マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

この手順の全体的な目的は、さまざまな実験的処置に対するcyclic AMP産生の差を測定するために、健全なアイレットを単離することである。まず膵臓を膨張させ、次に摘出することでこれを達成する。その後、一連の遠心分離と洗浄を通じて、健全なアイレットを単離する。

次に、生存しているアイレットを新鮮なアイレット培養培地に移し、一晩インキュベートします。最終ステップでは、アイレットを目的の実験処理にさらし、cyclic AMPアッセイを行います。最終的に、酵素免疫測定法を用いて、アイレットに適用したさまざまな処理に対するcyclic AMP産生の変化を測定します。

一般的に、この方法に不慣れな人は、膵臓を完全に膨張させるために多くの練習が必要となるため、苦労することがあります。まず、シリンジとカニューレに5 mLのコラゲナーゼ溶液を充填します。鈍化した30ゲージの針をカニューレに取り付け、シリンジとカニューレを氷上に置きます。

マウスの小腸を右側に寄せた後、総胆管の末端にあり、小腸に向かって広がり白い三角形を形成しているオディ管括約筋を探します。括約筋が見つかったら、Dumont 5番ピンセットを用い、胆管を穿孔しないよう注意しながら、ピンセットの先端を総胆管の下に、可能な限り小腸に近い位置まで滑り込ませます。

小腸と結合組織を貫通させた後、デュモンピンセットの先端を使用して縫合糸を掴み、総胆管の下へ引き込みます。漏出を防ぐため、結び目がしっかり締まっていることを確認しながら、オディ {span data-jove-entity="sphincter of OD"} の可能な限り近くで総胆管を結紮します。次に、縫合糸の両端を掴み、尾側に向かって引っ張ることで総胆管に一定の張りをかけます。

次に、空いた手で、共通胆管の肝臓への最終分岐点の直上の部分を、マイクロ scissors で小さく切開します。その際、糸の両端を持って共通胆管をピンと張った状態にしてください。氷バケツからシリンジとカニューレを取り出します。シリンジを置き、準備した先端を鈍らせた 30 gauge 針を切開部に挿入します。

総胆管。管壁を貫通させないように注意します。膵臓を十分に膨らませることが最も難しい点です。

密閉性の高いニードルを使用します。最初のニードルで十分な密閉が得られない場合は、27ゲージなどのより太いニードルを使用してください。次に、膵臓の最初の部分が膨らむまで、シリンジのプランジャーをゆっくりと押し下げ、脈動的に圧力を解放します。

その後、膵臓が膨らまなくなるまで、緩やかで一定の圧力をかけます。正常に膨張した場合、外分泌組織が均等に分布し、胃の上部にある膵臓部分が膨らみます。膵臓を取り出すには、片手のピンセットでオディ直腸括約筋付近の小腸を把持します。

もう一方の手で、閉じた状態の曲がり鋏の先端を挿入し、膵臓の一部を小腸から分離します。鋏の先端を小腸に沿って、ピンク色の結合組織まで移動させます。次に、胃との接合部付近の小腸を持ち上げ、膵臓を小腸の残りの部分から切り離します。

膵臓を可能な限り多く把持し、ゆっくりと持ち上げます。曲弯したハサミを用いて、膵臓と胸腔との間の残りの接続部位を切断します。

膵臓を完全に摘出するため、摘出した各膵臓を約2.5 millilitersのコラゲナーゼ溶液に保存します。膵臓を洗浄するために、氷上に個別の50 milliliterコニカルチューブを用意します。まず、各膵臓を25 millilitersのコラゲナーゼを含む新しい50 milliliterコニカルチューブに移します。

次に、膵臓を入れた50 mLコニカルチューブを、37 °Cの振盪水槽に直立させて設置します。この水槽は220～250 RPMで振動可能なものを使用し、シェーカーはオフにした状態にします。続いて、各50 mLコニカルチューブに95%酸素および5%二酸化炭素を5分間通気します。

パスチャーピペットを用い、各チューブのキャップをしっかりと締め、振盪恒温水槽の水面下に横向きに配置します。6分目から開始し、16分目まで、1分おきに20秒間、220～250 RPMでチューブを振盪させます。振盪後、チューブを室温で400～500 Gsで遠心分離し、最大速度に達した直後に遠心機を停止させます。

次に、ペレットを乱さないように注意しながら、バキュームトラップを用いて各チューブからコラゲナーゼ溶液を約22.5 milliliters吸引します。その後、ペレットを12.5 milliliterのHBSSで再懸濁し、チューブを穏やかにボルテックスしてペレットを分散させます。細胞の洗浄とボルテックスを行い、さらにHBSSを加えた後、各細胞懸濁液を1000 micronメッシュでろ過し、新しい個別の50 milliliterコニカルチューブに回収します。

その後、細胞懸濁液を再度遠心分離し、真空トラップを用いて、ペレットを乱さないように注意しながらHBSSをすべて吸引します。HBSSをすべて除去したら、各チューブに25%F call solutionを4.8 milliliters加えます。ボルテックスでペレットを解きほぐした後、50 milliliterコニカルチューブを回転させながら、チューブの壁面に沿って23%20.5%および11%fial solutionを2.4 millilitersずつ慎重に分注します。

FIコール溶液を遠心分離した後、層が均一になるように、外分泌組織のペレットが残るように注意しながら、すべてのFIコールを新しい50 milliliterコニカルチューブに分注します。新しいチューブに、50 milliliterの標線まで氷冷したHBSSを加えます。その後、キャップをしてチューブを4〜6回転倒混和します。

FI callとHBSSを混合させます。バキュームトラップを使用して、緩いペレットを乱さないように注意しながら、HBSS混合液の大部分を慎重に吸引します。その後、ペレットを新しいチューブに移します。

パスツールピペットを使用して、アイレットをアイレット培養液を含むペトリ皿に移します。この際、ASIN artの組織破片が混入しないように注意してください。ペトリ皿をバックライト付きの解剖顕微鏡に設置します。

健康なアイレットは球形で、中心部がゴールデンブラウンからダークブラウンの色をしています。ASINや組織に付着しており、色がくすみ灰色に見えるアイレットは使用せず、廃棄してください。さらに、一晩のインキュベーション後に中心部に暗色の壊死が見られる大きなアイレットは、適切に機能しないため廃棄してください。

アイレットの調製物に大量のデブリが含まれている場合は、新鮮な培地へ2回手作業でアイレットを移し、凝集を抑制するために消化緩衝液にDNAを添加します。まず、ペトリ皿の中央にアイレットが集まるように軽く回します。P 20ピペットを使用し、アイレットを5 mLのプレインキュベーション溶液が入った新しい15 mm × 60 mmポリスチレン製ペトリ皿に移し、アイレットからグルコース含有培養基を洗浄します。

次に、P 20ピペットを用いて、新鮮なガス充填済みのKrebs ringer bicarbonate buffer 1 mLが入った個別のマイクロ遠心チューブに、アイレットを少なくとも13個分移します。その際、チューブ間でアイレットのサイズに一貫性を持たせてください。サンプルを37 °C、5% CO2で45分間インキュベートした後、チューブに蓋をし、迅速にボルテックスし、卓上遠心機を用いて室温で7,000から7,500 Gsまで遠心分離します。インスリンやその他の代謝物の後続解析を目的とする場合は、P 1000ピペットを用いて培地の一部をマイクロ遠心チューブに回収します。刺激培地の回収が不要な場合は、廃棄しても構いません。

P 1000 ピペットを使用して、各マイクロ遠心チューブ内の Krebs 液の大部分を除去し、アイレットペレット上に約 10 ～ 15 µL の Krebs 液が残るようにします。次に、P 20 ピペットを用いてペレットに最も近い部分を除去します。最後に、アイレット上の Krebs 液が 10 ～ 15 µL 未満になったら、アイレットペレットを液体窒素で急速冷凍します。

その後、cAMPを測定するまで、スナップ凍結したペレットを-80°Cで保存します。通常、薬剤がcAMP産生に及ぼす影響は、インスリン分泌への影響と直接的に相関します。本実験では、野生型または遺伝子ノックアウトマウスから単離した膵島を11.1 mMのグルコースで刺激し、細胞内サイクリック

cAMP産生量を測定し、総細胞タンパク質量で標準化した。分泌インスリン量は標準的なインスリンELISA法を用いて測定し、同様に総細胞タンパク質量で標準化した。予想通り、cAMP産生量の変化は、グルコース刺激性インスリン分泌の増強と直接的に相関していた。

このビデオを視聴することで、健康なマウスの眼球から培養細胞を単離し、cyclic aおよびpのレベルを測定できるようになります。