共通液ハンドリングロボットでTruTipテクノロジーを使用して臨床検体からのDNAやRNAのハイスループット、自動抽出

本実験の全体的な目的は、Hamilton Star 液量操作ワークステーションと True Tip 抽出技術を用いて、全血からヒトゲノムDNAを単離することです。これを達成するために、血清サンプル溶解バッファー、プロテインase K、およびエタノールからなる溶液中で細胞を溶解させ、True Tip を介して吸引と分注を複数回繰り返すことで、DNAを True Tip マトリックスに結合させます。次に、2種類の異なる洗浄バッファーを True Tip に流し、結合した核酸から残留タンパク質、溶解バッファー、およびその他の不純物を除去します。

第3ステップでは、空気を数回吸引および分注することで、トゥルーチップの結合マトリックスを乾燥させ、最終ステップで残った洗浄バッファーを蒸発させます。その後、溶出バッファーを結合マトリックス上で往復させ、マトリックスからDNAを溶出させます。トゥルーチップ技術を用いることで、コンタミネーションのない高分子量ゲノムDNAを抽出することができ、これはUV-vis吸光度測定、ゲル電気泳動、および定量PCRまたはシーケンシングによって確認可能です。スピンカラムや磁性粒子に基づく他の試料調製法に対するトゥルーチップの利点は、自動化が容易であることです。

遠心分離機やマグネティックロッドを備えた高価なシステムは不要であり、シンプルなワークフローによって貴重なデッキスペースを節約できます。本日は全血に焦点を当てますが、Tru Tipは他のゲノムDNAサンプルへの適用や、臨床スワブサンプルからのウイルスRNA、あるいは血漿からのセルフリーDNAの単離など、さまざまな用途に活用可能です。本手順のデモンストレーションを行うのは、Hamilton液体ハンドリングワークステーション上でのTruet tip抽出手順の開発に尽力してきた、当研究室のオートメーションエンジニアであるDane Bradyです。

本プロトコルでは、Hamilton Star液体ハンドリングロボットを用いて、全血の96ウェルから同時にDNAを抽出します。Hamilton Starのデッキにはオプションのヒーターシェーカーユニットが搭載されており、これは全血などの特定の臨床検体における酵素消化に不可欠です。本システムには96チャンネルピペットヘッドを装着できるため、各チップステップおよび試薬用に専用の96ウェルプレートが用意されています。

まず、Hamilton Starロボットの関連機器とコンピュータの電源を入れます。ソフトウェアの中からHamilton Run Controlソフトウェアを開きます。ACONから提供された96サンプル用のランファイルを開いてください。

次に、図に従ってスターデッキのレイアウトを設定します。1とラベル付けされたすべてのポジションに1 mLフィルターチップを配置します。ポジション2にはフィルターなしの1 mLチップを配置します。ポジション3には、Conni Hamilton 1 mL LPT 2 mm True Tipsを配置します。引き続きチャートを参照し、ポジション5から12までを必要なラボウェアで満たしますが、この時点ではまだサンプルをロードしないでください。

次に、試薬として75 millilitersの溶解・結合バッファーを分注します。Fはトラフのポジション5にロードしてください。あるいは、セットアップを効率化しデッキレイアウトを簡素化するために、バッファーが充填済みのプレートを使用することも可能です。

引き続き、ロボットへのロードを適切に行ってください。最後に、血液採取管のキャップを取り外し、サンプルキャリアラックまたはデッキのポジション4に配置します。サンプル1を一番左のキャリアの後方に配置し、各キャリアを順に埋めていき、サンプル96を右前方のポジションに配置して終了します。

すべてのサンプルをロードした後、室温になるまで静置します。本プロトコルは完全に自動化されているため、オペレーターによるミスの可能性はほとんどありません。サンプルをラックに正しい順序で配置する必要がありますが、適切なサンプル追跡を確実にするためにバーコード管理を導入することが可能です。

自動スクリプトを開始するには、ランファイルウィンドウの左上にある再生ボタンを選択し、処理するサンプル数を入力します。スクリプトによって最初に実行されるステップは、80 µLのproteinase Kをヒーターシェーカーモジュールのポジション14にあるインキュベーションプレートに分注することです。次に、スクリプトは8チャンネルアームを使用して、インキュベーションプレートの各サンプルウェルに200 µLのサンプルを分注します。

続いて、96チャンネルアームを使用して、インキュベーションプレートの各ウェルに600 µLの溶解バッファーFを分注します。その後、スクリプトに従い溶液を10サイクル混合し、ディープウェルプレート内で70 °C、500 RPMで20分間インキュベートします。温度は60 °Cであり、これはプロテアーゼKの活性範囲内です。サンプルのインキュベーション中に、リキッドハンドリングシステムは引き続き動作し、バルクリエージェントトラフから対応する96ウェルプレートへ抽出および溶出試薬を分注し、ディープウェルプレートの各ウェルに100 µLの溶出バッファーAを添加します。

ポジション13において、ディープウェルプレートの各ウェルに800 µLのエタノールを分注します。ポジション10では、ポジション12のディープウェルプレートの各ウェルに1.6 mLの洗浄バッファーKを、ポジション11のディープウェルプレートの各ウェルに1.6 mLの洗浄バッファーJをそれぞれ加えます。20分間のインキュベーション後、サンプル混合物をインキュベーションプレートからポジション10にあるエタノール入りのディープウェルプレートに移し、12回のピペッティングサイクルで混合します。

全工程を通じて、試薬チップは必要に応じて廃棄ビンに捨てられます。プログラムは溶出工程からDNA抽出へと続き、まずデッキのポジション3から96本のトゥルーチップをロードします。次のステップでは、ポジション10のサンプルを10サイクルにわたって吸引および分注し、核酸をトゥルーチップのモノリスに結合させます。

次に、チップをポジション11に移動させ、洗浄バッファーJをモノリスに5回循環させて、残留した溶解液、バッファー、およびサンプルマトリックスを除去します。その後、チップをポジション12に移動させ、洗浄バッファーKを5回循環させて、結合した核酸からタンパク質やその他の不純物を除去します。最後に、洗浄プレートの上で高速で80回サイクルさせ、チップを風乾させます。

次に、チップがポジション13に移動し、溶出バッファーが2サイクルで5回分供給され、DNAがディープウェルプレートに溶出されます。その後、チップは廃棄ビンに排出されます。これでプログラムは終了です。

溶出プレートを装置から取り出し、抽出したサンプルを保存用または後続のアプリケーションに適したチューブに移します。また、プログラムをカスタマイズすることで、わずか1時間で最終サンプルを任意のチューブやプレートに自動的に移送させることも可能です。この自動化システムにより、ロボットを用いて96検体の血液サンプルからゲノムDNAを抽出しました。

45個の陽性血液サンプルの吸光度プロファイルを、45個のリジェントブランクと同時に処理しました。260nmと280nmの平均吸光度比は1.96であり、260nmと230nmの平均比は1.93であり、1%アガロースゲル上のサンプルが純粋であることが示唆されました。ランダムサンプルの解析では、せん断を最小限に抑えつつ、高分子量で走行しました。

平均収量は、全血200 µLあたり約5 µgのDNAでした。自動True Tipプロトコルを最適化する際は、ウェル間のクロスコンタミネーションが発生しないよう細心の注意を払います。リアルタイムPCRでは、ここに示すように、陽性と陰性が明確に分離されることがわかります。

RNA抽出の場合、最小限の手作業時間で96サンプルすべての抽出を1時間以内に完了させることができます。このビデオを視聴することで、Hamilton Star Liquid Handling Workstation上のTRU Technology Automatedを用いて、全血からヒトゲノムDNAを単離する方法について十分に理解できるはずです。