Name: エンドファイトのような真菌Entomopathogensの確立：内生生物制御に向けて (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 14 s
Description: 学ぶ、Beauveria bassianaをインゲン豆の内生菌として確立する方法。葉面散布と土壌灌注の2つの接種法を用いて、農業害虫に対する生物学的防除の可能性を評価するための準備手順を示す。

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生産と実験的な作品は、本明細書でレイナルドパレハの献身的で熱心な助けを反映提示。科学技術革新のコロンビアの管理部門（Colciencias）により、グランドチャレンジレーションズ·イニシアチブを通じてビル＆メリンダ·ゲイツ財団からの助成金によって賄われて。

1。植物<ol><li> 0.5％次亜塩素酸ナトリウム、70％エタノールで2分で2分のためにそれらを浸漬することにより豆の種子（品カリマ）の表面殺菌。種子を滅菌蒸留水で3回リンスする。 </li><li>ジャガイモdextroxeス寒天（PDA）培地上で最後の​​すすぎ水100μlをメッキし、25℃で10日間プレートをインキュベートすることによって殺菌の成功℃を評価するどんな成長がプレート上に確認された場合の実験を終了し、再起動します。 </li><li> 2:1の比率で土と砂の混合物を含有する無菌のポットに3つのグループに種を植える。 25℃で成長チャンバ℃、CAに鉢を移す。 50％RH、12時間日長。一週間発芽後、2つ以上積極的な苗を排除します。水滅菌蒸留水で2〜3日毎とNPK 15-15-15の肥料6g / Lの水溶液で播種後10日と20日肥やす。 </li></ol> 2。菌<ol><li>商業を得るボーベリアひずみGHA（Mycotrol SE、Laverlam、カリ、コロンビア）の金融製剤。 </li><li>単一胞子在庫文化を生成するには、CAを中断します。 1は、Triton X-100、10秒間ボルテックスの0.1％水溶液1mlに分生子の完全なループを接種。その後、25℃で24時間プレートは2.5％ノーブル寒天とインキュベート上の懸濁液100μl℃、 PDAを含む100mmプレートに単発芽分生子を転送し、それがプレート全体（約3〜4週間）をカバーするまでに成長。 </li><li>無菌条件下で、培地の表面から真菌の増殖を削ると10 mlの滅菌0.1％トリトンX-100でそれを中断します。 1分間ボルテックスする。その後、菌糸を除去し、純正サスペンションを得るために無菌寒冷紗を通して懸濁液をろ過する。 </li><li>純正サスペンションの分生子濃度を推定するために血球計を使用してください。生子カウントを容易にするため、各時間は、100μlのoを譲渡、株式の10,000倍希釈を準備0.1％トリトンX-100、および次の希釈前に10秒間ボルテックス900μlの中のf分生子懸濁液。 </li><li>接種材料を生成するには、次式を用いて、10 8分生子/ mlの最終濃度に純正サスペンションを調整します。 <img src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1.jpg" alt="式（1）" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1highres.jpg"/></li><li> 25℃で24時間、2.5パーセントノーブル寒天、インキュベートで10,000倍希釈液の分生子の生存率、プレートを100μlを評価するために℃のその後、パーセント発芽を推定するために100分生子の3つのランダムなグループを検査します。発芽分生子を考えると、そこから分生子プロジェクトの直径の半分以上見える発芽管より長い。平均パーセント発芽率が90％を超えた場合にのみサスペンションを使用しています。 </li></ol> 3。接種<ol><li>彼らは最初の真の葉期（播種後約14日間）に達したときに植物を植菌する。無菌蒸留による土壌容量に水プラントED水の接種前に24時間。 </li><li>葉面散布の方法については、それらが飽和状態に達するまでの葉の向軸（上側）表面に分生子懸濁液（治療）または0.1％トリトンX-100（コントロール）を適用するには、手動噴霧器を使用しています。土壌に分生子の流出を避けるためにアルミホイルで鍋の上部を覆う。噴霧した後、菌の侵入を容易に湿度の高いレベルを維持するために24時間、ビニール袋で植物をカバーしています。 </li><li>土壌灌注方法については、植物の根元の土壌の表面に分生子懸濁液10ml（治療）または0.1％トリトンX-100（コントロール）を適用するためにメスシリンダーを使用しています。 </li><li>接種後、乱塊法でそれらを整理して成長室に植物を返す。劣らず4より追加の実験ブロックは同じ実験で、内生の植民地化の評価に加えて、植物の成長の評価を可能にするためにインストールする必要があります。 </li></ol> 4。評価uations <ol><li>ランダムな順序でブロックを選択し、一度に実験1ブロックを評価します。これは1日で評価できない大実験のために特に重要です。 </li><li>植物を処理する前に、測定し基部から頂端分裂組織にその高さを記録します。その後、慎重に根絶し、水道水の流水でよく洗ってください。 </li><li>各工場から、サンプル2リーフレット、根の2個、茎の二枚。植物の最初の本葉からランダムリーフレットのサンプルを選択します。その後、工場の真ん中から、土壌表面付近から、2幹サンプル、3センチ長さがそれぞれを得る。最後に、ルートの途中からと根端の後ろに1cmから、また、3 cmの長さがそれぞれ、2主根のサンプルを入手してください。適当に3つの別々の紙袋やラベルにサンプルを置きます。 </li><li>ブロック内のすべての植物を洗浄、サンプリングした後、最終的に根、茎、次に葉を処理することによって開始します。 </li><li>表面はトンを消毒上記1.1のような無菌層流フードで問題。滅菌蒸留水に浸漬することにより、各サンプルを3回リンスし、滅菌タオルペーパーで乾燥させます。その後、エンドファイトが消毒との接触により排除されている可能性があり、その外側のエッジを、解剖して廃棄します。 </li><li>茎や根の葉と6mmの長い間、6x6のミリメートルを平均、6つのセクションにトリミングされたサンプルをカットします。プレート2 mg / Lのそれぞれにおける抗生物質テトラサイクリン、ストレプトマイシン、ペニシリン、PDAのメディアと60ミリメートルペトリ皿の上に6つのセクション。パラフィルムでプレートをシールし、25℃、暗所でインキュベート℃を各工場では、6つのプレート、2当たりの植物の一部が得られます。 </li><li>与えられた植物の部分の各ブロックを処理した後、すすぎ水を変更します。捨てる前に使用し、水洗、プレート℃は殺菌の成功を25℃で10日間インキュベートし、PDA、メディア上に100μlのサンプルを評価した。真菌の増殖が続いて起こる場合には、分析のための対応するサンプルを考慮していない。 </li><li>真菌の増殖を観察し、記録するために20日間、2〜3日毎プレートを点検してください。物品税と移転植物のセクションでは、新鮮なPDAを含むプレートに真菌エンドファイトの存在を示す。これは、元のプレート内の隣接するプラントセクションの汚染を避けることができます。 </li><li> レコード Bプラントセクションからバッシアナ成長 。 ボーベリアは、特徴的な白い菌糸が密なエッジで淡黄色にクリームになることによって識別することができます。疑問がある場合は、一滴の水に試料をマウントし、顕微鏡下で検査し、種の特徴、球形の分生子とジグザグ状の分生子柄を探しています。 </li><li>植物バイオマスに治療の影響を評価するために、追加の実験的ブロックを使用します。まず、基地からの頂端分裂組織のトップには、高さを測定します。その後、慎重に根絶し、水道水で植物を洗うとその乾燥重量を決定するために、三日間45℃で、それらを乾燥させます。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

多くの要因がエンドファイトのような真菌昆虫病原物質を確立するための実験の特定の結果に影響を与えることができる。我々の結果は、接種方法は、そのうちの一つであることを示している。を使って実験する生物学的要因は、作物の種や品種を選択し、真菌種昆虫病原物質の歪みを含めたり、隔離するために使用。操作に考慮すべきその他の要因としては、接種物の濃度、接種時の植物の年齢、および植物の生育条件が含まれています。 それは、真菌昆虫病原物質14,17,18,21によって全身植物植民地化の結果に接種方法のために理想的であろう。代わりに、それは、接種方法は、ローカルの植民地化の特定のパターンを好む傾向があるように思われる。土壌水薬がルート植民17を好むのに対し、コーヒーでは、例えば、葉面スプレーは葉の植民地化を支持している。我々は、共通のBeanで同じパターンを発見した。最終的には、接種方法の選択は、あるべきおそらくターゲット草食動物や植物病原体のニッチをマッチング、工場内のエンドファイトの意図された場所に導かれ。 一般的に使用されていますが、メディア文化に基づいたエンドファイト検出および定量は、高価難しく、エラーが発生しやすくなります。たとえば、10800植物切片（1800ペトリ皿上にプレート）の合計は、Bを最適化するために、実験で評価したバナナ16でバッシアナ接種 。これらのうち、4496セクションは推定Bによって植民地化されたとして主にコロニー形態によって識別バッシアナ 、。明らかに、各コロニーのための樹種の微視的検証が望ましいのですが手が届かない段階だっただろう。一方、1176セクションは他の菌類によって植民地化され、破棄され、データ16を行方不明として扱われていました。確率はそのB.しかし、存在バッシアナが悪い選手や成長することが遅かったし、最終的にそれらのセクションから浮上している可能性がある場合十分な時間をllowed。したがって、メディア文化に基づいたエンドファイトの検出方法としては、偽陽性と偽陰性の対象となります。従って、例えば、より信頼性の高い検出および定量方法の開発は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイ20,21,24に基づくものは、十分に正当化される。 接種実験のための究極の目標は、草食性および/または疾患に対して耐久性のある全身の抵抗を提供する効率的な治療法を開発することであるべきです。もっともらしいが、まだテストされていない、仮説は、エンドファイトの植民地化の程度は、エンドファイト媒介抵抗の程度と正の相関であるということです。接種方法を精緻化した後自然な次のステップは、そのため、この相関関係を調べることである可能性があります。いくつかのビデオプロトコルは、研究者が標的害虫や病原体29から31に適した抵抗性検定を設計するのを助けることができます。最終的には、接種の成功を決定する何このアッセイであるる方法、および内部寄生生物的防除のために関連する潜在的な。

真菌entomopathogensはmycopesticides 1とかなりの可能性を秘めた昆虫集団の重要な調節因子である。ごく最近になって、しかし、真菌entomopathogensは両方の自然と様々な接種方法2に応答して、エンドファイトとして発生することが示されている。内部寄生菌類entomopathogensの生態学的機能の大部分は不明のままですが、いくつかの研究では、植物の成長3,4、草食性5-8、および病害抵抗9,10でそれらが示唆されている。ここで紹介する方法の全体的な目的は、内部寄生生物的防除のその後の評価の準備のために、エンドファイトとして菌類昆虫病原物質を導入することである。 ボーベリア （バルサモ）Vullemin（子嚢菌門：ボタンタケ）が最も研究内生菌の昆虫病原物質5-9,11-19であり、そしてそれは商業mycopesticideとして利用可能です。接種方法を確立するためにテスト<eメートル&gt; Bエンドファイトとしてボーベリア土壌の水薬14,17、種子コーティング18および浸漬14、幼根ドレッシング13,15、根および根茎はめ込み11,16,18、幹注射17、葉面スプレー14,17,20と花スプレー19を含む。これらのメソッドを使用して、研究者はBを導入していますバナナ11にバッシアナ 、豆7、カカオ13、コーヒー17、コーン7、綿7、ナツメヤシ12、ジュート21ケシ20、カボチャ7、ラジアータ松18、モロコシ14、トマト7、小麦7。最近の証拠は、その内生Bを示唆しているバッシアナだけではなく、節足動物害虫5-7,22-27から植物を保護するために可能性を秘めているだけでなく、いくつかの植物病原体9から。 インゲンマメ（ インゲンマメ ）害虫の影響を最も受けやすい作物間のランクと疾患。それは、その攻撃の領域28を越え、最も制限的な豆生産要素であると考えられている400以上の害虫や病原体200によって影響を受けることができます。したがって、共通のBeanがBで内部寄生生物的防除の完全なスペクトルを調べるために優れたモデル作物かもしれませんバッシアナ 。この方向での最初のステップとして、この記事では、インゲンマメにおけるエンドファイトとしてB.bassianaを導入するために接種方法として葉面スプレーや土壌の水薬を説明しています。

<table><tbody><tr><td colspan="4">試薬</td></tr><tr><td>試薬名/材料</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td></td></tr><tr><td>Mycotrol SE </td><td>Laverlam</td><td>4167</td><td></td></tr><tr><td>貴族寒天</td><td></td><td>Σ A5431-250G</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンG ナトリウム塩</td><td>Σ</td><td>P3032-25MU</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ (100×15mm)</td><td>フィッシャー</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ (60 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>ジャガイモ デキストロース寒天</td><td>Difco</td><td>213400</td><td></td></tr><tr><td>レギュラー漂白剤 (NaOCl)</td><td>CLOROX</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトマイシン硫酸塩</td><td>Σ</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td>Σ</td><td>T3258-25G</td><td></td></tr><tr><td>トリプルマルメロ (NPK)</td><td>ABOCOL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Biological安全キャビネット</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Fisher</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM LB 顕微鏡</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

エンドファイトのような真菌entomopathogensの確立：内生生物制御に向けて

Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

ボーベリアは endophytically植物にコロニーを形成する能力を持つ菌の昆虫病原物質である。エンドファイト、Bとバッシアナは草食や病気から植物を保護する役割を果たしている可能性がある。このプロトコルは、Bを確立する2つの接種方法を示しています内部寄生生物的防除のその後の評価の準備のために一般的な豆（ インゲンマメ ）でendophytically バッシアナ 。植物は、Bを受信する前に、2週間の表面殺菌した種子から栽培されている10 8分生子/ ml（または水）のボーベリア治療は 、葉面散布や土壌潅注のいずれかとして適用された。二週間後、植物を採取し、それらの葉、茎、根は内生菌類のコロニー形成を評価するためにサンプリングされます。このために、サンプルを個別に、滅菌した面である複数のセクションにカットし、20日間ポテトデキストロース寒天培地中でインキュベートした。メディアは次のように真菌の増殖を観察するために2〜3日ごとに検査されプラントセクションとレコード Bの発生とsociated バッシアナそのエンドファイトの植民地化の程度を推定する。接種の成功の分析は 、Bの発生を比較するトリートメントやコントロール間で与えられた植物の部分の中でバッシアナ （ すなわち 、葉、茎または根）。接種方法に加えて、実験の具体的な成果が目標作物種または品種に依存することがあり、真菌種は、昆虫病原物質株または使用切り分け、植物の生育条件。

B.バッシアナはPを endophytically -植民地化することができました実証接種トリートメント（ 図1）に対応して尋常性 。 B.によってエンドファイト植民地化につながっ葉面スプレーや土壌水薬両方処理された植物の80％以上でバッシアナ （ 図2）。しかし、植民地化の程度が評価さ植物部分および使用接種方法に依存していた。葉は、噴霧接種に最高の答え。ルーツは、他の一方で、水薬接種のみに対応した。最後に、両方の接種方法と同様に答えた茎。B.はバッシアナは制御プラントのどのセクションにも検出されなかった。 治療の独立したA、B以外のエンドファイトバッシアナが評価プラントセクションの15％から増加したが、彼 ​​らは隣接するセクションに侵入し、業績に影響を与える前に、彼らは、メディア·プレートから摘出された。 治療群と対照植物は2週間接種後に目に見えて区別がつかなかった。差異は、その乾燥重量にして、その高さで検出されなかった。 <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。 ボーベリアによって豆の植物の内生植民地化（。 インゲンマメ品種カリマ）の接種トリートメントの代表的な結果左上：制御なしに成長したプレート。右上：プレート全体を汚染プラントセクションから真菌エンドファイト。左下：Bバッシアナは、2つのプラントセクションから成長しています。右下：エンドファイトB.バッシアナ生子および分生子柄は、顕微鏡下で見られる。 <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2.jpg" alt="図2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2highres.jpg"/> 図2。 BEAのエンドファイトの植民地に接種処理の効果ひずみGHAと接種後のボーベリア 、二週間で、n植物（ インゲンマメ品種カリマ）が。パーセント植民地化が培養されたセクションの数で割った植民地化プラントセクションの数を表します。

このプロトコルは、真菌昆虫病原物質を導入するには、2つの接種方法を示しています<em&gt;ボーベリア</em&gt;インゲンマメにおけるエンドファイトとして（<em&gt;インゲンマメ</em&gt;）、内部寄生生物的防除のその後の評価のための準備インチ

エンドファイトのような真菌Entomopathogensの確立：内生生物制御に向けて

 Beauveria bassiana is a fungal entomopathogen with the ability to colonize plants endophytically. As an endophyte, B. bassiana may play a role in ...

こんにちは。私は国際熱帯農業センター（CIAT）の昆虫学者のUsh Parsaです。同じく国際熱帯農業センターのViiV Artizです。そして、米国農務省（USDA）のFernando Vegaです。このビデオの全体的な目的は、病原性真菌の定着を促進および検証する方法を実演することです。エンドファイトとして、自然界では昆虫やダニが病原性真菌に感染していることは一般的であり、これらの真菌病原体を生物農薬として利用してきた長い歴史があります。最近では、真菌病原体が植物に感染していることが時折発見されていますが、その存在による明らかな症状は現れません。この発見は、農業害虫に対する防御的なエンドファイトとして利用できる可能性を示唆しています。この可能性を追求するためには、まず、標的作物において菌類病原体をエンドファイト（内生菌）として確実に定着させる接種方法を開発することが不可欠です。B Bassianaは最もよく研究されている菌類病原体の一つであり、殺虫剤として市販されており容易に入手可能です。この菌は、バナナ、コーヒー、メースを含む多くの植物種においてエンドファイトとして検出されています。最近の知見により、B bassianaは節足動物の害虫だけでなく、一部の植物病原体からも植物を保護する可能性があることが示唆されています。この広範な保護作用を説明するメカニズムについては、まだ十分に解明されていません。それでも、tic valve領域は、害虫や病原体に対する遺伝的抵抗性を欠く作物にとって有望である可能性があります。特に、複数の敵による同時攻撃を通常的に受ける作物において、fas vulgarisがその代表的な例となります。400種以上の害虫と200種の病原菌の影響を受ける可能性があり、それらによる被害が地域を問わずインゲン豆の生産における最大の制限要因と考えられています。このため、インゲン豆はEndo bbarの保護能力を検討するための優れた候補作物であると考えられます。この方向への第一歩として、Arvidは、Banaをエンドファイトとして定着させるための接種方法として、葉面散布と土壌灌注の有効性を実証します。TOMAと呼ばれる豆の共通豆種子を、0.5%次亜塩素酸ナトリウムに2分間浸漬して表面殺菌し、続いて70%エタノールに2分間浸漬し、滅菌蒸留水で3回洗浄して殺菌を完了させます。洗浄水の100 µLサンプルをPDA培地を入れた100 mmのペトリ皿に塗布し、25 °Cで10日間暗所で培養します。これらのコントロールで増殖が見られた場合は、実験を中止して再開する必要があります。種子は、土壌と砂を2:1の割合で混合し、蒸気滅菌した幅11.5cmのポットに3粒ずつ播種します。発芽の1週間後から、温度25°C、相対湿度50%、光周期12時間、光強度9,200 luxの制御条件下で植物を育成します。その後、植物の勢いを確保し、個体間の競争を排除するため、1ポットにつき1株になるよう間引きを行います。2〜3日ごとに必要に応じて灌水し、植え付けから10日後および20日後にNPK肥料の6 g/L水溶液で施肥します。菌類の遺伝的一様性を確保するため、分離株は単一のカナダ株から育成する必要があります。菌源が真菌症に罹患した昆虫である場合は、検体をラミナーフローフードに運び、白金耳を用いて胞子形成している菌の少量をPDA培地に接種します。標的となる真菌がクリーンな培養状態で成長し、胞子を形成した後は、汚染物質を除去するために新しい培地プレートへの継代が必要になる場合があります。少量の胞子サンプルを 0.1% Triton X 100 水溶液 1 mL に懸濁してボルテックスします。Triton X 100 は界面活性剤であり、水の表面張力を低下させて胞子を分散させます。この懸濁液の 100 µL アリコートを、2.5% noble acre の薄層を含む 100 mm petri plate 上に広げます。これにより、ステレオ顕微鏡下で胞子を視覚化することが可能になります。プレートを室温かつ暗所で24時間インキュベートした後、発芽した単一のペン培地をPDA培地プレートに移植し、培地全体を覆って胞子形成するまで3〜4週間培養します。この方法により、以降の実験に使用する菌類の純粋培養物を得ることができます。本デモンストレーションでは、市販製品Microtから入手したBavaria Bassianaの純粋培養株GH HAを使用します。接種源は無菌条件下で調製します。ラミナーフローフード内で、滅菌済みスパチュラを用いて培地表面から約1 gの菌糸成長物を掻き取り、10 mLの滅菌済み0.1% Triton Xに懸濁させます。この懸濁液を1分間ボルテックスし、滅菌済みチーズクロスでろ過して、分生子を菌糸から分離します。この工程で得られた分生子懸濁液を、接種用の最終濃度である1 mLあたり10⁸個の分生子に調整します。まず、kediaの計数を容易にするため、段階希釈によってストックの濃度を推定します。Hema Cytometerを用いて、ストック100 µLを0.1% Triton X 900 µLで希釈し、ボルテックス処理して10倍希釈液を作成します。この手順をさらに3回繰り返し、10,000倍希釈液を得ます。Kediaは、最初の希釈液では極めて大量に存在し、最後の希釈液では容易に計数可能な少量の数で存在します。Hemaサイトメーターの2つのチャンバーそれぞれに、10,000倍希釈液を10 µLずつ注入し、顕微鏡下でkediaを計数します。Hemaサイトメーターの計数領域は9つの大きな正方形で構成されており、各正方形の容量は100 nL、すなわち0.0001 mLに相当します。サンプル中のED濃度を推定するために、各チャンバーの4つの大きなコーナー正方形内のEDをカウントして平均し、その平均値を0.0001で除します。この濃度に希釈係数10,000を乗じることで、ストック溶液の濃度が求められ、ここからストック溶液を調整すべき最終容量を計算します。1 mLあたり10³⁸ ediaの接種量を得るために、以下の公式を適用します。最終容量は、ストック容量にストック濃度を掛け、それを最終濃度で割った値に等しくなります。本デモンストレーションでは、目的の濃度を得るために、ストックを195.5 millilitersの最終容量に調整する必要があります。接種源を使用する前に、運河の生存能を評価する発芽試験を行うことが重要です。この試験では、10,000倍希釈液 100 µLを、2.5% noble eggまたは培地を含む100 mmペトリ皿に分注します。サンプルを滅菌ガラス棒で培地表面に塗抹し、25 °Cの暗所で24時間培養します。顕微鏡下で、発芽管が伸長している菌糸の割合を推定し、生存率を評価します。100個のカナダ製サンプルのランダムな3つのサンプルについて、平均発芽率が90%を超える場合にのみ、カナダ懸濁液を接種に使用できます。このデモンストレーションでは、平均発芽率97%が得られました。植物が最初の真葉の段階に達した時に適用する、葉面散布と土壌灌注という2つの接種方法を実演します。植え付けから約14日後、手動式アトマイザーを用いて、葉が飽和するまでカナダ懸濁液を葉の表面または上表面に向けて噴霧し、葉面散布法を行います。土壌への懸濁液の流出を防ぐため、各ポットの上部はアルミホイルで覆います。散布後、菌の侵入を促進するために高湿度を維持し、各植物を24時間プラスチック袋で覆います。土壌灌注接種法は、土壌の最大保水能において行います。植物に灌水して土壌を飽和させてから約24時間後、菌懸濁液10 millilitersを土壌表面に施用します。対照区の植物の根元には、対応する処理と同様の方法で、滅菌した0.1%Tritton Xを施用します。植物を育成チャンバーに戻し、1処理あたり3反復の乱塊法で配置しました。接種から2週間後に、1ブロックずつ定着度を評価しました。植物を慎重に収穫し、個々の植物を流水で丁寧に洗浄しました。葉身2枚、根2部位、茎2部位をサンプリングします。葉身は植物の第1本葉からランダムに選択し、正方形にトリミングします。茎のサンプルは、植物の中間部と地表付近から約3 cmの長さを採取します。主根のサンプルは、根の中間部および根端から1 cm後方から、同様の長さを採取します。各サンプルを、滅菌フード内で0.5%次亜塩素酸ナトリウムで2分間、続いて70%エタノールで2分間、個別に表面殺菌し、滅菌蒸留水で3回すすいだ後、乾燥させます。滅菌済みのペーパータオルを用いて、殺菌剤との接触により内生菌が死滅している可能性がある外縁部を慎重に切り出します。その後、トリミングしたサンプルを、葉の場合は平均6×6 mm、茎および根の場合は長さ6 mmの小さなセクションに切断します。切片を、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、およびペニシリンをそれぞれ 2 mg/L 添加した PDA 含有 60 mm シャーレに播種します。最後に、プレートをパラフィンで密封し、25 °C の暗所で培養します。各ブロックの処理後にすすぎ水を交換しますが、その前に 100 µL のサンプルを 100 mm シャーレの PDA 培地に播種し、25 °C で 10 日間培養して、表面殺菌が成功したかを確認します。このコントロールで増殖が認められた場合、そのブロックは廃棄し、解析の対象とはしません。真菌の増殖を観察し記録するため、プレートを20日間にわたり2〜3日ごとに点検します。コロニーが形成された植物切片は、隣接する切片を汚染させないよう、個別に切り出して新しい培地プレートに転移させます。B bassianaの増殖は、特徴的な白色の緻密な菌糸体が、端の方からクリーム色から淡黄色に変化することに基づいて記録します。判断に迷う場合は、サンプルを顕微鏡のステージ上で水滴に封入し、定着度の評価を行う同日に、本種に特徴的な球状の分生子とジグザグ状の分生子柄を確認します。また、処理が植物の成長に及ぼす影響についても評価します。まず、植物の基部から成長点の頂端までの草高を測定します。次に、植物を慎重に抜き取り、水道水で洗浄した後、45 °Cで3日間乾燥させ、乾燥重量を測定します。本デモンストレーションでは、代表的な結果を得るために、全実験を2回実施しました。どちらの接種方法においても、処理した植物の80%以上でBanaによる物理化が認められました。しかし、定着の程度は、評価した植物部位および使用した接種方法によって異なりました。また、葉の反応が最も良好でした。一方で、根は灌注接種にのみ反応し、噴霧接種には反応しませんでした。最終的に、茎はどちらの接種方法に対しても同様の反応を示しました。処理したエンドファイトであるBana以外のBanaは、対照群のどの植物部位からも検出されませんでしたが、評価した植物部位の15%からBanaが回収されました。ただし、これらは隣接する部位に侵入して結果に影響を及ぼす前に、培地プレートから切り出されました。接種から2週間後、処理区と対照区の植物に視覚的な違いは見られず、乾重量および草丈においても有意な差は認められませんでした。内生病原菌を最終的な影響として確立させるための実験において、特定の結果に影響を及ぼす要因は数多く存在します。本ビデオで示すように、接種方法はその要因の一つです。検討すべき生物学的要因には、選択する作物種や品種、またはOMA病原菌の種や分離株の選択が含まれます。また、操作を検討すべきその他の要因として、接種源の濃度、接種時の植物の齢、および植物の栽培条件が挙げられます。これらの実験の最終的な目標は、INEまたは疾患に対して持続的な全身抵抗性を付与する効率的な処理法を開発することであるべきです。内生菌（Endophyte）が媒介する抵抗性を検証する準備が整った際は、Journal of Visualized Experimentsで公開されている「Herbal Resistance Mechanisms」の特徴を解説したビデオを視聴することをお勧めします。内生菌は植物に非常に一般的に存在し、標的となる真菌病原体を内生菌として持続的に定着させ、検出する能力に影響を及ぼす可能性があることに留意してください。このデモンストレーションがお役に立てば幸いです。実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

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