マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

ランゲルハンス単離したマウスの膵島を用いたin vitroβ細胞機能をアッセイすることは、糖尿病の病態と治療薬の研究に重要な要素である。多くの下流のアプリケーションが利用可能であるが、このプロトコルは、具体的にはβ細胞機能を決定する本質的なパラメータとして、細胞内サイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）の測定を記載する。

この手順の全体的な目標は、さまざまな実験的治療に応答して環状 A MP 産生の違いを測定するために、健康なアイレットを分離することです。これは、最初に膵臓を膨らませ、次に2番目のステップで膵臓を取り除くことによって達成されます。健康なアイレットは、一連のスピンとウォッシュによって分離されます。

次に、生存可能なアイレットを新鮮な膵島培養培地に選別し、一晩インキュベートします。最終ステップでは、アイレットを目的の実験的処理にさらし、サイクリックA MPアッセイを実施します。最終的に、酵素免疫測定法を使用して、アイレットに適用されたさまざまな処理に応答した環状A MP産生の変化を測定します。

一般的に、この方法に不慣れな人は、完全な膵臓の膨張を達成するために多くの練習が必要なため、苦労するでしょう。まず、シリンジとカニューレに5ミリリットルのコラゲナーゼ溶液をプリロードします。鈍い30ゲージの針をカニューレにロードし、シリンジを氷上のカニューレに置きます。

小腸をマウスの右側に移動した後、総胆管の端にあり、小腸に広がって白い三角形を形成しているodの括約筋を見つけます。括約筋が見つかったら、5番のデュモン鉗子のペアを取り、先端を総胆管の下にできるだけ小腸に近づけてスライドさせます。ダクトに穴を開けないように注意しましょう。

小腸と結合組織に突き刺した後、デュモン鉗子の先端を使って縫合糸をつかみ、総胆管の下に引き込みます。総胆管をODの括約筋にできるだけ近づけて結び、漏れを防ぐために結び目が教えられていることを確認します。次に、縫合糸の両端をつかんで尾に向かって引っ張り、総胆管に張力をかけます。

次に、フリーハンドを使用して、総胆管の最後の分岐部のすぐ上にある総胆管で、総胆管がぴんと張った状態でひもの端を保持している肝臓に小さなはさみで小さな切開を行います。シリンジとカニューレをアイスバケツから取り出します。シリンジを置き、準備した鈍い30ゲージの針をカットに挿入します。

総胆管。ダクトの壁を突き破らないように注意してください。完全な膵臓の膨張を得ることは最も難しい部分です。

シール性の良い針を使用しています。最初の針でしっかりと密閉できない場合は、27ゲージの針のような大きな針を使用してください。次に、シリンジのプランジャーを押し下げ、膵臓の最初の部分が膨らむまで、脈動する方法で圧力をゆっくりと逃

これに続いて、膵臓が膨らまなくなるまで、穏やかで一定の圧力をかけます。インフレーションが成功すると、外分泌組織が均等に分布し、胃の上にある膵臓の一部が膨らみます。膵臓を切除するには、片手で一対の鉗子を使用して、odの括約筋で小腸をつかみます。

もう一方の手で、湾曲したハサミの閉じた先端を挿入して、膵臓の一部を小腸から分離します。先端を小腸を下ってピンク色の結合組織に移動します。次に、胃に付着する場所の近くで小腸を拾い上げ、膵臓を小腸の残りの部分から切り取ります。

膵臓をできるだけつかみ、そっと持ち上げます。湾曲したハサミ付き。膵臓と胸腔の間の残りの接続を切り取ります。

膵臓を完全に除去するには、除去した各膵臓を約2.5ミリリットルのコラゲナーゼ溶液に保存します。.膵臓を洗うための氷上の個々の50ミリリットルの円錐管。まず、各膵臓を25ミリリットルのコラゲナーゼを含む新しい50ミリリットルの円錐管に移します。

次に、50ミリリットルの円錐管を含む膵臓を配置します。37°Cの振とう水浴で直立し、シェーカーをオフにした状態で220〜250RPMで振動することができます。次に、50ミリリットルの円錐管ごとに95%の酸素と5%の二酸化炭素を5分間ガス化します。

牧草地のピペットで、各チューブをしっかりとキャップし、水面下の振とうしている水浴に横向きに置きます。6分目から、チューブを220〜250RPMで20秒間、隔分で最大16分間振ってください。振とうした後、チューブを室温で400〜500Gで回転させ、遠心分離機がフルスピードに達したらすぐに遠心分離機の電源を切ります。

次に、ペレットを乱さずに、真空トラップを使用して、各チューブから約22.5ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を吸引します。次に、ペレットを12.5ミリリットルのHBSSに再懸濁し、チューブを穏やかにボルテックスしてペレットを分解します。細胞とさらにHBSSを洗浄してボルテックスした後、各細胞懸濁液を1000ミクロンメッシュを介して新しい個々の50ミリリットルの円錐管に注ぎます。

次に、細胞懸濁液を再びスピンダウンした後、真空トラップを使用して、ペレットを乱さずにすべてのHBSSを慎重に吸引します。HBSSをすべて取り除いたら、各チューブに4.8ミリリットルの25%Fコール溶液を追加します。ペレットを分解するためにボルテックスした後、慎重に23%20.5%と11%fial溶液の23%20.5%と500ミリメートルリットルの円錐管を回転させるチューブの側面に沿って分配します。

FIコール溶液を遠心分離した後も均一な層状になるように、すべてのFIコールを新しい50ミリリットルの円錐管に注ぎ、外分泌組織のペレットが残るように注意します。氷のように冷たいHBSSを新しいチューブに50ミリリットルマークまで追加します。次に、チューブを4〜6回キャップして反転させます。

FI コールと HBSS を混在させる。バキュームトラップを使用して、緩いパレットを乱すことなく、HBSSフィアル混合物のほとんどを慎重に吸引します。次に、口蓋を新しいチューブに移します。

牧草地のピペットを使用して、アイレットをアイレット培養物が入ったペトリ皿に移します。ASINアートティッシュの破片が移らないように注意しているメディア。ペトリ皿をバックライト付きの解剖顕微鏡に置きます。

健康なアイレットは球形で、中心は黄金色から暗褐色になります。ASINやティッシュに接続されているアイレットは、くすんで灰色に見えるため、使用せず、廃棄してください。さらに、一晩のインキュベーション後に暗い壊死性中心を発達させる大きなアイレットは、適切に機能しないため、廃棄する必要があります。

アイレット調製物に大量の破片が含まれている場合は、アイレットを新鮮な培地に2回手摘みし、消化バッファーにDNAを添加してアイレットの凝集を抑制します。この手順は、アイレットをペトリ皿の中央に渦巻くことから始めます。P 20ピペットを使用して、アイレットを5ミリリットルのインキュベーション溶液が入った新しい15ミリメートル×60ミリメートルのポリスチレン製ペトリ皿に移し、アイレットからグルコースを含む培地を洗浄します。

次に、P 20ピペットを使用して、少なくとも13個のアイレットを、新たにガス化された1ミリリットルのクレブスリンガー重炭酸塩バッファーを含む個々のマイクロフージチューブに移し、チューブ間のアイレットサイズの一貫性を維持します。37の摂氏温度および5%CO2で45分の帽子のためのサンプルをインキュベートした後、すぐに渦を巻いて室温で卓上遠心分離機のフージ管を回し、7、000から7、500 Gs.Ifまでインスリンまたは別の代謝物が望ましい下流のアプリケーションである、マイクロフージ管の媒体のアリコートを集めるためにP 1000ピペットを使用して。刺激媒体が収集されていない場合は、廃棄される場合があります。

P 1000ピペットを使用して、各マイクロフージチューブ内のほとんどのクレブスを取り出し、アイレットペレットに約10〜15マイクロリットルのクレブスを残します。次に、P 20ピペットを使用して、ペレットに最も近い部分を取り外します。最後に、アイレットスナップに残っているクレブが10〜15マイクロリットル未満になったら、アイレットパレットを液体窒素で凍結します。

次に、スナップ冷凍ペレットを摂氏マイナス80度で、環状AMPが測定されるまで保管します。通常、薬剤が周期的なMP産生に与える影響は、インスリン分泌への影響と直接相関しています。この実験では、Wildtypeマウスまたは遺伝子ノックアウトマウスから単離されたアイレットを11.1ミリモルグルコースと細胞内サイクリックで刺激しました。

MP産生を測定し、全細胞タンパク質に正規化しました。分泌インスリンは、標準的なインスリンであるElizaを使用して測定され、さらに全細胞タンパク質に正規化されました。予想通り、周期的なA MP産生の変化は、グルコースの増強と直接相関していました 刺激されたインスリン分泌 ガソリン。

このビデオを見た後、培養物を分離し、健康なマウスアイレットの周期的なaおよびpレベルを測定できるようになるはずです。