</li>
<li>Montel, F., Menoni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+individual+nucleosomes+controls+the+chromatin+condensation+pathway%3A+direct+atomic+force+microscopy+visualization+of+variant+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The dynamics of individual nucleosomes controls the chromatin condensation pathway: direct atomic force microscopy visualization of variant chromatin.</a> Biophysical Journal. 97 (2), 544-5453 (2009).</li>
<li>Muthurajan, U. M., McBryant, S. J., Lu, X., Hansen, J. C., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linker+region+of+macroH2A+promotes+self-association+of+nucleosomal+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The linker region of macroH2A promotes self-association of nucleosomal arrays.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (27), 23852-23864 (2011).</li>
<li>Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+nucleosomes+revealed+by+time-lapse+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy.</a> Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).</li>
<li>Lohr, D., Bash, R., Wang, H., Yodh, J., Lindsay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+atomic+force+microscopy+to+study+chromatin+structure+and+nucleosome+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Using atomic force microscopy to study chromatin structure and nucleosome remodeling.</a> Methods (San Diego, Calif). 41 (3), 333-341 (2007).</li>
<li>Dyer, P. N., Edayathumangalam, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly%2C+loading%2C+and+alignment+of+an+analytical+ultracentrifuge+sample+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell.</a> J. Vis. Exp. (33), e1530(2009).</li>
<li>Demeler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UltraScan%3A+a+comprehensive+data+analysis+software+package+for+analytical+ultracentrifugation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Analytical+Ultracentrifugation%3A+Techniques%22%5BJournal%5D)">UltraScan: a comprehensive data analysis software package for analytical ultracentrifugation experiments.</a> Modern Analytical Ultracentrifugation: Techniques. , 210-230 (2005).</li>
<li>Holde, K. V., Weischet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boundary+analysis+of+sedimentation+velocity+experiments+with+monodisperse+and+paucidisperse+solutes%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Boundary analysis of sedimentation velocity experiments with monodisperse and paucidisperse solutes.</a> Biopolymers. 17 (6), 1387-1403 (1978).</li>
<li>Demeler, B., van Holde, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sedimentation+velocity+analysis+of+highly+heterogeneous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sedimentation velocity analysis of highly heterogeneous systems.</a> Analytical Biochemistry. 335, 279-288 (2004).</li>
<li>Hansen, J., Lohr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+structural+properties+of+subsaturated+chromatin+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assembly and structural properties of subsaturated chromatin arrays.</a> Journal of Biological Chemistry. 8, 5840-5848 (1993).</li>
<li>Routh, A., Sandin, S., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+repeat+length+and+linker+histone+stoichiometry+determine+chromatin+fiber+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nucleosome repeat length and linker histone stoichiometry determine chromatin fiber structure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 105 (26), 8872-8877 (2008).</li>
<li>Zhou, J., Fan, J. Y., Rangasamy, D., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleosome+surface+regulates+chromatin+compaction+and+couples+it+with+transcriptional+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The nucleosome surface regulates chromatin compaction and couples it with transcriptional repression.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 1070-1076 (2007).</li>
<li>Dorigo, B., Schalch, T., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+arrays+reveal+the+two-start+organization+of+the+chromatin+fiber%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber.</a> Science (New York, N.Y.). 306 (5701), 1571-1573 (2004).</li>
<li>Correll, S. J., Schubert, M. H., Grigoryev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Short+nucleosome+repeats+impose+rotational+modulations+on+chromatin+fibre+folding%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">a Short nucleosome repeats impose rotational modulations on chromatin fibre folding.</a> The EMBO Journal. 31 (10), 2416-2426 (2012).</li>
<li>Mcbryant, S. J., Krause, C., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Silent+Information+Regulator+3+Protein+%2C+SIR3p+%2C+Binds+to+Chromatin+Fibers+and+Assembles+a+Hypercondensed+Chromatin+Architecture+in+the+Presence+of+Salt%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Silent Information Regulator 3 Protein , SIR3p , Binds to Chromatin Fibers and Assembles a Hypercondensed Chromatin Architecture in the Presence of Salt.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (11), 3563-3572 (2008).</li>
<li>Schalch, T., Duda, S., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structure+of+a+tetranucleosome+and+its+implications+for+the+chromatin+fibre%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre.</a> Nature. 436 (7047), 138-1341 (2005).</li>
<li>Fan, J. Y., Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+histone+variant+H2A.Z+regulates+the+equilibrium+between+different+chromatin+conformational+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different chromatin conformational states.</a> Nature Structural Biology. 9 (3), 172-176 (2002).</li>
<li>Carruthers, L. M., Bednar, J., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+histones+stabilize+the+intrinsic+salt-dependent+folding+of+nucleosomal+arrays%3A+mechanistic+ramifications+for+higher-order+chromatin+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Linker histones stabilize the intrinsic salt-dependent folding of nucleosomal arrays: mechanistic ramifications for higher-order chromatin folding.</a> Biochemistry. 37 (42), 14776-14787 (1998).</li>
<li>Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+In+Vitro+Reconstitution+of+a+Defined+%26%2334%3B30+nm%26%2334%3B+Chromatin+Fibre+Containing+Stoichiometric+Amounts+of+the+Linker+Histone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined &#34;30 nm&#34; Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone.</a> Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).</li>
<li>Dorigo, B., Schalch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+fiber+folding%3A+requirement+for+the+histone+H4+N-terminal+tail%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail.</a> J. Mol. Biol. 2836 (03), 85-96 (2003).</li>
<li>Qian, R. L., Liu, Z. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+chromatin+folding+patterns+in+chicken+erythrocytes+by+atomic+force+microscopy+%28AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Visualization of chromatin folding patterns in chicken erythrocytes by atomic force microscopy (AFM.</a> Cell Research. 7 (2), 143-150 (1997).</li>
</ol>

著者らは、利害の衝突を持っていません。

モデルヌクレオソームアレイは、クロマチン構造及び機能のin vitro研究のための非常に有用なツールである。例えば、それらは広く溶液30-34におけるクロマチン繊維縮合のメカニズムを研究するために使用され、tetranucleosome 35のX線構造を得ることが可能となされている。さらに最近では、それらは特定のコアヒストン変異体、突然変異体および翻訳後修飾14-16,36の構造的な影響を解読するのに有用であることが証明されている。ここでは、ヌクレオソーム位置決めDNAからモデルヌクレオソーム配列および組換えコアヒストンの組立のための一般的な方法を説明します。 精製された八量と601 207×12 DNAからのヌクレオソームの配列の再構成は順次、2M 2.5 mmのNaCl濃度を下げて、いくつかの透析工程を含む、簡単です。プロトコルの中で最も難しい部分は、目的のTEMをもたらすr値を使用することですプレート飽和レベル。適切なr値は、最初に小規模で実験的に決定した後、実験に使用さ...

真核生物のゲノムは、裸のDNAとして存在していないのではなく、圧縮し、結合したタンパク質で編成されています。 DNAおよびタンパク質のこれらの複合体は、クロマチンとして知られている。クロマチンの基本繰り返し単位はヌクレオソームである。ヌクレオソームは、ヒストンオクタマーと約1.6倍の1オクタマーヒストンに巻きDNAの146塩基対で構成されています。ヒストン八量体は、2つのコピーのコアヒストンH2A、H2B、H3、およびH4の各々から構成されている。繰り返しDNA分子に沿って配置されているコアヒストン八量はヌクレオソームアレイに呼ばれています。ヌクレオソームアレイの拡張構造は、10nm繊維又は「ストリング上のビーズ」構造と呼ばれ、低塩条件2の下で、インビトロで存在されている。 10 nmの繊維は、アレイ内の圧縮および/ ​​またはアレイ間オリゴマー2を介してより高次の構造へと凝縮することができる。これらの高次構造は、塩の存在下で誘導することができるまたはヌクレオソーム配列3,4にクロマチン建築のタンパク質の結合を介して影響を与えることができる。クロマチン圧縮のレベルは反比例ビボ 5,6 内の転写速度と相関している。最近の研究では、このような分化、癌の発生、その他7,8のようなプロセスにおけるゲノムの構造組織の重要性を強調しています。クロマチン構造及び機能を研究するためのヌクレオソームアレイの使用が普及している。ここでは、組換えコアヒストンとヌクレオソーム位置決めDNAからのヌクレオソームの配列の組立のための方法を説明します。 ヌクレオソーム位置決めシーケンスのタンデムリピートで組換えDNAを使用すると、規則的な間隔のヌクレオソームを含む配列の再構成を可能にします。より一般位置決め配列の二つは、5S rRNA遺伝子配列と「601」配列である9,10。 601配列を、SELEX実験やMORから派生したE強く5Sシーケンス11よりヌクレオソームを配置します。従って、アレイ601のリンカーDNAの長さはより均質である。縦列反復ヌクレオソーム位置決めDNAをゲル濾過4,12によって得られる。組換えヒストンは、E.から精製される変性条件13歳未満の大腸菌 。組換えヒストンの使用は1注意深くヌクレオソームアレイのヒストン組成を制御することができます。例えば、特定の変異14または翻訳後修飾を有するコアヒストン15,16は、野生型コアヒストンの代わりに用いることができる。 沈降速度実験は、遠心力17の下で、溶液中の高分子の沈降速度を監視します。これは、試料中の巨大分子の大きさや形状に関する情報が得られる。沈降速度実験従って、クロマチン繊維中の溶液の状態の変化を研究するための適切なツールであるクロマチン凝縮18による構造。重要なことは、ヌクレオソーム再構成アレイにおける品質管理工程として沈降速度実験を使用することがまず必要である。 DNAおよびヌクレオソームが適切なモル比で結合されない場合、アレイは過小または過剰飽和コアヒストンとすることができる。このように、沈降速度実験から得られた情報は、ヌクレオソームDNAが適切で飽和されていることを確認するために使用される。これは、以前に特徴づけられていないDNAテンプレートを扱う場合は特に、ヌクレオソームでDNAの飽和を推定するための代替方法を使用することが重要である。したがって、我々はまた、原子間力顕微鏡（AFM）を用いてヌクレオソームアレイの分析のための方法を記載している。 AFMは、例えば、飽和レベル、ヒストン変異体又は19,20のMgCl 2の影響の存在の効果などのパラメータの数の効果の可視化を可能にする強力な技術である。 AFMはまた、アプリをされているタイムラプスイメージング21を使用してヌクレオソームのダイナミクスを研究するエド。 インビトロでは 、彼らはAFMイメージング22に適した大きさの範囲内に属しているため、ヌクレオソーム12-merの配列は原子間力顕微鏡の研究に特に適している組み立て。本研究では、品質管理だけでなく、（「百聞は一見にしかず」）のAUCからデータを肯定する手段として、ヌクレオソームアレイのAFMを使用している。単純な可視化に加えて、AFMは、追加のメトリックとしての試料の高さプロファイルの測定を可能にする。

<table><tbody><tr><td>(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648-100ML</td><td></td></tr><tr><td>6-8 kDa MWCO 透析チューブ</td><td>Fisher</td><td>21-152-5</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad Superdex 200 16/60 Column</td><td>GE</td><td>17-1069-01</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 50 kDa MWCO 遠心濃縮器</td><td>Sartorius</td><td>VS2031</td><td></td></tr><tr><td>12-14 kDa MWCO 透析チューブ</td><td>Fisher</td><td>08-667A</td><td></td></tr><tr><td>Illustra Sephacryl S-1000 Superfine</td><td>GE</td><td>17-0476-01</td><td></td></tr><tr><td>XL-A/I 分析超遠心分離機</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

組換えコアヒストンおよびヌクレオソームポジショニングdnaからのヌクレオソーム配列の組み立て

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

繰り返しDNA分子に沿って配置されているコアヒストン八量はヌクレオソームアレイに呼ばれています。ヌクレオソームアレイは2つの方法のいずれかで得られる：in vivoでの情報源からの精製、または組換えコアヒストンからのin vitroで再構成および縦列反復ヌクレオソームのポジショニングのDNA。後者の方法は、以上の組成が均一のアセンブリーと正確に配置ヌクレオソームの配列を可能にするという利点があります。分析用超遠心で沈降速度実験は、それらが、遠心力下で溶液を通って移動する速度を解析することにより高分子のサイズおよび形状に関する情報を得た。この技術は、原子間力顕微鏡とともに、DNAテンプレートの大部分は再構成後にヌクレオソームで飽和されることを保証する品質管理のために使用することができる。ここでは、長さのミリグラム量を再構成するために必要と組成的にDのプロトコルを記述クロマチン構造および機能の生化学的および生物物理学的研究に適しefinedクレオソームアレイ。

プロトコルを説明するために、我々は601の位置決めシーケンス（601 207×12）の12タンデム207 bpの反復からなる組換えアフリカツメガエルコアヒストンとDNAからヌクレオソームの配列を再構成した。まず、凍結乾燥されたコアヒストンからネイティブ八量を組み立てた後、S200カラム（ 図1A）を使用してFPLCによって八量を精製した。より大きな複合体は、S200カラムから先に溶出する。ヒストンは、一般的にこの順序で溶出：非特異的なヒストン凝集体、ヒストンオクタマー、H3/H4四量体、およびH2A/H2B二量体（ 図1A）。 S200カラムからのピークをSDS-PAGEにより分析した。精製されたオクタマー画分のゲルは4ヒストンタンパク質（ 図1B）の等モル量を示す必要があります。 アフリカツメガエル H2AとH2Bはわずか約200ダによって異なり、したがって、彼らはSDSゲル上の単一バンドとして現れる分子量を有していることに注意してください。 H3/H4四量体とH2A/H2B二...

この方法は、組換えコアヒストンからモデルクレオソームアレイの再構成および縦列反復ヌクレオソームのポジショニングのDNAのために提示されている。また、分析用超遠心で沈降速度実験、および原子間力顕微鏡（AFM）は、再構成後のヌクレオソームアレイ飽和の程度をモニターするために使用される方法を記載している。

組換えコアヒストンおよびヌクレオソームポジショニングDNAからのヌクレオソーム配列の組み立て

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

この実験の目的は、等数のヌクレオソームを含む、一連のタンデムに繰り返されたヌクレオソーム配置DNA配列を含むヌクレオソームアレイを構築することです。まず、変性バッファーからコアヒストンを透析して除去することで、ヒストン複合体を再折り畳みします。次に、サイズ排除カラムを用いてヒストン八量体を分離します。続いて、ヒストン八量体とテンプレートDNAをさまざまなモル比で混合し、高塩濃度から低塩濃度への段階的透析により、ヌクレオソームとしてDNA上に配置します。次に、所望の飽和度を得るための適切なモル比を決定するため、沈降速度法によりサンプルをテストします。結果は、遠心力による溶液中の移動に基づいて、または原子間力顕微鏡によって生成された画像に基づいて、ヌクレオソーム配列の飽和度を示すことができます。モノヌクレオソームではなくヌクレオソーム配列を用いる主な利点は、ヌクレオソームがリンカーDNAで連結されており、追加の構造的制約が付加されることです。この手法はクロマチン構造に関する知見を提供できるだけでなく、クロマチンテンプレートを用いたin vitro転写研究などの他のシステムにも応用可能です。ここでは、RyanとAnnaが、ヌクレオソーム配置DNAにおける組換えコアヒストンからのヌクレオソームアレイの構築を実演します。まず、精製し凍結乾燥した組換えコアヒストンタンパク質H2A、H2B、H3、およびH4を用意します。それぞれのタンパク質約5 mgを3 mLの変性バッファーに溶解し、室温で攪拌しながら少なくとも1時間インキュベートします。次に、アンフォールディングバッファーをリファレンスとして、各ヒストン溶液の276 nmにおける吸光度を測定します。その後、各ヒストンの吸光係数を用いてモル濃度を算出してください。吸光度から決定したヒストンの濃度を凍結乾燥重量と比較し、タンパク質の大部分が溶解しているかを確認します。最もモル数が少ないヒストンのサンプルを特定します。これがすべてのヒストンにおける制限モル数となります。次に、各ヒストンを等モル量で混合します。このヒストン混合液をアンフォールディングバッファーで希釈し、最終濃度を1 mg/mLにします。次に、サンプルを透析チューブに移します。チューブを密封し、2 Lの冷えたリフォールディング緩衝液に入れます。攪拌しながら4 °Cで18時間、サンプルの透析を行います。透析チューブが自由に、かつ激しく回転して、石状の沈殿が生じないようにしてください。透析緩衝液は6時間ごとに交換してください。沈殿が生じた場合でも、サンプルを廃棄しないでください。回収量は減少しますが、一部のoctiを回収できる可能性があります。気泡がシステム内に混入しないように注意しながら、S 200カラムをFPLCシステムに接続してください。S 200カラムを、0.2 µmでろ過した水を用い、流速0.3 mL/min、背圧制限0.5 MPaで一晩洗浄します。次に、0.2 µmでろ過したリフォールディングバッファー1 Lを用いて、約2時間システムを平衡化します。同様に、遠心濃縮器をリフォールディングバッファー1 mLで平衡化します。その後、透析チューブからサンプルを取り出します。沈殿物を除去するため、試料を4 °Cで遠心分離します。試料の上清を濃縮器にピペットで移します。試料を約500 µLまで濃縮します。濃縮したOptimusサンプルを新しい容器に移します。濃縮器を1 mLのRefolding bufferで洗浄します。洗浄液を500 µLまで濃縮し、それをERサンプルに加えます。サンプルを1.5 milliliterのマイクロ遠心チューブに入れ、4 °C、10,000 RPMで5分間遠心分離します。上清を新しいチューブに移します。次に、サンプルをS 200カラムにロードします。調製したばかりのリフォールディングバッファー400 mLでサンプルを溶出し、2 mLずつ分画して回収します。溶出中の吸光度を280 nmでモニタリングしてください。Hisタグ付きの凝集物は通常、約45 mLで溶出し、EMRは約65 mL、タイマーで溶出します。約 84 milliliters 付近で回収します。目的のピークから得られた溶出分画を、18 から 20% SDS page で解析します。精製された emus を含む分画では、4 つのコアヒストンタンパク質が等モル量で検出されるはずです。次に、精製されたOCRを含む分画をまとめ、遠心フィルターで濃縮して最終的なoctr濃度を決定します。280 nmでの吸光度を測定し、消衰係数を用いて濃度を算出してください。プロトコルの本文に従い、DNAと精製したERを用いてヌクレオソームアレイを再構成します。次に、260 nmにおける吸光度が0.5になるようにサンプルを希釈します。サンプルの400 µLを、片側にサンプル、もう片側にリファレンス10バッファーを入れた2セクターのセンターピースを持つセルに注入します。両方のセクターの液量はほぼ同量である必要があります。参照側のメニスカスをサンプル側のメニスカスよりも高く維持してください。セルをローターにセットし、適切に配置します。ローター上のセルの底面にあるハッシュマークを利用し、圧縮空気を用いてセルのレンズを静かに除塵します。X-L-A-X-L-I遠心分離機を起動します。ローターを挿入し、マニュアルに従って光学系を取り付け、固定してください。Proteome labソフトウェアを起動し、[ファイル]から[新規]を選択します。回転数3000 RPM、温度25 °Cでシングルスキャンランを設定します。各セルについて、サンプル名を指定し、波長を選択し、吸光度を選択して、コンピューター上の保存先フォルダを指定します。オプションから「ストップ」を選択します。最終スキャンを行い、ラジアルキャリブレーションを実行した後、シングルスキャンを開始してください。このシングルスキャンを用いて、適切なラジアルスキャン長を決定します。X-L-A-X-L-Iコントロールパネルを使用します。速度に0を入力し、スタートボタンを押してチャンバーを平衡化させます。ソフトウェアを使用して、目的の速度とスキャン回数を設定します。遠心分離の速度を上げることで、沈降係数の分解能を向上させることができます。ただし、サンプル全体がセルの底に沈降する前に、少なくとも20回のスキャンを収集する必要があります。適切に動作しているかを確認するため、最初の数回のスキャンをモニターしてください。ランの進行状況を監視し、セルの漏れなどの潜在的な問題を確認するために、直近の数回のスキャンを重ね合わせます。沈降速度の結果の解析、および原子間力顕微鏡を用いたアレイの可視化プロトコルの詳細は、本実験のプロトコル本文に記載されています。凍結乾燥されたゼノプス（xenopus）のコアヒストンを、S 200カラムを用いたFPLCで精製したオクタマー（octr）内で再構成しました。まず非特異的なヒストン凝集体が溶出し、続いてヒストンオクタマー、H3・H4テトラマー、およびH2A・H2Bダイマーが溶出しました。精製されたオクタマー画分をSDS-PAGEで分析した結果、4種類のヒストンタンパク質が等モル量で存在することが示されました。なお、xenopusのH2AとH2Bは分子量が約200 daltonsしか違わないため、SDSゲル上ではしばしば1本のバンドとして現れることに注意してください。分画64から67をプールし、ヌクレオソームアレイの再構成用に保存した。UCセルスキャンの測定範囲を設定するため、3000 RPMで収集した単一スキャンのProteome Labソフトウェアのスクリーンキャプチャを使用した。その後、一連の沈降速度スキャンを編集してデータセットを作成した。赤線と緑線は、沈降係数の分布を表示するための2つの異なる手法である。UltraScanにおける表示です。クロマチン構造の研究において、赤線は沈降係数の積分分布を、緑線はその微分を示しています。in vitroでの原子間力顕微鏡観察は、分析超遠心分離法を補完し、再構成後のテンプレート飽和度を確定させるために用いられます。ここでは、イメージングに使用した27個のSRAの大部分に10から11個のヌクレオソームが含まれていました。この500 by 500 nanometerのスキャンでは、リンカーDNAを伴うヌクレオソーム配列が明確に示されています。また、振幅トレース、位相トレース、およびヌクレオソームの高さプロファイルを決定するためにヌクレオソーム上にフリーハンドで線を描いた高さトレースも示されています。習熟すれば、適切に実施することでこの手法は3日から4日で完了できます。この手順を行う際は、試薬の濃度測定を非常に正確に行うことが極めて重要です。本手順に続き、構築後には原子間力顕微鏡などの手法を用いてヌクレオソームアレイの飽和度をテストすることも可能です。この技術の開発により、クロマチン分野の研究者がクロマチン構造やクロマチンの凝縮状態を研究する道が開かれました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、ヌクレオソーム複合体のダイナミクスを研究するための高速タイムラプス原子間力顕微鏡、AFM、イメージング技術を実演します。AFMチップがヌクレオソームの表面を走査すると、ヌクレオソームの高さの変化が検出され、DNAの経時的な解き放たれが記録されます。...

ヌクレオソームダイナミクスを捉える高速タイムラプス原子間力顕微鏡

このプロトコルは、示差的に同位体標識姉妹ヒストンを含むヌクレオソームの再構成を説明します。これと同時に、非対称的に翻訳後修飾ヌクレオソームはpremodifiedヒストンのコピーを使用した後に発生することができます。これらの製剤は、容易に高分解能NMR分光法を用いて、同時に両方の姉妹ヒストンに、修正クロストークのメカニズムを研究するために使用することができます。...

示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

ここでは、静的および時間経過の原子間力顕微鏡 (AFM)...

構造と原子間力顕微鏡イメージングによるヌクレオソームのダイナミクスを調べる

ここでは、遺伝子コード拡張を用いてアセチル化ヒストンタンパク質を発現し、再構成されたヌクレオソームをインビトロで組み立てる方法を紹介する。...

大腸菌の遺伝子コード拡張を用いた核組換えのためのヒストンの特異的なリジンアセチル化

このプロトコルは、TEMグリッドを凍結するためのサンプル調製の2つの方法を使用したヌクレオソーム複合体の調製について詳細に概説しています。...

クライオ電子顕微鏡による構造決定のためのDNA修復因子と複合体を形成したヌクレオソームコア粒子の作製

この記事では、単一分子相関力顕微鏡および蛍光顕微鏡法のためにヌクレオソーム含有DNAテザーを再構成するための詳細な実験手順を示します。さらに、クロマチン相互作用タンパク質の結合挙動を視覚化し、ヌクレオソームの物理的特性の変化を解析するために実施できるいくつかの下流実験についても説明します。...

単一分子相関力および蛍光顕微鏡法のためのIn Situヌクレオソームアセンブリ

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アフリカツメガエルの胚および細胞接着アッセイのアセンブリから主催し、動物極の外植片の解剖

マウスの尾からのゲノムDNAの単離

我々は将来の核酸ベースの治療のために均一とカスタマイズ可能なpolyplexesのよりよい制御および合成を提供することが期待される高分子電解質polyplexes、の形成を調査するナノフォトニクス（QD -...

組み合わせるQD - FRETとマイクロ流体はリアルタイムでDNAのNanocomplex自己組織化を監視する

分析用超遠心器（AUC）サンプルセルは、サンプルとリファレンスバッファを保持し、実験中に、最大60,000...

アセンブリ、読み込み、および分析用超遠心器のサンプルセルの整列

学ぶヌクレオソーム配列の組み立て法。組換えコアヒストンとヌクレオソームポジショニングDNAを用いて、沈降速度実験と原子間力顕微鏡で飽和度を評価する。クロマチン構造と遺伝子制御の理解に貢献します。

組換えコアヒストンおよびヌクレオソームポジショニングDNAからのヌクレオソーム配列の組み立て

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