Name: 共通液ハンドリングロボットでTruTipテクノロジーを使用して臨床検体からのDNAやRNAのハイスループット、自動抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: 学ぶ TruTip技術を用いた全血からのゲノムDNA自動抽出法。Hamilton Star液体ハンドリングロボットを活用し、96サンプルの高スループット処理を実現。遠心分離機不要で汚染のない高分子量DNAを効率的に抽出する方法です。

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この作業の一部は助成R 44 AI072784下国立衛生研究所（NIH）によってサポートされていました。我々は博士キルスティンセントジョージ、サラB. Griesemer、ダリルラムソンとウイルス病研究室のエイミー·ディーン、定量インフルエンザビリオンと臨床的に検証されインフルエンザへのアクセスをリアルタイム用ズワースセンター、ニューヨーク州保健部に感謝PCRアッセイ。

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</ol>

著者は、この記事で使用する材料を製造Akonniバイオシステムズ社の従業員です。 この記事の無料アクセスと生産はAkonniバイオシステムズ社が主催しています

TruTipの概念およびワークフローの簡略化（ 図1）、それは容易に適合させる、自動化された効率的および臨床サンプルマトリックス、入力サンプルボリューム、および液体ハンドリングシステムの数のために有効である。これは、すべての臨床試料が一意であることが認識されるべきであり、粘度、粒子状物質、粘液、表面汚染物質、微生物、および/またはヒトの遺伝的背景の次に1つを変化するであろう。臨床試料組成物および自動TruTipサンプル調製プロトコルの利用目的の予想ばらつきを考えると、それは、したがって、特定のサンプルの種類の所望の結果を達成するために、TruTip手順における特定のステップを修正する必要があるかもしれない。かかわらず、サンプルタイプの、しかし、典型的に核酸の純度及び/又は回収に最も大きな影響を及ぼすTruTipパラメータがあります。 <ol><li> 溶解バッファー（とアルコール）との混合と均質化のサンプル。TruTips再を持っているがlatively大きな細孔の大きさ、サンプルの均質化と液化は、効率的な細胞溶解のために非常に重要である、とTruTipモノリス以降の結合手順。均質かつ十分に液化溶解物、サンプルがサンプル全体の処理時間を短縮し、より高い流量を有するTruTipを介して移動することができる。大容量プラズマプロトコルは、大きな入力サンプル量にもかかわらず、完全に均質と難しいサンプル（オンラインまたはオフライン）液化するためのユーザーのための可能性を示しています。 </li><li> 流速。遅い流速核酸結合又は溶出中には、通常、全体の処理時間を犠牲にもかかわらず、より高い核酸収量をもたらす。遅い流量はまた、DNAのせん断の程度を減らすことができます。 </li><li> サイクル数。吸引の最適な数とサイクルを分配するには、サンプルの種類、総サンプル量、および流速に依存する。 図1のステップ1は、典型的には、サイクルnumbeポイントですRS（と流量）などの異なる患者からNPA粘度の範囲のために最適化するために、より挑戦的な溶解物のいずれかを表す咽頭吸引（ 図5）のようなサンプルを用いて、いくつかの実証的な最適化が必要になる場合があります。 </li><li> 乾燥。TruTipモノリスの完全な乾燥が精製された核酸試料を抑制下流のプロセスまたはテストを共溶出するから残留有機溶剤を防止することが不可欠である。 TruTipを遠心分離又は吸引濾過によって乾燥されていないので、乾燥工程中に流量およびサイクル数の両方を最大化することが重要である。たまに乾燥サイクルが完了した後TruTipの末端に洗浄液の残液滴が存在する。ハミルトンロボットは、それによって無溶媒溶出を確実に、液滴を解放するために井戸の側の &quot;先端タッチ&quot;を実行する能力を持っています。 epMotionシステムがこの機能を持っているが、エルでTruTip末端のプレすすぎませんutionバッファは、同じ効果を達成するようにプログラムすることができる。 </li></ol>ロボットアームチャネルに幾何学、ピペットチップ材料、及び取り付け方法は、各機器メーカー一意であるため、異なるTruTip構築物は、それぞれの液体ハンドリングシステムのために必要とされる。 TruTipモノリス寸法（直径、厚さ、孔径）は、核酸結合能（および溶出効率）と相関しない、などの任意の固相抽出技術が期待される。厚い（&gt; 4 mm）の行列は、大容量のサンプルのための核酸結合容量を増加および/または特定のTruTip形式を横切る結合容量が等しくなるように、1mlのTruTipに埋め込まれてもよいが、TruTipの厚さとの間の流量との間にトレードオフが存在する初期結合工程（粗溶解の存在下で）。従って、それは（ 例えば&lt;、自動化されたプロトコルの最初のステップのための大ボリュームピペットチップに大径のモノリスを埋め込 ​​むことが時として有利で ​​ある/ em&gt;の大容量抽出のために5ミリリットルハミルトン/ Akonni TruTips）。リキッドハンドリングロボットの製造業者によって規定特定TruTip構成を考えると、しかし、我々は、必ずしもTruTip核酸利回りは異なるメーカーの、または異なるTruTipサイズ渡るリキッドハンドリングプラットフォーム間で同一であることを期待しないでください。 彼らは通常は無菌の部位（ 例えば脳脊髄液）から取得していない限り、臨床検体は（定義により）ヒトゲノムDNAのかなりの量が含まれます。他のアプリケーションで不要なヒトDNAゲノムの背景（ 図5のような）を表す一方、時にはヒトゲノムDNAは、（ 図6のように）が望まれている。バックグラウンドDNAの存在は、通常モノリスの結合容量を超えない試料中の核酸の総量限り、問題とならない、背景DNAは、キャリアとして機能することができ、所望の標的核酸場合酸は微量で存在する。ことを除いて感染症検査の試料調製対物レンズに類似している大容量の血漿抽出プロトコール（ 図7）母系DNAの10〜20倍過剰の存在下で（断片化）胎児DNAを単離すること、を目的配列は高度に合同であるとのみ特異性の高い分子検査および/またはサイズの差別によって区別す​​ることができます。この場合には、総循環DNAを5mlのTruTipを用いて単離し、高分子続くと低分子量の胎児DNAを、結合バッファー条件を変えることによって、1mlのTruTipに後続の結合および溶出を介して分離される。シリカモノリスへの結合および溶出特性に基づいて標的核酸の選択的なサイズ分離と濃縮は、膜またはサイズ排除スピンカラムによって達成さよりも有意に異なる作用機モードである。ヒトゲノムDNAからサイズ分離と微生物のDNAの濃縮は、かもしれないカスタマイズTruTip結合および溶出バッファーを経由して、将来のアプリケーションでccomplished。 自動化されたプロトコルは、多様な臨床サンプル、そしてそれがどのように大規模なボリュームと特定の液体ハンドリングロボットに適合させることができるを処理するためTruTipモノリス自体の有用性を強調してここに示しました。合理化された方法は、典型的には他の自動化システムと比較してより高速な抽出プロトコールをもたらす。 TruTip手続きを自動化するために必要な主要なハードウェアはピペットチャンネルアーム自体ではなく、磁気棒、真空システムであるため、TruTip技術のシンプルさは、しかし、また、新しい、自動化された核酸精製システムを購入に興味のある人のためのいくつかのコスト優位性を与える、または遠心分離機オンボード。予め充填された試薬プレートを利用することも領域と必要な消耗を低減し、走行あたりのスルー​​プットを倍増できる。 TruTipプロトコルでデッキスペースを最小限に抑えることも、上流またはdを統合する上級ユーザーを可能にするTruTipとownstream自動化されたプロセス。例えば分別全血にハミルトンのeasyBloodソリューションが大幅にバイオバンキングプロセスを合理化したい自動TruTip抽出方法で組み込むことができます。このような核酸定量、正規化、PCRをセットアップ、またはDNA配列としてポスト抽出プロセスも容易に大きくリキッドハンドリングプラットフォーム上TruTipに統合されています。

核酸精製は、のみを使用し、ほとんどの研究分子診断のために必要であり、ライフサイエンスアプリケーション。様々なアプローチが、その多くは、カオトロピック塩1の存在下でシリカに結合する核酸の基本的な原理に基づいており、フェノール/クロロホルム抽出の時から浮上している。抽出プロセスは、（2-13に例を参照）、スピンフィルタ、磁気ビーズおよびライフサイエンス業界を支配して関連するアプローチで、様々なビーズとメンブレンベースの形式を使用することにより合理化および自動化されています。効果的で挑戦的な臨床行列に直面したとき、粒子と膜は限界を知っていた。例えば、膜およびビーズベースの列が対応し、小孔サイズを（従って、高い背圧）があり、遠心分離または真空システムによって処理されるために、支持体のいくつかのタイプを必要とする。膜やビーズ列結果のの物理的特性効率的な消耗、及び/又は一方向流路を加工することができる合計（入力）サンプル量を詰まらせることなく処理することができる試料の種類を制限する重要な流体抵抗。逆に、磁性粒子は攪拌により試料全体に分散されている必要があります。均一溶液中に磁性粒子を分散させる必要が最も磁気ビーズ消耗品を使用して処理することができる総入力サンプル量を制限する。臨床サンプルの属性（例えば、粘度や複雑さなど）がチューブまたはロッドの側面に非効率的な磁気粒子濃度につながることができます。また、シリカ微粒子は、その磁化を失い、最終サンプルを汚染する、抽出プロセス中にビーズのオフに破ることができる。 TruTip技術は、これらの核酸試料処理の制約および制限14のいくつかを克服するために開発された。多孔質モノリス内に埋め込むことによりピペットチップは、流体の背圧が低下し、真空下（ すなわち、ピペット吸引）による流量制御を可能にする。この機能は、大幅に簡素化することが困難な試料タイプ（ 図1）から核酸を精製するために必要な抽出処理および計装を可能にする。モノリスのジオメトリと気孔率はモノリスの厚さは1.0から5.0ミリリットルまでのサンプル量に十分な核酸結合容量を提供しながら、目詰まりを最小限にするために調整されています。検体吸引分注時の双方向の流れがサンプル抽出かつ効率的な核酸の回収および溶出に対する結合モノリスとの間の延長された滞留時間を可能にし、ピペットチップ自体の体積容量を超えること処理される比較的大きな試料体積を可能にする。我々は以前に、シングルまたはマルチチャネルライを使用して、鼻咽頭サンプルからインフルエンザRNAを精製するための手動TruTip手順の開発と応用が報告され忍ピペッター15。同等の抽出効率が10 6遺伝子コピーで自動QIAcubeと手動TruTipメソッド間インフルエンザ当たりミリリットル鼻咽頭吸引液を得た。本研究の目的は、一般的に基準臨床検査で見つかった液体ハンドリングロボットを用いた鼻咽頭吸引（NPA）および他の臨床的に関連するサンプルタイプの中·高スループット自動化TruTip核酸の精製手順を実証することであった。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;試薬/材料 &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips)</td><td><a href="http://www.akonni.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Akonni Biosystems, Inc.</a></td><td>300-11120</td><td></td></tr><tr><td>95% エタノール</td><td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td><td>AC615110040</td><td></td></tr><tr><td>99% アセトン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270725-4L</td><td></td></tr><tr><td>DEPC処理水</td><td>Life Technologies</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>試薬リザーバー, 30 ml</td><td>Eppendorf</td><td>960050100</td><td></td></tr><tr><td>ディープウェルプレート 96/2,000 &amp;mu;l</td><td>USA Scientific</td><td>30502302</td><td></td></tr><tr><td>epT.I.P.S. Motion フィルターチップ, 1,000 &amp;mu;l</td><td>Eppendorf</td><td>960050100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;機器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>epMotion 5070 システム</td><td>Eppendorf</td><td>5070 000.000</td><td></td></tr><tr><td>分注ツール TM1000-8</td><td>960001061</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リザーバーラック</td><td>960002148</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 1. &lt;/strong&gt; 鼻咽頭スワブ（NPA）からの自動RNA抽出に使用する試薬および機器</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;試薬/材料 &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips)</td><td><a href="http://www.akonni.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Akonni Biosystems, Inc.</a></td><td>300-20341</td><td></td></tr><tr><td>95% エタノール</td><td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td><td>AC615110040</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>AMRESCO LLC</td><td>E195</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Hamilton フィルター付き CO-RE 96チップラック</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>235905</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Hamilton フィルターなし CO-RE 96チップラック</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>235904</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 試薬トラフ</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>187297</td><td></td></tr><tr><td>ディープウェル 2 ml プレート</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2800</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96 DWP-2 ml</td><td>Thermofisher</td><td>27874</td><td></td></tr><tr><td>試薬トラフ</td><td>Fisher</td><td>14-222-412</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;機器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Hamilton STAR システム</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173027</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 独立ピペットチャンネル / モジュラーアーム</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173081/173050</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 96チャンネルヘッド</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>199090</td><td></td></tr><tr><td>チップキャリア</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182085</td><td></td></tr><tr><td>サンプルキャリア/インサート</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173400/182238</td><td></td></tr><tr><td>プレートキャリア</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182090</td><td></td></tr><tr><td>Multiflex キャリア</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188039</td><td></td></tr><tr><td>HHS2 ヒーターシェーカーユニット</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>199033</td><td></td></tr><tr><td>ラックキャリア</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188047</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 2. &lt;/strong&gt; 全血からの96ウェルゲノムDNA抽出に使用する試薬および機器</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;試薬/材料 &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips)</td><td><a href="http://www.akonni.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Akonni Biosystems, Inc.</a></td><td>お問い合わせください</td><td></td></tr><tr><td>100% エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459828-1L</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td><td>AC327270010</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>AMRESCO LLC</td><td>E195</td><td></td></tr><tr><td>フィルター付き 4 ml チップ</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>184022</td><td></td></tr><tr><td>フィルターなし 1 ml チップ</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>235939</td><td></td></tr><tr><td>96-ディープウェルプレート</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2800</td><td></td></tr><tr><td>50 ml コニカルチューブ</td><td>Corning/ThermoFisher Scientific</td><td>05-526B</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 試薬トラフ</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>187297</td><td></td></tr><tr><td>120 ml 試薬トラフ</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182703</td><td></td></tr><tr><td>大容量 96ポジション試薬トラフ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-222-412</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;機器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>STARplus Autoload ワークステーションベース / デッキモジュール</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173025/190012</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 独立ピペットチャンネル / アーム</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173081/173052</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 独立チャンネル / モジュラーアーム</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>184090/173050</td><td></td></tr><tr><td>プレートキャリア</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182090</td><td></td></tr><tr><td>Multiflex キャリア</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188039</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 試薬トラフ用ラックキャリア</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188047</td><td></td></tr><tr><td>120 ml 試薬トラフキャリア</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>185290</td><td></td></tr><tr><td>チップキャリア</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182085</td><td></td></tr><tr><td>50 ml チューブキャリア</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182245</td><td></td></tr><tr><td>24ポジションサンプルキャリア</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173400</td><td></td></tr><tr><td>32ポジションサンプルキャリア</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173410</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 3. &lt;/strong&gt; 血漿からの大容量DNA抽出に使用する試薬および機器</td></tr></tbody></table>

共通液ハンドリングロボットでtrutipテクノロジーを使用して臨床検体からのdnaやrnaのハイスループット、自動抽出

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTipは、多孔質モノリシック結合マトリックスがピペットチップ内に挿入される単純な核酸抽出技術である。モノリスの形状は、1.0から5.0ミリリットルにボリュームの範囲の特定のピペットチップに適合させることができる。モノリスの大気孔率は容易に最小限の流体の背圧でそれを通過する粘性または複雑なサンプルを有効にします。双方向フローは、モノリスと試料との間の滞留時間を最大化し、単一TruTip内で処理すべき大量の試料を可能にする。かかわらず、サンプルボリュームまたはTruTipジオメトリの基本的な手順は、細胞溶解、TruTipモノリスの内側の孔に結合核酸、結合していない試料成分と溶解緩衝液を洗い流し、適切な緩衝液中に精製し、濃縮した核酸を溶出するが含まれています。 TruTipの属性と適応はエッペンドルフepMotion 5070を使用して、3つの自動化された臨床サンプル処理プロトコルで実証されている鼻咽頭吸引液からRNAの単離、全血からのゲノムDNAの分離、及び母体血漿（それぞれ）の大ボリュームから胎児のDNA抽出と濃縮を含め、ハミルトンSTARとSTARplus液体ハンドリングロボット、。

NPAからインフルエンザRNA抽出のためのリアルタイムPCRデータは、 図5Aに示されている。推定された核酸抽出効率は、プロトコル15の手動バージョンで得られた結果と同様である。平均C T値の線形応答は、平均C Tの標準偏差が1未満の値を持つ6 4 10〜10遺伝子コピーミリリットル-1は 、（AとBインフルエンザ= 0.99と0.98、それぞれR 2）インフルエンザを改正した観察されサイクル。 epMotionシステムとの交差汚染の有無を10 6遺伝子コピーミリリットル-1 NPAを含む12正NPAサンプルは12バッファブランクが散在された図5Bに示されている。陽性対照の平均C tが ±0.14 30.16だった、とすべてのバッファー·ブランクが陰性であった。全試料の処理時間は、それぞれ8,16及び24の試料について16、28及び40分である。典型的な臨床鼻咽頭吸引または綿棒が10 7遺伝子コピーミリリットル-1（1,000 TCID 50あたりビリオン16と&gt; 10 4 TCID 50ミリリットル-1インフルエンザ17と仮定して）が含まれますので、自動epMotionプロトコルは過半数に有効であると期待されている臨床NPA標本の。 ヒトゲノムDNAに対して行わ分子試験の範囲を考えると、全血から核酸抽出の主な目的は、汚染物質を含まない、高分子量のゲノムDNAを製造することである。 96サンプルのための自動化されたプロトコル（ 例えばプロメガMagneSil = 90分とキアゲンQIAamp調製DNA血液バイオロボットMDxのシステム= 2.5時間）。 図6Aは、UV /可視吸光度プロファイルを示し、他の自動化されたシステムに比べて改善されて1時間内に完了する平均で、ハミルトンSTARプロトコル上の45試薬ブランクで同時に処理45陽性の血液サンプル<sub&gt; 280分の260 1.96の比率と1.93の平均230分の260比。 吸光度比260/280 1.7から2.0と230分の260比と&gt; 1.7は、一般的に残留塩、タンパク質や溶剤、最下流分子のアプリケーションのための許容の自由、非常に純粋なDNAを示すものである。 図6B中の1％アガロースゲルで得られたgDNAは、最小限の剪断を有する高分子量（&gt; 24キロバイト）であることを示している。 45陽性サンプルのフルセットからの平均核酸収率は5.26である±ライフテクノロジーズQuantifilerヒトDNA定量キットに基づいて、200μlの全血あたり0.46μgのヒトDNA、。 図5Bに示したものと同様交差汚染試験は陰性対照バッファブランク陽性サンプルが点在し、並行して抽出を行った。すべてのブランクが再びPCR（図示せず）による陰性であった。精製されたgDNAはまた、多数の他のPCRベースの解析（図示せず）に適している。 大容量TruTip手順で処理プールされた母体の血漿サンプルの8複製サンプルからリアルタイム結果を図7に示す。完全なプロトコル（オフラインプロテイナーゼKのインキュベーションを含む）は、核酸キット（全く同等の自動抽出キットはまだ利用できません）循環キアゲンマニュアルに似て約2.5時間、に仕上がっています。すべての複製の平均C T値は34.58±0.66及び29.76±胎児の男性（CHY）と合計（CH1）DNAのための0.50、それぞれ、自動化された抽出方法の優れた再現性を示しています。全DNAプール内の胎児DNAの濃度は（ゲノム換算）であり、2.8％の全サンプルにわたる結果平均％胎児DNAと、規格に適合ポイント分析の比較に基づいて計算されます。このサンプル抽出を実行する前にプールしたため、このサンプルの実際の％ウシ胎児DNAは不明である。胎児のDNA合成、非プール血漿サンプルはTruTip法を用いて抽出キアゲン循環核酸キット（図示せず）を用いた結果と比較して、典型的には1.5倍高い。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1.jpg" /> 図1。 TruTip抽出処理と、液体ハンドリングシステムの作業の流れにかかわらず、その他の試料調製又は液体処理工程は、特定の液体処理装置およびソフトウェアの機能に応じて自動化されたルーチンに組み込むことができる。 <img alt="図2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2.jpg" /> 図2。 （A）エッペンドルフepMotion 5070サンプルプレートレイアウト。試薬/ consuma（B）のアレンジメントワークテーブル上BLES。epMotionしか同時に8サンプルの最大値を処理しますが、サンプルプレートは、24サンプル（それぞれの列1、5および9）にするように構成できは<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig2large.jpg" target="_blank">大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3.jpg" /> 図3。全血からゲノムDNAを精製するためのハミルトンSTARデッキレイアウト（ノンスケール）デッキポジション1 =ハミルトン1ミリリットルフィルタリングヒント; 2 =ハミルトン1ミリリットル非フィルタ処理のヒント; 3 = Akonni /ハミルトン1ミリリットルLPT 2ミリメートルのTruTips; 4 =入力血液サンプルキャリア（採血管やマイクロチューブ）、溶解緩衝液Fの5-9 = 290ミリリットル試薬トラフ、エタノールは、バッファJ、洗浄バッファーKと溶出バッファーA2を洗って、それぞれ、10 = 96 DEEPうまく結合板、11 = 96深井戸Jを洗って、12 = 96深井戸Kを洗う、13 = 96深井戸溶出板;ヌンク96ディープウェル培養プレートを14 =ハミルトンHHS2ヒーター/シェーカー; 15 = 50ミリリットル試薬トラフプロテイナーゼKを含む<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig3large.jpg" target="_blank">より大きな数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4.jpg" /> 図4。大容量の血漿試料（正確な縮尺ではない）からDNAを精製するためのハミルトンSTARplusデッキレイアウトシステムは、8×5ミリリットルのチャンネルと8×1ミリリットルのチャネル（デッキレイアウトに図示せず）を備えている。デッキポジション1 =ハミルトン4ミリリットルフィルタリングヒント; 2 = Akonni /ハミルトンを5ml TruTips; 3 =ソース血漿サンプル、4 = 50 mlコニカルチューブ、CN-W1、CN-W2とCN-W4を含む5 = 120ミリリットル試薬トラフreageNTS; CN-L1試薬を含む7 = 290ミリリットル試薬トラフ;; 8 = 290ミリリットル試薬トラフ含むCNプロテイナーゼK、CN-B2、CN-B3、EBA2、EBBとCN-W3試薬を含む6 =低容量試薬トラフ-B1試薬; 9ステップ1 = 96ディープウェルプレート、10ステップ2 = 96ディープウェルプレート、精製、最終製品のために11 =サンプルのキャリア、12 =ハミルトン1ミリリットルフィルタリングされていないヒント; 13 = Akonni /ハミルトン1ミリリットルLPT 4ミリメートルTruTipsは<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig4large.jpg" target="_blank">大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5.jpg" /> 図5。 （）。インフルエンザウイルスの自動TruTip抽出からのリアルタイムPCRの結果は、鼻咽頭吸引（NPA）に添加。入力NPA体積=100μlを、溶出体積=50μlの。結果が3の複製、電子の平均である希釈レベルとインフルエンザターゲットごとに異なる​​5つのNPAの背景（N = 15）からxtractions。定量PCRは、以前15に記載のアッセイ条件にライトサイクラー480システム上で行われた。12正NPAサンプルテンプレートなしのコントロールおよび自動抽出手順の対象と散在しているとき（B）いいえ交差汚染が検出されない。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig5large.jpg" target="_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6.jpg" /> 図6。ランダムに選択された10〜光度1000（ThermoFisher）から全血からのヒトゲノムDNA抽出の結果。）UV-可視トレースが複製されます。B）1％TruTip精製したgDNAのアガロースゲル。 M =フィッシャー24キロバイトマックスDNAラダー。レーン1から4 =〜100ngの精製gDNAを4からランダムに選択された複製。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig6large.jpg" target="_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図7" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7.jpg" /> 図7。自由に血漿からDNAを循環させる8つの反復TruTip抽出からのリアルタイムPCRの結果。アスタリスク（*または**）で表されるサンプルは、別の日に抽出した。 CHYは男性胎児DNAを定量化し、CH1合計存在するDNA（胎児と母体の）を定量化します。定量PCRはCHYとCH1 18を標的と以前に発表されたアッセイとライトサイクラー480システム（Roche社）を行った。

TruTipは、多孔質モノリシック結合マトリックスがピペットチップ内に挿入される単純な核酸抽出技術である。これにより、試料調製フォーマットは、ほとんどの液体ハンドリング機器と互換性があり、高スループットの臨床応用およびサンプルタイプに多くの媒体を用いることができる。

共通液ハンドリングロボットでTruTipテクノロジーを使用して臨床検体からのDNAやRNAのハイスループット、自動抽出

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

本実験の全体的な目的は、Hamilton Star 液量操作ワークステーションと True Tip 抽出技術を用いて、全血からヒトゲノムDNAを単離することです。これを達成するために、血清サンプル溶解バッファー、プロテインase K、およびエタノールからなる溶液中で細胞を溶解させ、True Tip を介して吸引と分注を複数回繰り返すことで、DNAを True Tip マトリックスに結合させます。次に、2種類の異なる洗浄バッファーを True Tip に流し、結合した核酸から残留タンパク質、溶解バッファー、およびその他の不純物を除去します。第3ステップでは、空気を数回吸引および分注することで、トゥルーチップの結合マトリックスを乾燥させ、最終ステップで残った洗浄バッファーを蒸発させます。その後、溶出バッファーを結合マトリックス上で往復させ、マトリックスからDNAを溶出させます。トゥルーチップ技術を用いることで、コンタミネーションのない高分子量ゲノムDNAを抽出することができ、これはUV-vis吸光度測定、ゲル電気泳動、および定量PCRまたはシーケンシングによって確認可能です。スピンカラムや磁性粒子に基づく他の試料調製法に対するトゥルーチップの利点は、自動化が容易であることです。遠心分離機やマグネティックロッドを備えた高価なシステムは不要であり、シンプルなワークフローによって貴重なデッキスペースを節約できます。本日は全血に焦点を当てますが、Tru Tipは他のゲノムDNAサンプルへの適用や、臨床スワブサンプルからのウイルスRNA、あるいは血漿からのセルフリーDNAの単離など、さまざまな用途に活用可能です。本手順のデモンストレーションを行うのは、Hamilton液体ハンドリングワークステーション上でのTruet tip抽出手順の開発に尽力してきた、当研究室のオートメーションエンジニアであるDane Bradyです。本プロトコルでは、Hamilton Star液体ハンドリングロボットを用いて、全血の96ウェルから同時にDNAを抽出します。Hamilton Starのデッキにはオプションのヒーターシェーカーユニットが搭載されており、これは全血などの特定の臨床検体における酵素消化に不可欠です。本システムには96チャンネルピペットヘッドを装着できるため、各チップステップおよび試薬用に専用の96ウェルプレートが用意されています。まず、Hamilton Starロボットの関連機器とコンピュータの電源を入れます。ソフトウェアの中からHamilton Run Controlソフトウェアを開きます。ACONから提供された96サンプル用のランファイルを開いてください。次に、図に従ってスターデッキのレイアウトを設定します。1とラベル付けされたすべてのポジションに1 mLフィルターチップを配置します。ポジション2にはフィルターなしの1 mLチップを配置します。ポジション3には、Conni Hamilton 1 mL LPT 2 mm True Tipsを配置します。引き続きチャートを参照し、ポジション5から12までを必要なラボウェアで満たしますが、この時点ではまだサンプルをロードしないでください。次に、試薬として75 millilitersの溶解・結合バッファーを分注します。Fはトラフのポジション5にロードしてください。あるいは、セットアップを効率化しデッキレイアウトを簡素化するために、バッファーが充填済みのプレートを使用することも可能です。引き続き、ロボットへのロードを適切に行ってください。最後に、血液採取管のキャップを取り外し、サンプルキャリアラックまたはデッキのポジション4に配置します。サンプル1を一番左のキャリアの後方に配置し、各キャリアを順に埋めていき、サンプル96を右前方のポジションに配置して終了します。すべてのサンプルをロードした後、室温になるまで静置します。本プロトコルは完全に自動化されているため、オペレーターによるミスの可能性はほとんどありません。サンプルをラックに正しい順序で配置する必要がありますが、適切なサンプル追跡を確実にするためにバーコード管理を導入することが可能です。自動スクリプトを開始するには、ランファイルウィンドウの左上にある再生ボタンを選択し、処理するサンプル数を入力します。スクリプトによって最初に実行されるステップは、80 µLのproteinase Kをヒーターシェーカーモジュールのポジション14にあるインキュベーションプレートに分注することです。次に、スクリプトは8チャンネルアームを使用して、インキュベーションプレートの各サンプルウェルに200 µLのサンプルを分注します。続いて、96チャンネルアームを使用して、インキュベーションプレートの各ウェルに600 µLの溶解バッファーFを分注します。その後、スクリプトに従い溶液を10サイクル混合し、ディープウェルプレート内で70 °C、500 RPMで20分間インキュベートします。温度は60 °Cであり、これはプロテアーゼKの活性範囲内です。サンプルのインキュベーション中に、リキッドハンドリングシステムは引き続き動作し、バルクリエージェントトラフから対応する96ウェルプレートへ抽出および溶出試薬を分注し、ディープウェルプレートの各ウェルに100 µLの溶出バッファーAを添加します。ポジション13において、ディープウェルプレートの各ウェルに800 µLのエタノールを分注します。ポジション10では、ポジション12のディープウェルプレートの各ウェルに1.6 mLの洗浄バッファーKを、ポジション11のディープウェルプレートの各ウェルに1.6 mLの洗浄バッファーJをそれぞれ加えます。20分間のインキュベーション後、サンプル混合物をインキュベーションプレートからポジション10にあるエタノール入りのディープウェルプレートに移し、12回のピペッティングサイクルで混合します。全工程を通じて、試薬チップは必要に応じて廃棄ビンに捨てられます。プログラムは溶出工程からDNA抽出へと続き、まずデッキのポジション3から96本のトゥルーチップをロードします。次のステップでは、ポジション10のサンプルを10サイクルにわたって吸引および分注し、核酸をトゥルーチップのモノリスに結合させます。次に、チップをポジション11に移動させ、洗浄バッファーJをモノリスに5回循環させて、残留した溶解液、バッファー、およびサンプルマトリックスを除去します。その後、チップをポジション12に移動させ、洗浄バッファーKを5回循環させて、結合した核酸からタンパク質やその他の不純物を除去します。最後に、洗浄プレートの上で高速で80回サイクルさせ、チップを風乾させます。次に、チップがポジション13に移動し、溶出バッファーが2サイクルで5回分供給され、DNAがディープウェルプレートに溶出されます。その後、チップは廃棄ビンに排出されます。これでプログラムは終了です。溶出プレートを装置から取り出し、抽出したサンプルを保存用または後続のアプリケーションに適したチューブに移します。また、プログラムをカスタマイズすることで、わずか1時間で最終サンプルを任意のチューブやプレートに自動的に移送させることも可能です。この自動化システムにより、ロボットを用いて96検体の血液サンプルからゲノムDNAを抽出しました。45個の陽性血液サンプルの吸光度プロファイルを、45個のリジェントブランクと同時に処理しました。260nmと280nmの平均吸光度比は1.96であり、260nmと230nmの平均比は1.93であり、1%アガロースゲル上のサンプルが純粋であることが示唆されました。ランダムサンプルの解析では、せん断を最小限に抑えつつ、高分子量で走行しました。平均収量は、全血200 µLあたり約5 µgのDNAでした。自動True Tipプロトコルを最適化する際は、ウェル間のクロスコンタミネーションが発生しないよう細心の注意を払います。リアルタイムPCRでは、ここに示すように、陽性と陰性が明確に分離されることがわかります。RNA抽出の場合、最小限の手作業時間で96サンプルすべての抽出を1時間以内に完了させることができます。このビデオを視聴することで、Hamilton Star Liquid Handling Workstation上のTRU Technology Automatedを用いて、全血からヒトゲノムDNAを単離する方法について十分に理解できるはずです。

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