Name: Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 学ぶC. elegansを用いた神経カルシウムイメージング法。遺伝子導入型蛍光インジケーターで単一ニューロンのカルシウム動態を測定し、感覚刺激や細胞損傷に対する神経活動を解析します。技術的に簡便で費用対効果の高い手法です。

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何人かの人は、このホワイト·ペーパーで説明された仕事に貢献した。 CVGは、実験装置を構築し、LS、SHC、とCVGは、実験を行った。 CVGおよびSHCは原稿を書いている。すべての著者は、その後改訂プロセスに参加し、原稿の最後のコピーを承認した。我々はGCaMP株についてポールスタンバーグに感謝します。この作業で使用されるいくつかの線虫株は研究資源のためのNIHナショナルセンター（NCRR）によって運営されている線虫遺伝学センター（CGC）から提供された。 MATLABの画像解析プログラムを18で使われているから脚色したものです。著者はボストン大学、マサチューセッツ工科大学ライフサイエンスセンターではサポートされていた。

1。光学装置<ol><li>落射蛍光イメージング機能を備えた標準的な複式顕微鏡を使用しています。我々はIntensilight HGイルミとニコンの​​EclipseのTi-U倒立顕微鏡を使用しています。 </li><li>最高の画像と信号の品質確保のため、高倍率、高開口数の対物レンズを使用しています。我々は通常、ニコンX60 1.4のNA油浸対物レンズを使用しています。いくつかのケースでは、蛍光体の発現レベルと信号強度に応じて、低倍率（X40、X20）を使用することが可能です。 </li><li>このような画像の感度を最大にし、バックグラウンドノイズを最小限に抑えるためのアンドールクララカメラとしては、CCDカメラを冷却し、高感度を使用します。 </li><li>単一色の蛍光団は、蛍光体の特定の波長のために設計された標準的な顕微鏡の蛍光フィルターを使用してください。 GCaMPための標準的なGFPフィルターは525nmの488nmおよび発光の励起用に最適化された設定を使用します。それ以上の光学変更は必要ありません。 </li><li&gt;このようなカメレオンのようにレシオメトリック蛍光団については、同一の画像を同時に2つの別々の波長で捕捉することができるようなデュアルイメージングシステムを使用しています。これは、カメラにデュアル枚の画像を並べて投影することによって達成されます。光学グレードのブレッドボード上で基本的な光学部品を使用して、これを達成するための簡単なセットアップは、 図1に示されている。それは以下から成ります。 <ol class="ualpha"><li> 440±20 nmの励起フィルターと455 nmの設定顕微鏡フィルタが長いダイクロイックミラーを渡す。 </li><li>直ちに顕微鏡イメージングポート（カメラのCCDセンサーは通常座るところ）外初期像面に配置された画像のマスク。これは、カメラセンサーの半分だけがいっぱいになるような視野を制限します。 2つの画像を並べて投影されるシャープなイメージの枠の最初のイメージプレーンの結果とオーバーラップ無しでこのマスクを置く。 </li><li>第1リレーレンズは徒歩トンから1つの焦点距離を設定彼が光をコリメートするような初期のイメージプレーン。 </li><li> （&lt;515 nmであり、シアン）は、他の送信中に一つの色を（&gt; 515 nmであり、黄色）を反映し、2つの別々のイメージング波長またはチャネルに光を分割するダイクロイックミラー。 </li><li>さらに具体的なイメージング波長（485±535でシアンで40 nmと黄色の±30 nm）の透過光を制限する発光フィルター（バンドパスフィルタ） </li><li>それはCCDカメラでの第2像面に光をrefocusesような光路に配置され第2のリレーレンズ（各チャネルに1つ）。 </li><li>一対のミラーと第2のダイクロイックミラーは、2つの画像が再結合し、カメラのCCDセンサー上に横並びに投影されるようにビーム経路を指示します。 図4Aは、得られた画像の例を示す。 </li></ol></li><li>初期の光学的アライメント：高コントラストIMAGと光学系のセットアップとアライメントを開始低倍率レンズと送信広視野光照明を（顕微鏡スライド上に描かれた黒のシャーピーがうまく機能）を使用して電子メール。顕微鏡の接眼レンズを通して集中するイメージを持ってきて、次に使用する顕微鏡のポートに切り替えました。高い光照明で初期焦点面（顕微鏡の外部ポート数cm）で、インデックスカードに画像を表示します。それが最初の焦点面から1焦点距離であり、ビーム経路（ すなわち、直接のビーム経路の中央に配置されます）偏向しないながら光をコリメートするようなビーム経路に第1リレーレンズ（C）を配置します。第一焦点面にマスクを置き、視野の半分フィールドを制限したり、画像にシャープなボーダーを生成するように調整。 図1Bに示すように、ビーム経路は、テーブル面に対して平行のままで、2つのパラレルパスサイド·バイ·サイドで実行されるように、ミラーやフィルタ（A、D、E、G）を置きます。それぞれのビーム経路の中心2のリレーレンズ（F）とカメラのCCDセンサーが置かれていたであろうインデックスカードに焦点を当てて画像を持って来るためにパスに沿って前後に移動します。正しく行えば二つの画像は、顕微鏡接眼レンズと他のカメラのポートを持つ同焦点であるべきである。最後の位置にカメラを配置し、アライメントを微調整します。 </li><li>ファインチューニング光学的アライメント：微調整光学アライメントにCCDカメラによって見デュアルイメージを使用します。高コントラストの画像を使用して、最終的な位置合わせのための高倍率に切り替えて、低倍率で始まります。反射像（ 図1Bに黄色チャネル）のフィールドの残りの半分をカバーするために、XとYの位置にカメラを移動することによって、カメラの視野の半分をカバーするために送信された画像（ 図1B、シアンチャンネル）を置きそのビーム経路に最後の2ミラー（G）を調整することによって表示できます。ビーム経路に沿って前後に各チャンネルの第2リレーレンズを動かすことにより、フォーカスを最適化します。残した場合不変の光学構成は安定しており、唯一の珍しい微調整を必要とすべきである。 </li></ol> 2。サンプル調製とデータ収集。 <ol><li>線虫の遺伝学センター（CGC）や他のソースから目的のニューロンにおけるカルシウム感受性蛍光色素分子を発現する動物を取得します。あるいはトランスジェニック動物は、標準的なCを使用して構築することができる虫のテクニック。単一細胞の発現は、（時には望ましいものではない複数のニューロンが調査される場合は、12を参照）画像や複数のセルからの測定容易に分離できるものであれば必要ありません。フルオロフォア導入遺伝子がゲノムに組み込まれていない場合は、発現の有意な変化は、動物から動物に発生する可能性があります。この場合、蛍光解剖顕微鏡を使用して、より高い発現レベルを有する動物を事前に選択すると、信号対雑音比を向上させ、測定を向上させます。蛍光色素分子の発現レベル旧姓容易に実験が必要とする取得パラメータの下にカメラで撮像することにするのに十分でなければD。 </li><li>実験室でのテープを2枚を隔てた二つのガラススライド間の溶融アガロースの小滴を押して目的の固定化技術（下記2.3参照）に必要なアガロースパッドを作る。必要に応じて、アガロースパッドは動物をマウントする前にガラスカバースリップに転送することができます。 図2を参照してください。 </li><li> Cを固定する以下のいずれかの手法を用いた撮像用虫 ： <ol class="ualpha"><li>薬理学的な麻痺：2％アガロースパッド（2.2でパッドを作る前に溶融アガロースにそれを混合）に0.05％レバミゾールを追加します。パッドの上に5月10日の動物を選んで、カバースリップで覆う。所定の位置に保持するためのカバースリップの四隅にホットワックス混合物（50％パラフィンワックスおよび50％ワセリン）の少量を適用します。を有効にするにはレバミゾールとbに動物のための5〜10分を許可まだ完全ecome。 </li><li>スティッフアガロース固定化：C.エレガンスは、物理的に硬い10パーセントアガロースパッドと0.05μmの直径のポリスチレンナノ粒子を用いて固定することができる。 2.2と同様に10％のアガロースパッド（重量のNGMバッファの10％アガロース）を作る。パッドの上にビーズ溶液の〜3μlの（体積NGMに1時10ポリスチレン微小球）を追加します。迅速に、5月10日Cを選ぶパッドの上にビーズ溶液のプールに虫で、静かにカバースリップでカバーしています。その位置に保持するためにカバースリップの四隅に適用溶融ワックスを使用しています。 （この手法に関するその他の詳細については同様に以前のJoveの記事8と7を参照） </li><li>糊付け：C.虫は動物の一方の側に適用される獣医グレード接着剤の少量を使用して所定の位置に接着することができます。 </li><li>マイクロ流体デバイス：多数の微小流体デバイスは、物理的に温度を保持するように設計されていますイメージングのための場所でエレガンス 。 </li></ol> &lt;/ LI&gt; <li>顕微鏡にプレパラートを置き、希望のニューロンに焦点を当てています。これは C を見つけることが最も簡単な方法です明視野照明と低倍率を使用しエレガンス 。その後見つけ、特定のニューロンに焦点を当て、高倍率と蛍光イメージングに切り替える。 </li><li>刺激：特定の刺激に対するニューロンの応答（光、電場、味覚や嗅覚、温度など）を希望する場合は、刺激装置は、それがで動物に投与することができるように、顕微鏡のセットアップに設計しなければなりませんイメージングしながら試料調製。 </li><li>顕微鏡CCDカメラを用いて画像を取得する。露光時間と励起光レベルがconcordantly少ない時間分解能で長い露出時間を必要とする弱い信号と、基準信号と蛍光体の発現量に依存します。我々は通常、約300ミリ秒の露光時間を使用します。 </li><li>個別に、またはTiのような画像を取得映画を私タイムラプス。なぜならC.線虫の神経細胞は一般的に遅い活性化ダイナミクス（ すなわち、彼らはナトリウムベースの活動電位を欠いている）が表示され、約1秒の比較的遅いフレームレートは、しばしばニューロンダイナミクスを測定するのに十分である。集録レートまで〜これらは微弱な蛍光のために必要な積分時間によって制限されるかもしれませんが、毎秒90フレームが使用されている。固定化の準備が安定しており、フレームレートが比較的遅い場合は、単一ニューロンの個々のムービーが簡単に数分（5〜10分）以上拡張することができます。 </li></ol> 3。データ解析<ol><li> ImageJとNISの要素を含む動的およびレシオメトリック分析機能と利用可能な異なる蛍光イメージングソフトウェアパッケージは多数あります。我々は、関心のある選択された領域での平均蛍光シグナルを測定する簡単なカスタムMATLABプログラムを使用しています。 </li><li>個々の画像（またはままタイムラプスムービーの完全に静止）画像化されたニューロンとバックグラウンド測定用に別の近隣地域内の関心領域（ROI）を選択します。レシオメトリック画像の場合、デュアル画像ごとに類似したROIと背景領域を選択します。 </li><li>タイムラプスムービー内の画像化された神経細胞のわずかな動きを自動的に多数のオブジェクトトラッキング方式を使用して行うことができ、各フレーム内のROIを選択するには追加の分析が必要です。私たちのプログラムは、ラフの境界が（すべてのフレームに興味の対象を包含する）手動で選択し、独立したバックグラウンド領域が選択されているから、映画の中のすべての画像の圧縮された画像が表示されます。最初のフレームは、ROIが手動で境界領域内から選択されています。その後の各フレームについては、プログラムが正しいサイズ（ すなわちマニュアル最初のフレームのROIとして同じ画素数）のROIを生成する境界領域内から最も明るいピクセルを選択します。イメージのためどこ客観利益のトンは、このプロトコルは、各フレームのための合理的なROIを選択する境界領域内の周囲の背景その後十分に明るくなっています。 </li><li>各フレームの蛍光信号、Fは、ROI内の平均ピクセル強度マイナス背景領域の平均強度として計算されます。レシオメトリックの値が-0.65 / 2の信号の比（YFP-YFP 背景 ）（CFP-CFP 背景 ）として計算されます。 0.65倍は、フルオロフォアと同様に（この値は、通常、カメレオンのセットアップのための〜0.6である）を使用し、特定のフィルタセットに依存することになるのYFPチャンネルにCFPのチャネルを介してのブリードを補正します。 </li><li> 、ΔF/ F =（F（t）は、-F O）/ F○：各フレームの相対的なカルシウムレベルは、最初のフレーム（または一連のフレーム）から測定し、初期ベースライン値に正規化された強度の変化率として計算されF（t）は時間tとf oの蛍光である初期ベースライン値です。 </li><li>細胞体を選択するROIが最強で最も堅牢な信号を生成し、それが神経突起に沿ってROIからの信号を選択して測定することも可能である。 </li></ol> 4。問題解決<ol><li> 漂白 ：励起光への曝露は、フルオロフォアの漂白と暴露レベルに依存している信号の着実な減少によってマークされて発生することがあります。レシオメトリック測定は、これを補償するために役立ちます。 1波長の漂白しかし選択はまだ（速く次に、典型的にCFPの漂白YFP）が発生する可能性があります。漂白した場合は、（照明経路における中性密度フィルター付き）露光時間および/または励起強度を低減することにより、露光レベルを下げるに発生します。必要であれば、1はモック試験（同じ励起露出けどノー神経刺激）を実行すると、信号の減衰の時定数を定量することにより、漂白を補償することができます。 </li><li><stronグラム&gt;固定：それは動物が記録期間を通じて比較的残っ重要ですここで説明では、単純な画像解析のためのelegansは 、記録時に移動する彼らが最も可能性が高いこと、露光や実験刺激に応答する。軸索プロセスから測定時にわずかな動きが、特に測定に大きなノイズを導入することができます。レシオメトリック分析は、細胞体からある程度、測定値より堅牢なものにこれらの影響を軽減するのに役立ちます。固定化の手順を慎重に実行して細分化はまだ完全に動物になります。 </li><li> 背景の選択：背景領域を慎重に選択することに成功し、画像解析のために必要である。背景領域は、合理的に均一で画像化されたニューロンその後暗くなるはずです。それは十分に画像化されたニューロンからの散乱光（そして、その結果、ピックアップ信号）を避けるために削除する必要があります。我々は、均一領域20-5を見つけるROIから0μmでは、ほとんどの場合に適しています。 </li><li> レシオメトリック光学：結像光学系の正しいアライメントが明らかデュアル画像を生成するために重要です。レシオメトリックイメージングのための商業顕微鏡アタッチメントが用意されています。代替技術は、それぞれに別々の画像を記録しながら、急速に発光波長を切り替えることが高速フィルタホイールを使用して迅速な連続イメージングを用いることである。 </li><li> レシオメトリック分析：ここで説明した分析では、投資収益率を平均のおかげで堅牢な信号を生成し、比較的簡単なテクニックです。それは、ROIを選択するに分かる明るいオブジェクトが必要です。より洗練されたレシオメトリック分析が正確に整列させ、蛍光比は画素ごとに算出することができる、このような二重の画像をマッピングすることにより可能です。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

遺伝的にコードされたカルシウム指示薬は広く、Cで利用されてきたelegansの神経生物学。多数のグループが電界にASJ応答でここで示すよう外部刺激に対する一次感覚ニューロンの応答を研究するために、これらの技術を採用してきた。顕著な例は、機械的なタッチの感覚、特定の化学物質、温度、電界12、16から19が含まれています。介在ニューロンと筋細胞の活動も刺激に応答して、動物の行動の制御の両方で監視されている。これらの研究の多くは、これらの技術を部分的に抑制されたり、自由に移動する動物で同様に、同時に複数のニューロンから記録したニューロンから記録を有効にするには、画像認識やトラッキング技術を使用して、さらに一歩をプッシュしている。その他の研究では、そのようなだけでなく、ここに提示されるように神経損傷13、20への応答としてのカルシウムの生理機能の他の側面を検討してきた長い時間スケール21の神経変性。 特定の実験を設計する際に、一般的に使用されるカルシウムの記者や動物の...

ここでは、Cの生体内カルシウムイメージングのための実用的な方法を提示する線虫の神経細胞。高い信号対雑音比を持つ遺伝的にコードされたカルシウム感受性蛍光色素の開発は、Cを作る神経生理学および活性の測定のために比較的簡単で費用対効果の高いシステムをエレガンス 。当社のイメージングは​​、一般的に利用可能な蛍光団の広視野蛍光イメージングを用いた標準的な複式顕微鏡を使って行われます。我々は、それぞれの長所と短所を議論し、様々なフルオロフォアおよび異なる試料調製を採用するいくつかのテクニックを紹介します。その後、データは2つの例の実験から示されている。ここに記載されている技術上の優れた追加のリソースがWormBook &quot;イメージング神経細胞や筋肉の活性&quot; R. Kerrによる、（記載されています<a href="http://www.wormbook.org" target="_blank">http://www.wormbook.org</a> ）3。 genetiの2つの主要なクラス的にエンコードされた蛍光カルシウム記者は、一般的にC言語で使用されているエレガンス ：単一チャネルのGCaMPとFRETベースのカメレオン。我々は方法を説明し、それぞれによって生成されるデータの例を示します。 GCaMPは、周囲のカルシウム濃度に敏感で修正された緑色蛍光タンパク質（GFP）に基づいています。これは、カルモジュリンによるカルシウムの結合が効率蛍光確認2にGFP分子をもたらすように、GFPの融合と高カルシウム親和性タンパク質カルモジュリンによって達成される。これらのフルオロフォアの最近の進歩は、カルシウム濃度の生理的範囲と合理的に高速〜95ミリ秒の立ち上がり時間の動態および〜650ミリ秒の減衰時間が4以上の蛍光強度の最大500％増加と優れた信号の大きさを生成します。比較的短い期間（分）をかけて、これらの大規模な信号は低解像度のイメージングを可能にする（低倍率）と、行儀のinitが与えられたことができますIALベースライン測定、連続ラインまたは比較測定の必要性を否定する。 カメレオンは、2つの独立したチャンネルまたは波長1を比較するレシオメトリック測定を生成FRETベースの蛍光団であるという利点があります。それはカルモジュリンタンパクによって連結された2つの別々の蛍光色素分子（水色と黄色発光蛍光タンパク質、CFPとYFP）で構成されています。錯体は、CFPを励起する青色光（440 nm）を照射する。カルシウムの結合はYFP（アクセプター）へCFP（ドナー）からの蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を増加させるとCFPの発光（480 nm）は減少とYFP発光（535 nm）を増加させることを引き起こして、より緊密フルオロフォアをもたらし。相対的なカルシウムレベルがYFP / CFP強度の比として測定されます。カメレオン動態は〜1秒、3秒〜5の減衰時間の立ち上がり時間を持つようにインビボで測定GCaMPのそれよりも遅いです。しかし、逆に信号を移動の比率は、信号の大きさを増大させ、蛍光物質濃度、動きやフォーカスドリフトと漂白の変化による可能アーティファクトの数を補正します。 遺伝的にコードされた蛍光レポーターは、外因的に投与されたプローブとCで必要な試料調製の大半を否定elegansの小さな透明の本体はシンプルな広視野蛍光を用いて無傷動物内の撮像を可能にします。試料調製における主要な技術的課題は、安全に動物を固定することである。それぞれの長所と短所とは異なる一般的に使用される技術が数多くあります。動物を麻痺させる薬剤を使用することで、実装が容易であり、1つの準備（レバミゾール、つかむために筋肉組織を引き起こしコリン作動薬は一般的に6を使用されている）上に複数の動物の取付けができます。Cで虫も、物理的にマウントすることによって、固定化することができる堅い10パーセントアガロース7,8で。動物生理学上の影響を最小限に抑えることは、長期的なイメージング（時間）と、複数の動物の回復が可能になりますが、より技術的に困難である。これらの手法の両方は、動物への物理的アクセスを制限（カバースリップの下にある）、したがって、唯一の特定の実験刺激（光、温度、電界やレーザー損傷など）で使用することができます。そのような化学物質のタッチや管理などの物理的なアクセスが必要な刺激は、多くの研究では、正常にCをくぎ付けにしている代わりに虫 （獣医グレード接着剤を使用して）9。これは技術的に困難である、単一の動物の準備であり、動物の回復を許可していません。最後に、多数の微小流体デバイスは、物理的に温度を抑えることが採用されてきた虫 、動物の生理機能を維持する刺激のほとんどのタイプ（装置設計に依存します）への暴露を可能と動物の迅速な交換とリカバリを有効にすることができます<sup&gt; 10、11。しかしマイクロフルイディクスは、設計、製造、実装に追加の技術的なスキルや能力を必要とします。固定化された動物では、アクティビティと刺激応答は一般的感覚と介在ニューロンで測定することができます。運動ニューロンの活動は、移動動物におけるイメージングのための、より高度な技術を必要とします。ここでは、薬理学的な麻痺と硬いアガロースと固定化の二つの最も簡単な手法を採用する詳細な方法を紹介します。 ここで紹介する方法はCの神経活性および細胞生理機能を測定するために用いることができるエレガンス 。我々は、それぞれの例を参考にしてください外部電場にASJニューロンの感覚応答を測定するGCaMP使用しており、ニューロンのレーザー損傷に対する生理カルシウム応答を測定するためにカメレオンを使用しています。これらの例は、蛍光色素分子の2つのタイプの利点と欠点を示しており、システムで可能なことを示しています。

<table><tbody><tr><td>エクリプス Ti-U 倒立顕微鏡 顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インテンシライト HG イルミネーター</td><td>ニコン</td><td>C-HGFI</td><td>蛍光灯</td></tr><tr><td>CFI プラン アポ VC 60X オイル</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学テーブルまたは 3'X3' 光学 グレードのブレッドボード</td><td>トールラボ</td><td></td><td>光学テーブルを使用しない場合は、a の固体実験台 光学グレードのブレッドボードで十分です 。</td></tr><tr><td>クララインターラインカメラ</td><td>Andor Technology</td><td></td><td>高感度CCDカメラ</td></tr><tr><td>wtGFP Longpass Emission</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>41015</td><td>イメージング用GFPフィルターセット GCaMP</td></tr><tr><td>フィルター 440 +/- 10 nm</td> Cameleon用<td>Chroma</td><td>D440/20x EX</td><td>励起フィルター</td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー > 455 nm ロングパス</td><td>Chroma</td><td>455DCLP BS</td><td>顕微鏡 カメレオン イメージング用ダイクロイ</td></tr>ック<tr><td>ミラー > 515 nm ロングパス</td><td>Chroma</td><td>515DCLP BS</td><td>ダイクロイックミラー、カメレオン用ダイクロイックミラー イメージング</td></tr><tr><td>フィルター535 +/- 15 nm</td><td>Chroma</td><td>D535/30m EM</td><td>YFP発光フィルター</td></tr><tr><td>フィルター480 +/- 20 nm</td><td>Chroma</td><td>D485/40m EM</td><td>CFP発光フィルター</td></tr><tr><td>レンズ、200 mm、アクロマート</td><td>Thor Labs</td><td>AC508-200-A1</td><td>FRET光学系用リレーレンズ (3)</td></tr><tr><td>銀広帯域ミラー</td><td>Thor Labs</td><td>ME2S-P01</td><td>FRET光学系 (2)</td></tr><tr><td>NGMバッファー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>レバミゾール</td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリビーズ マイクロスフェア</td><td>ポリサイエンス株式会社</td><td>08691-10、2.5% by 容積、</td><td>C. elegans <用直径</td>50 nm> 粒子用トランスジェニック</tr><tr><td>株、Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; HIM-5 BKG) </td><td>Sternberg Lab</td><td>PS6388</td><td></td></tr><tr><td>トランスジェニック株、mec- 4::YC3.60</td><td>Gabel Lab</td><td>CG1B</td><td></td></tr></tbody></table>

cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

線虫C. elegansは、in vivoで比較的簡単、低コスト神経イメージングのための理想的なモデル生物である。その小さな透明なボディとシンプルな、よく特徴付けられた神経系が無傷動物内の任意のニューロンの同定および蛍光イメージングを可能にします。動物の生理機能への影響を最小限に抑えてシンプルな固定化技術は、拡張タイムラプスイメージングを可能にする。そのようなカメレオン1とGCaMP 2として遺伝的にコード化されたカルシウム感受性蛍光色素の開発は、細胞生理学と神経活動の両方に関係する神経細胞のカルシウムのin vivoイメージングが可能です。特定のニューロンにこれら蛍光体を発現している多数のトランスジェニック系統は、容易に入手可能であるか、十分に確立された技術を用いて構築することができる。ここでは、GCaMPとカメレオンの両方を使用して、in vivoでの単一ニューロン内のカルシウム動態を測定するための詳細な手順について説明します。我々は、利点とdisadvantを議論両方の年齢だけでなく、試料調製（動物固定化）と画像解析の様々な方法。外傷性のレーザー損傷にニューロンの生理的カルシウム応答を測定するためにカメレオンを使用した外部電場と2に特有のニューロンの感覚反応）を測定するGCaMPを使用した：1）最後に、我々は2つ​​の実験の結果を提示する。これらのようなカルシウムイメージング技術は、C で広く使用されていますエレガンスとは、遺伝的背景を越えて自由に移動する動物は、同時に複数のニューロンと比較して、測定値に拡張されました。Cでelegansは技術的シンプルさとコストで他のモデルシステムを超える利点を用いた in vivo神経イメージングのための堅牢で柔軟なシステムを提示する。

ここでは、2つの独立した実験の結果を提示する。最初は蛍光カルシウム記者が光学的に無傷での神経活動を監視するために使用できる方法の良い例を与えて、定義された外部の刺激に対して特定の感覚ニューロンの応答を測定することがGCaMP採用エレガンス 。第二は、カメレオンが一時的細胞内カルシウムは、このようにカルシウムの生理機能が生体内での単一セル内で測定することができる方法を示す、特定のレーザー損傷に応答して、ニューロン内でトリガ測定するために採用しています。各測定個々の試験結果の技術的な側面に焦点を当てるために提示され、詳細に説明されています。多くの場合、時間をかけて平均応答（刺激に対する各時点での平均応答として算出）や特定のメトリックは、（このような応答の平均振幅など）を多数試験全体で計算されています。典型的には10〜20試験は許容平均測定値が、tを生成するために必要である彼の番号は、応答の固有の変動に左右されます。ここで説明する実験のためのこのようなデータ分析は12と13で見つけることができます。 <p class="jove_cont...

その小さな透明体、定評の神経解剖学と従順な遺伝学的手法および試薬のホストと、<em&gt; Cエレガンス</em&gt;のための理想的なモデル生物を作る<em生体内で&gt;</em比較的シンプルで低コストな技術を使用して&gt;神経イメージング。ここでは、遺伝的にコードされた蛍光カルシウムインジケーターを使用してそのまま成体内の単一ニューロン画像法を説明します。

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

次の実験の全体的な目標は、遺伝的にコードされたフルオロフォーを使用して、線虫内の単一ニューロンのカルシウム動態を測定することです。エレガンスを参照してください、これは最初に、標準的な顕微鏡スライド上の目的のニューロンでカルシウム感受性フルオロフォアを発現する無傷のCエレガンスをマウントおよび動員解除することによって達成されます。次に、個々のニューロンをビデオ顕微鏡法と標準的なエピ蛍光イメージング技術を用いてin vivoでイメージングします。次に、ビデオを解析して、一般的に使用される2つのFluor fours Gキャンプのニューロンの特定の位置での蛍光強度を測定し、堅牢な大振幅のシングルチャネル信号とフレットベースのカメレオンを提供し、デュアルチャネル比を生成します。メトリック測定結果は、特定の感覚刺激に応答して示されたニューロン活動、および細胞損傷に応答した細胞カルシウム生理学から得られますが、これらはどちらも画像化されたニューロン内の相対カルシウムレベルの光学的測定に基づいています。この手法が脊椎動物系や従来の電気生理学の同様の方法と比較した場合の主な利点は、CL elganが、技術的にシンプルで費用対効果の高いin vivoニューロンイメージングのための堅牢で柔軟性があり、遺伝的に扱いやすいシステムであることです。この方法は、広範なフィールドベースのニューロン生物学における重要な質問に答えるのに役立ち、in vivoで個々のニューロンの活性と正弦波の両方を測定できます。まず、最高の画像とシグナル品質を実現するエピ蛍光イメージング機能を備えた標準的な複合顕微鏡から始めましょう。高倍率、高開口数対物レンズ、高感度冷却CCDカメラを使用して、画像の解像度と感度を最大化し、単色フローラ4のバックグラウンドノイズを最小限に抑えます。Gキャンプ用のFluor fourの特定の波長用に設計された標準的な顕微鏡蛍光フィルターセットを使用してください。488ナノメートルでの励起と525ナノメートルでの発光に最適化された標準的なGFPフィルターセットを使用し、カメレオンなどの4つの比率のメートル法の植物相は、同一の画像を2つの別々の波長で同時にキャプチャできるデュアルイメージングシステムを使用します。これは、市販のシステムまたは自作のシステムを使用して、次の方法でデュアル画像をカメラに並べて投影することで実現できます。440プラスマイナス20ナノメートルの励起フィルターと455ナノメートルのロングパスiicミラーを備えた顕微鏡フィルターセットは、カメラのCCDセンサーが通常最初のリレーレンズセットに座る顕微鏡イメージングポートのすぐ外側の初期画像平面に配置された画像マスクで、初期画像平面から1焦点距離離れて光を照合します。 光を2つの別々のイメージング波長またはチャネルに分割し、一方の色を反射しながらもう一方の発光フィルターを透過するダイクロイックミラー。透過光を特定のイメージング波長にさらに制限します。第2のリレーレンズは、ビームパスに配置された各チャネルに1つずつあり、CCDカメラの第2の像面に光を再集束させます。一対のミラーと 2 番目のダイクロイック ミラーがビーム経路を誘導し、2 つの画像が再結合してカメラに並べて投影されるようにします。CCDセンサー。結果の画像の例を次に示します。セットアップが完了したら、次のように画像を調整および微調整できます。送信された画像がカメラの視野の半分をカバーするようにカメラの位置を移動します。ビームパスの最後の2つのミラーを調整して、反射画像を視野の残りの半分をカバーするように移動し、各チャネルの2番目のリレーレンズをビームパスに沿って前後に移動させることで焦点を最適化します。目的のニューロンでカルシウム感受性蛍光色素を発現する動物を、Citis遺伝センターまたは他の供給源から入手します。あるいは、標準的なアザラシエルガン技術を使用してトランスジェニック動物を構築します。次に、次のいずれかの技術を使用して、0.05%lealから2%arosで薬理学的麻痺のためのシールエレガンスを固定し、スペーサーとして2枚のラボテープを持つ2枚のスライドガラスの間に溶融したarosの滴を押すことにより、イメージング用のarosパッドを作成します。トップスライドを取り外した後、5〜10匹の動物を選び、パッドに移します。パッドをカバースリップで覆い、パラフィンワックスとワセリンの熱い1対1の混合物を少量角に塗布して所定の位置に保持します。レミゾールが効果を発揮し、動物が完全に静止するまで5〜10分待ちます。硬いアロス法で動物を動けなくするには、10%アロスパッドを作ります。パッドの表面に1〜10ポリスチレンのマイクロスフェア溶液の約3マイクロリットルを追加し、ビート溶液のプールに5〜10のきれいな海の優雅さをすばやく選びます。カバースリップでやさしく覆い、角に溶かしたワックスを塗ります。典型的な実験では、単一のニューロンの応答をビデオ記録しながら、特定の刺激または条件を動物に投与する必要があります。ビデオ取得用。私たちは、約300ミリ秒の露光時間で、1秒あたり約1フレームで撮影することがよくあります。ビデオを分析して、関心のある領域内の各フレームの蛍光強度、または近くの背景領域に対する画像化されたニューロンのROIを測定する必要があります。当社の分析プログラムは、ムービー内のすべての画像の圧縮画像を表示し、そこからすべてのフレームで対象オブジェクトを囲む大まかな境界を手動で選択し、独立した背景領域を選択します。まず、境界領域内からROIを手動で選択します。後続の各フレームについて、プログラムは境界領域内から最も明るいピクセルを選択して、カメレオンで生成された比率メトリック画像の正しいサイズのROIを生成し、デュアル画像またはチャネルのそれぞれに対して同様の粗いROIと背景領域を選択し、次に最初のフレームの1つの画像からROIを選択します。 各フレームの蛍光シグナル F は、ROI の平均ピクセル強度から背景領域の平均強度を差し引いた値として計算されます。各フレームの相対的なカルシウム レベルは、強度の変化率を、最初のフレームまたは一連のフレームから測定された初期ベースライン値に正規化して計算されます。比率メトリック値は、2 つのチャネルの比率として計算されます。細胞体内で選択されたROIは、最も強力で堅牢なシグナルを生成しますが、神経プロセスに沿ったROIからシグナルを選択して測定することも可能です。励起光への曝露は、植物相4の漂白を引き起こす可能性があり、漂白が発生した場合、曝露レベルに依存する信号の着実な減少によって特徴付けられます。NDフィルターを使用して露光時間や励起強度を低減し、記録中の海の優雅な動きから発生するノイズを最小限に抑えます。光への曝露や実験刺激に反応して、清潔な製剤を使用して固定化手順を慎重に実行します。画像解析を成功させるには、ニューロンに対する画像よりも適度に均一で暗く、散乱光を避けるために十分に離れている背景領域を選択します。ここに示されているのは、1つのCエレガンス、Gキャンプを発現するSJニューロンで、それぞれが10秒間続く3つの別々の試行で、外部の3ボルト/センチメートルの電界に応答します。動物はレミゾールを使用して動けなくなりましたが、ビデオには動きと焦点の両方にわずかな欠陥が見られます。ドリフト蛍光強度を細胞体で測定した。ビデオ障害にもかかわらず、信号は堅牢であり、第1刺激と第3刺激の両方に応答して蛍光が約250%大きく増加しました。第2の刺激による結果は大幅に減少する。ニューロン応答の漂白の変動性を示すことは、一貫したベースラインレベルに戻ることで明らかなように最小限です。外傷性細胞損傷は、細胞の生理学的応答に不可欠な役割を果たすニューロン内の大きなカルシウム一過性を引き起こします。このビデオは、単一のニューロンのレーザーexソドミーに対する損傷誘発応答を示しています。カメレオンレポーターのCFPおよびYFP蛍光チャンネルの両方からの信号を記録するために、デュアルイメージング光学系が採用されました。この図は、レーザー手術実験の過程で細胞体で測定された結果として得られるフレット信号を示しています。レーザーの損傷とTでの細胞質カルシウムの増加に応答して、ゼロ秒に相当します。CFP は急速に減少し、YFP は増加します。その結果、比率メトリック信号がすぐに約 200% 増加し、約 90 秒間持続した後、ベースライン レベル近くまで低下します。漂白は、一貫したベースラインから明らかなように最小限に抑えられています。この図は、ここでの切断点に近い軸索セグメントで測定された結果として得られるフレット信号を示しています。フルオロ4の局所的な量は、実験の過程で変化します。信号を複雑にすると、レーザー手術は軸索を切断し、膜を一時的に破裂させ、植物相4を逃がし、局所的な細胞質濃度を一時的に低下させます。これは、後の時点でのYFPトレースの最初の減少から明らかです。切断された末端は、その継続的な回復の一部として膨潤し、その結果、より局所的なフルオロ4が発生し、強度が増加します。これは、ゆっくりと増加するCFPトレースで最も明白ですが、これらの変動は両方のチャネルに等しく影響し、フレット比が効果的に補償して堅牢な信号を提供します。結果として得られる測定値は、シグナルがすぐに約150%増加し、約90秒でベースライン近くまで劇的に回復し、その後約150秒でさらに小さな二次応答を示す細胞体と同様の応答を示しています。レシオメトリックイメージング用の市販の顕微鏡アタッチメントが利用可能であり、ピクセルごとのレシオメトリック測定を生成するより洗練された画像解析ソフトウェアも利用可能です。習得すると、これらの技術は比較的簡単に、他のモデルシステムや方法に必要な複雑なサンプル調製組織解剖やイメージング技術なしで行うことができます。適切に行えば、実験全体を1時間または2時間で実行できます。このビデオを見た後、イメージングのためにエレガンスを固定化する方法、in vivoで個々のニューロンに対してビデオ最大コピーを実行する方法、および得られたビデオを分析してニューロンに基づく相対的なカルシウムレベルを測定する方法について十分に理解できるはずです。

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神経科学

このビデオでは、カルシウムイメージングの背後にある概念を紹介し、成形されたアガロースウェルに含まれる線虫のタイムラプスイメージングのプロトコル例が含まれています。...

カルシウムイメージング:生きたC.エレガンスの神経活動を可視化する方法

このビデオは、遺伝的にコードされた蛍光レポータータンパク質を使用して、行動する線虫の個々のニューロンにおけるカルシウムイメージングの技術を示しています。これは、ワームの動きをイメージングし、ニューロンからのレポーター蛍光比を測定して、細胞内のカルシウムレベルをニューロンの活動および産卵中の行動変化と相関させる手順を概説しています。...

線虫の産卵行動を制御する個々のニューロンにおけるカルシウムイメージング

出典: Doser, R., et al.in vivoでのニューロンカルシウムハンドリングの細胞内イメージングJ. Vis. 経験。(2023年)このビデオは、トランスジェニックCaenorhabditis elegans株の腹側神経索ニューロンにおける細胞内カルシウムフラックスのin...

Caenorhabditis elegansのニューロンにおける細胞内カルシウムダイナミクスのイメージング

動物を固定化せずに長期間にわたって行動と神経活動をイメージングすることは、行動を理解するための前提条件です。アガロースマイクロ流体チャンバーイメージング(AMI)は、線虫のすべてのライフステージの神経活動と行動をイメージングするために使用できます。...

の長期カルシウムイメージングのためのアガロースマイクロチャンバー<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

このプロトコルでは、線虫みみずの動作における神経活動の変更を記録する遺伝子にエンコードされた Ca2...

線虫の行動で個々 のニューロンのレシオ メトリック カルシウム イメージング

この方法は、光遺伝学と遺伝的にコード化されたカルシウムセンサーを画像ベースラインサイトソリックカルシウムレベルおよびモデル生物C.エレガンスの体壁筋肉における誘発カルシウム過渡の変化に組み合わせる方法を提供する。...

C.エレガンス体壁筋肉における生体内カルシウムイメージング

ここで報告されたのは、よく制御された非局在振動を有する 自由に行動するCaenorhabditis elegans におけるカルシウムイメージングのためのシステムである。このシステムにより、研究者はナノスケールの変位で十分に制御された特性を持つ非局在振動を呼び起こし、振動に対する C. elegans...

自由に行動する カエノルハブディティス・エレガンス におけるカルシウムイメージングと、十分に制御された非局在振動

樹状突起棘は神経系の重要な細胞の特徴です。ここでは、 C.

カエノラブディティス・エレガンスにおける樹状突起棘のイメージング

現在の方法は、容易に入手可能な遺伝的にコードされたカルシウム指標を使用して、カエノラブディティスエレガンスのin...

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

C. elegansの受精および初期発生中のカルシウム過渡現象のin vivoでの可視化

学ぶC. elegansを用いた神経カルシウムイメージング法。遺伝子導入型蛍光インジケーターで単一ニューロンのカルシウム動態を測定し、感覚刺激や細胞損傷に対する神経活動を解析します。技術的に簡便で費用対効果の高い手法です。

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

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