農業で使用する生分解性プラスチックマルチフィルムを分解するための可能性を持つネイティブ土壌微生物の分離

次の実験の全体的な目標は、生分解性マルチフィルムにコロニーを形成し分解する土壌真菌とバクテリアを分離することです。これは、最初に生分解性マルチフィルムをメッシュバッグ内の土壌でインキュベートし、天然の土壌微生物による実質的なコロニー形成を可能にするのに十分な時間によって達成されます。インキュベーション後、マルチを抽出し、希釈めっきすると、密接に関連する各培養可能なタイプの微生物の単一の単離コロニーが得られます。

次に、単離された微生物を、炭素源の有無にかかわらず、新鮮な表面、感染性、生分解性マルチ、および寒天プレートにパッチします。成長を比較するために、結果を液体培地で確認します。結果は、走査型電子顕微鏡に基づく特定の分離株によるコロニー形成および/または分解を示しており、ゲル浸透クロマトグラフィーによって検証できます。

未確認の真菌や細菌の分離株を扱う作業は危険な場合があり、この手順を実行する際には、手袋の着用、培養チューブや皿の密封、バイオセーフティキャビネットでの作業など、常に予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。マルチピースを土壌でインキュベートし、テキストプロトコルに従って培地と試薬を調製した後、新しいマルチピースを4.25センチメートルの正方形にカットしてマルチピースを除染します。プラスチックから作られたもののようなオートクレーブ不可能なマルチピースのためにそれらを変更または劣化させない場合は、それらをオートクレーブします。

テキストプロトコルに従ってバイオセーフティキャビネットを準備した後、マルチピースを除染フードに一列に並べて置き、UV光の下でマルチピースを2時間インキュベートします、清潔な滅菌鉗子を使用して、前列から始めて、新しく除染された表面に手や腕を置かないように後ろに向かって作業します。マルチピースを裏返し、感染した面を下にして、紫外線にさらされているが、以前にマルチと接触していない清潔な場所に置きます。両側で2時間のUV処理を行った後、再び前から後ろに向かって作業します。

滅菌鉗子を使用して、バイオセーフティキャビネットからマルチピースを取り出し、ホイルで覆われたビーカーなどの滅菌された乾燥した蓋付き容器に入れます。無菌トランスファーフードの下に、暗闇の中で室温で保管してください。無菌技術を使用して、UVディスに感染したマルチピースを寒天プレートの表面に置き、最初に1つの角を静かに置き、正方形の残りの部分を寒天に接触させます。

非透水性フィルムの場合、マルチピースの角の上に溶融した半固体の最小培地の10マイクロリットル滴を4滴置き、疎水性プラスチックの初期コロニー形成のための水と栄養源を提供します。マルチ部分の表面に触れないでください。ピペットチップで、液滴はビーズに固まります。

蓋をしたプレートを室温で一晩直立させてインキュベートし、固化させます。次に、プレートを寒天面を上にして、摂氏4度の暗闇に保管します。バイオアッセイに必要なすべての材料が準備され、土壌に埋もれたマルチピースからマルチ分解菌の可能性のある分離を開始する準備が整いました。

土からメッシュバッグを掘り起こし、メッシュバッグからマルチピースを取り除きます。滅菌ヘラと鉗子を使用して、表面にしがみついている土壌を乱すことなく、マルチから余分な土壌を優しく取り除きます。BDMフィルムを0.5グラムの材料が回収されるまで1センチメートル四方にカットします。

サンプルの転写を繰り返すたびに、0.5グラムのマルチピースと付着した土壌を25ミリリットルにします。9.5ミリリットルのPBSを含む培養チューブは、土壌のみのコントロールチューブまたはマルチが完全に分解されたサンプルに0.5グラムの土壌を加えて、バイオフィルムをバラバラにし、マルチピースから細胞を分離します。チューブを高速で30秒間ボルテックスした後、ウォーターバスで10分間超音波処理し、再度ボルテックスします。

これにより、マルチピースに関連付けられた微生物細胞の均質な懸濁液が得られるはずです。サンプルの段階希釈用。4.5ミリリットルの滅菌PBSを含む1つの培養チューブを準備し、懸濁液の元のチューブからサンプルごとに450マイクロリットルのPBSをディープウェルプレートの3つのウェルに充填します。

滅菌PBSの4.5ミリリットルに0.5ミリリットルを移し、30秒間高速でボルテックスした後、10倍〜5.0倍を陰性第3希釈液に、96ウェルプレートミックスに50マイクロリットル〜450マイクロリットルのPBSを添加し、10倍から負の6倍までの希釈が完了するまで10回を緩やかに上下にピペッティングして行う。火炎滅菌した曲げガラス棒を使用して、クロラムフェニコールを含むPDAプレートの寒天表面全体に各希釈液から100マイクロリットルを均一に広げ、細菌の増殖を抑制します。プレートを30分間直立させて保管し、液体を染み込ませます。

次に、プレートをパラフォームでシールして、胞子が未確認の分離物から逃げるのを防ぎます。逆さプレートを20°Cの暗闇で5日間インキュベートし、成長の早い菌類と遅い菌類の両方がバイオセーフティキャビネット内でコロニーを形成するようにします。単一の滅菌つまようじを使用して、単一の単離コロニーの希釈プレートを調べます。

コロニーにそっと触れてから、真菌の最小培地、真菌の最小培地、プラスチックとグルコースの最小培地プレートの順に寒天に触れ、プラスチックフィルムの上に寒天ビーズを接種します。つまようじを寒天ドットの表面にそっとこすりつけ、プラスチックフィルムにスワイプします。同じソースコロニーから接種を繰り返し、4つになるまで行います。

プレートを20°Cで5日間暗所でインキュベートした後、各プレートに縞模様を再現します。プレートを比較して、寒天以外の炭素を添加していない最小限の培地で成長するよりも、マルチピースで成長する分離株を特定します。これらは潜在的なマルチ分解剤です。

GMMプレートは、培地にグルコースが含まれているポジティブコントロールプレートであるため、最も多くの成長を収める必要があります。この時点では、土壌分離物は完全に純粋ではない可能性があるため、滅菌爪楊枝を使用して真菌から接種物をこすり落とし、マルチにコロニーを形成し、ジャガイモのデキストロース寒天に分離するために縞模様にしてから、プレートを密封して5日間インキュベートします。5日間のインキュベーションの後、単一の孤立したコロニーが生じます。

これらの新しく精製されたコロニーが、プレートバイオアッセイでマルチコロニー形成を示すことを確認し、元の潜在的に不純な分離株で観察されたのと同様のコロニー形成を示します。プレートバイオアッセイによって潜在的なマルチ分解剤が特定されたら、この最終確認アッセイで液体バイオアッセイを使用して検証すると、マルチの下には寒天さえも不足しています。ピースは、この厳格に調製された培地での微生物増殖のための唯一の炭素源であり、微生物分離株の各複製に対して他の添加炭素を欠いている真菌培地への表面の感染したマルチピースへのアッセイを開始します。

接種用のチューブを3本用意します。1つは、5ミリリットルの最小限の培地が入った実験用チューブで、ここでは所定のサイズのマルチピースを含むFMMとラベル付けされています。2つ目は、炭素源を含まない最小媒体の5ミリリットルのネガティブコントロールです。

そして3つ目は、5ミリリットルのグルコース含有液体を使用したポジティブコントロールです。ここではGMMとラベル付けされています。さらに、テストする各マルチを含む最小限の培地の複製チューブを準備しますが、接種はしないでください。

このコントロールチューブは、新鮮な胞子を成長させて収集した後の汚染に起因する微生物の増殖を明らかにします。テキストプロトコルによれば、滅菌トランスファーフードで、以前に調製した培養チューブに100万個の胞子または酵母細胞を接種し、キャップを密封し、摂氏20度で振とうせずに暗闇でインキュベートします。サンプルの成長を毎週観察します。

マルチピース上の真菌の菌糸体の成長は、接種後最初の1週間以内に、特にプランクトン酵母のマルチピースの端で、600ナノメートルでの光学密度の読み取りによる成長をモニターします。目で成長を評価し、光学顕微鏡および/または走査型電子顕微鏡で最小培地のみのコントロールで確認します。光学濃度の変化を認識できないほど小さい小さな白いフレックスを探します。

分光測光法を使用します。ペーストピペットを使用してフレックスを吸引し、差動干渉を使用してそれらを観察します。プレートバイオアッセイで3つの潜在的なマルチ分解分離物を、私たちのポジティブコントロールであるウィードガードプラスと呼ばれるセルロース系マルチとBioreと呼ばれるデンプンベースのプラスチックマルチの両方から分離した後のコントラスト顕微鏡。

それらを液体バイオアッセイで68日間インキュベートし、捕集してから走査型電子顕微鏡にかけました。予想通り。真菌性菌は、セルロースコントロールマルチの分離株に対して棒状の細胞が観察されたXXおよびYYを除くすべてのサンプルで観察されました。

国連で示されているように、植物由来の繊維の雑草ガードとマルチの残留気管要素のための接種コントロールでは、FMMのみのコントロールでは成長は観察されませんでしたいくつかの繊維の列に見られるわずかなあばたのマーキングとしてのみ検出できましたが、真菌のハイフィーは、セルロースコントロールマルチの3つの接種サンプルすべてで観察されました。気管成分はSSサンプルでのみはっきりと見え、セルロース系物質の消化により、分離SSの下の木化した気管要素が、デンプンベースのプラスチックマルチのソーダ内のソーダミエとして18sリボソームDNAを使用して暫定的に同定されたことを示唆しています。分離物は、分離物の培養管内で渦巻くときに見える単一の白色スペックを制御する最小培地では有意な成長は観察されず、VVおよびZZは、分離vvのための微分干渉コントラスト顕微鏡を使用して観察された。

スペックは胞子の塊であり、おそらく最初の接種から残っていた。分離zzの場合。この塊は、直径約0.2ミリメートルの雑菌のゆるいメッシュで構成されており、元の胞子接種物が発芽したが、ここに描かれた質量を超えて成長しなかったことを示唆しています。

ここで、でんぷんベースのプラスチックマルチの国連接種管理で見られるように、でこぼこのテクスチャーが観察されます。白い特徴の正体は不明ですが、ここに示されている孤立したVVによって植民地化された映画には存在しません。白い粒子と隆起の両方が、アイソレートzzによってコロニー化されたフィルムで消えています。

さらに、後者のサンプルは、BDM表面分離株全体で亀裂が均一に発生していることを示しました。VVとZZは、at sリボソームDNAをそれぞれペニシリウムとACEとして使用して、それぞれハイポのオーダーで暫定的に同定されました。この方法は、農業業界向けのプラスチックマルチの生分解に関する洞察を提供できますが、環境中の生分解が問題となる他のプラスチックにも適用できます。

たとえば、海洋環境にたどり着く可能性のあるプラスチックです。それらは食品業界に使用されていますか?私。