Name: マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: 学ぶマウス膵島単離法と細胞内cAMP測定法。膵臓の膨張・摘出、遠心分離による膵島分離、酵素免疫測定法を用いてβ細胞機能を評価します。糖尿病研究における膵島生理学の理解に貢献します。

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我々は、この作品に記載されているプロトコルに関する専門技術的な支援のためにレニー·L. PaskerとHarpreet K. BRARに感謝したいと思います。さらに、我々は、私たちに時間を与え、その研究室のメンバーのサポートに加え、ウィスコンシン大学マディソン校のデューク大学とアラン·D·AttieでクリストファーB.ニューガードの指導を認識し最適化するために必要な支援を希望プロトコールを記載した。特に、我々は生産的な議論やアドバイスをAttie研究室でのニューガード研究所とメアリーRabagliaにおけるハンスHohmeier、Danhong呂、ヘレナウィンフィールドに感謝します。この作品は、NIHの助成金DK080845と若年性糖尿病594によってサポートされていました （MEK）の研究財団助成17-2011-608

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

糖尿病の有病率は世界人口の7.7％に影響を与えると予測して、新たな研究技術の必要性を理解し、糖尿病の18の治療の両方に不可欠である。現在の膵島単離は、in vitro実験のために使用される十分に確立されたプロトコルであり、若干の修正11,14,16と、以前に提示されてきた。インスリン分泌が孤立した島のための共通のダウンストリームアプリケーションであるが、このようなcAMPの上流の成分、に焦点を当て、インスリン産生および分泌を増強メカニズムを描く助けるかもしれない。 安楽死の選択は、実験動物の人道的な扱いだけでなく、実験測定の整合性の両方を確保するために思慮深くなされなければならない。それは前に膵臓への時間の最大量に対して酸素化血液が膵島灌流を可能にするように、膵島単離のために、麻酔下での放血安楽死のための私達の好ましい方法であるインフレ。 CO 2吸入は、それが人間的なプロトコルに従って実行されるかのように、手順を開始する前に、それは、少なくとも5〜6分間が不十分な酸素を血液に島を公開し、安楽死のた...

正常血糖の厳格な維持管理は、すべて制御されていない1型および2型糖尿病1の病態の特徴である、このような神経障害、腎症、および網膜症など合併症を予防することが不可欠です。 1型および2型糖尿病の両方において低減β-細胞機能及び質量は、血中グルコース濃度を摂動2。一方、インスリン産生β細胞、2型糖尿病におけるシグナル伝達が損なわβ細胞のインスリン分泌と末梢インスリンの壊滅的な損失から免疫介在1型糖尿病の結果は一緒に高血糖を促進し、脂質異常症、そして最終的には、その結果、肝臓のグルコース産生を増加個々のβ細胞3からβ細胞量およびインスリン分泌能力の喪失の両方。 1型および2型糖尿病の進行の根底にあるβ細胞のメカニズムを理解することは、うまくいけば、これらの病気を予防し、治療する新しい治療法を生じさせる。 インビトロ TI 中例えば、INS-1およびMIN6としてssue培養モデルは、β-不死化細胞株、特定のβ-細胞機能を理解するための有用なツールであることができる。しかしながら、膵島内の異なる細胞型間の相互作用は、それ自体、β-細胞機能を調節し得る。例えば、グルカゴンのパラクリン影響は（α-細胞から放出）およびインスリン分泌を増加させ、減少におけるソマトスタチン（δ-細胞から放出された）、それぞれ、内分泌応答し4のセル、セルの近接の重要性を示している。また、β-細胞間のギャップ結合は、インスリン5のリリースを増強する。ストライドが良い（ 例えば 、INS-1由来の13分の832及び3分の832細胞株）をグルコースに単離された膵島の生理学的応答をレプリケートインスリノーマ線を生成する際になされているが、さらに、それらのグルコース応答性は依然として正常ラットとは異なる小島6,7。さらに、これらのクローンインスリノーマ細胞系の応答グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）アゴニストは、互いに、ならびに正常膵島6から大幅に異なることができる。従って、不死化細胞株は、エージェントにcAMP産生に与える影響を分析するための最良のモデルを表していない場合があります。 インスリノーマ由来細胞株とは対照的に、全動物モ​​デルにおいてのみβ-細胞機能を研究する合併症の独自のセットを提供する。内分泌組織での作業中の最大の課題の1つは、リリースされホルモンの正確な濃度を測定している。具体的には、肝臓は、インスリンの代謝の主要な役割を果たし、膵臓血流は、肝臓へ直接進む。従って、血漿インスリン測定を正確膵臓自体またはインスリン分泌速度8上の異なる治療の影響から分泌されるインスリンの量を描くなくてもよい。さらに、グルカゴンの腎代謝は膵島α細胞からのグルカゴンの出力の信頼性を制限する可能性がある9。したがって、in vitroの実験のために、一次マウス膵島を単離する膵島は、生体内で行われた測定を補完するために特定の刺激に応答しているかをより正確に把握することができます。 マウス膵島を分離するために、本 ​​プロトコルは、（成功を高めるために役立つことが若干の修正を加えた）グループの数10,11で使用される十分に確立されたプロトコルです。また、cAMP産生の決定は、β細胞のインクレチン応答性の直接の読み出しが可能になります。 cAMPの測定、タンパク質含有量およびインスリン分泌に関連しても、β細胞機能に欠陥のcAMP 10に対して近位または遠位にあるかどうかを決定するのに役立つ、同一のcAMPサンプル調製から定量することができる。このプロトコルの最後のcAMP量およびインスリン分泌アプリケーションは、他の中で、医薬品や栄養成分の影響を理解するための非常に強力なツールになりますS、cAMPおよびインスリン分泌に対する。グルコースのみからの刺激に加えて、他の化合物は、cAMPおよびインスリン分泌10,11の変化を測定するために使用することができる。 インスリンは、我々は孤立した島、グルカゴンおよびソマトスタチンのような他のホルモン、だけでなく、サイトカイン、エイコサノイド、および環状アデノシン一リン酸から検定する主要なホルモンであるが、最終的には、過渡刺激アッセイにより、またはの定量化のいずれかによって測定することができる培養液12中のそれらのレベル。他の多くの下流のアプリケーションが、膵島移植、PCRまたはマイクロアレイ分析、定量的リアルタイムためのRNAの単離、タンパク質として、追求され得るように、最終的に、記載コラゲナーゼ単離方法では、本稿の範囲外の膵島単離膵島の保存を可能にするもののウェスタンブロッティング、膵島埋め込み、免疫蛍光イメージング、膵島細胞REPLIの尺度としての[3 H] - チミジン取り込みの分離以前のJoveの記事13〜16に記載されており、そのうちのいくつかの陽イオン、。全体的に、プロトコルに記載膵島単離方法を次の治療法を開発し、β細胞の機能を高めることを目的とした薬剤の発見を促進するための重要かつ有用な情報を研究者に提供することができる。

<table><tbody><tr><td>活性膵島の単離に適した Clostridium histolyticum からのコラゲナーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9378</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution 10X</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (粉末)</td><td>Invitrogen(ギブコ)</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>牛血清からのアルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7888</td><td></td></tr><tr><td>3/0 シルク縫合糸</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>18020-30</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>0.8 mm 鉗子&nbsp;&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>湾曲はさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml;bingen スプリングはさみ - ストレート/シャープ/8.5 cm/5 mm カッティングエッジ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>解剖はさみ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>5 ml BD ルアーロック シリンジ</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>1 ml BD シリンジ</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>30 G BD 針 1/2" 長さ</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>27 G BD 針 1/2"長さ</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>砥石</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>2-2-2-トリブロモエタノール</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>2-メチル-2-ブタノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>240486-100mL</td><td></td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム(NaCl)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>S9888塩化</td><td></td></tr><tr><td>カリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P3911</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>一カリウム(KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム(NaCHO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#183;2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&#183;7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>熱不活化ウシ胎児血清 (H.I. FBS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SH30088.03HI</td><td></td></tr><tr><td>3-イソブチル-1-メチルキサンチン (IBMX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5879-100MG</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス膵島の単離と細胞内camp測定法

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

制御されていない血糖は糖尿病の特徴であると神経障害、腎症、網膜症などの合併症とを促進する。糖尿病、免疫介在性の両方のタイプ1と肥満-結合型2の有病率の増加とともに、糖尿病の病態生理と治療メカニズムの輪郭を描くことを目的とした研究は極めて重要である。膵臓のランゲルハンス島のβ細胞は、適当に上昇した血中グルコース濃度に応答してインスリンを分泌する責任がある。グルコースなどの栄養素に加えて、β-細胞は、（特定のホルモンによって刺激され、食事に応答して腸から分泌されるインクレチンと称される、細胞内環状アデノシン一リン酸の産生を増加させるβ-細胞受容体に作用しているcAMP）の。 2型糖尿病の病態生理に寄与することがよく理解され、また、ますますw iをリンクされているβ-細胞機能、質量、およびインクレチン応答性の低下第1型糖尿病。現在のマウスの膵島分離とcAMP測定プロトコルは、疾患の進行および治療的介入、細胞内cAMP産生の調節を介して作用する受容体をインクレチン受容体によって媒介されるかまたは関連していることを特にを促進メカニズムを描写するのに役立つツールとなります。唯一のcAMP測定は説明するが、説明した膵島単離プロトコールはまた、グルコースを含む他の多くの下 ​​流の適用を可能にするクリーンな製剤を作成し、インスリン分泌を刺激し、[3 H] -チミジン取り込み、タンパク質存在量及びmRNA発現。

単離の間、高膵島収量を確保するために、プロトコルに概要の外科技術は、密接に従うべきである。ここで紹介するテクニックは、各研究室に合わせて調整することになるが、成功した分離につながるいくつかの重要なステップがあります。総胆管は簡単にアクセスできるようにするためには、臓器をマウスの右側（ 図1）に変位することをお勧めします。さらに、この拡張を制限する小さな重みが存在するので、膵臓は抵抗の少ない量で膨張することを可能にする。膵島収量を最大化するために、別の重要なステップは、オッディ括約筋（ 図2A-C）に近い総胆管結紮である。さらに離れるオッディ括約筋からライゲートする主要な膵管に入るコラゲナーゼ溶液の量を減少させることによって、部分的膨張をもたらし得る。また、ピンと張った結び目は、腸に入るのコラゲナーゼ溶液を防ぐことができます。 &lt;Pクラスは、= &quot;jove_content&quot;&gt;総胆管への適切な切開を離れて、肝臓からの分岐点が、最大膵臓インフレのために十分に近い（ 図3）から十分に配置する必要がありま...

ランゲルハンス単離したマウスの膵島を用いたin vitroβ細胞機能をアッセイすることは、糖尿病の病態と治療薬の研究に重要な要素である。多くの下流のアプリケーションが利用可能であるが、このプロトコルは、具体的にはβ細胞機能を決定する本質的なパラメータとして、細胞内サイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）の測定を記載する。

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

この手順の全体的な目的は、さまざまな実験的処置に対するcyclic AMP産生の差を測定するために、健全なアイレットを単離することである。まず膵臓を膨張させ、次に摘出することでこれを達成する。その後、一連の遠心分離と洗浄を通じて、健全なアイレットを単離する。次に、生存しているアイレットを新鮮なアイレット培養培地に移し、一晩インキュベートします。最終ステップでは、アイレットを目的の実験処理にさらし、cyclic AMPアッセイを行います。最終的に、酵素免疫測定法を用いて、アイレットに適用したさまざまな処理に対するcyclic AMP産生の変化を測定します。一般的に、この方法に不慣れな人は、膵臓を完全に膨張させるために多くの練習が必要となるため、苦労することがあります。まず、シリンジとカニューレに5 mLのコラゲナーゼ溶液を充填します。鈍化した30ゲージの針をカニューレに取り付け、シリンジとカニューレを氷上に置きます。マウスの小腸を右側に寄せた後、総胆管の末端にあり、小腸に向かって広がり白い三角形を形成しているオディ管括約筋を探します。括約筋が見つかったら、Dumont 5番ピンセットを用い、胆管を穿孔しないよう注意しながら、ピンセットの先端を総胆管の下に、可能な限り小腸に近い位置まで滑り込ませます。小腸と結合組織を貫通させた後、デュモンピンセットの先端を使用して縫合糸を掴み、総胆管の下へ引き込みます。漏出を防ぐため、結び目がしっかり締まっていることを確認しながら、オディ {span data-jove-entity="sphincter of OD"} の可能な限り近くで総胆管を結紮します。次に、縫合糸の両端を掴み、尾側に向かって引っ張ることで総胆管に一定の張りをかけます。次に、空いた手で、共通胆管の肝臓への最終分岐点の直上の部分を、マイクロ scissors で小さく切開します。その際、糸の両端を持って共通胆管をピンと張った状態にしてください。氷バケツからシリンジとカニューレを取り出します。シリンジを置き、準備した先端を鈍らせた 30 gauge 針を切開部に挿入します。総胆管。管壁を貫通させないように注意します。膵臓を十分に膨らませることが最も難しい点です。密閉性の高いニードルを使用します。最初のニードルで十分な密閉が得られない場合は、27ゲージなどのより太いニードルを使用してください。次に、膵臓の最初の部分が膨らむまで、シリンジのプランジャーをゆっくりと押し下げ、脈動的に圧力を解放します。その後、膵臓が膨らまなくなるまで、緩やかで一定の圧力をかけます。正常に膨張した場合、外分泌組織が均等に分布し、胃の上部にある膵臓部分が膨らみます。膵臓を取り出すには、片手のピンセットでオディ直腸括約筋付近の小腸を把持します。もう一方の手で、閉じた状態の曲がり鋏の先端を挿入し、膵臓の一部を小腸から分離します。鋏の先端を小腸に沿って、ピンク色の結合組織まで移動させます。次に、胃との接合部付近の小腸を持ち上げ、膵臓を小腸の残りの部分から切り離します。膵臓を可能な限り多く把持し、ゆっくりと持ち上げます。曲弯したハサミを用いて、膵臓と胸腔との間の残りの接続部位を切断します。膵臓を完全に摘出するため、摘出した各膵臓を約2.5 millilitersのコラゲナーゼ溶液に保存します。膵臓を洗浄するために、氷上に個別の50 milliliterコニカルチューブを用意します。まず、各膵臓を25 millilitersのコラゲナーゼを含む新しい50 milliliterコニカルチューブに移します。次に、膵臓を入れた50 mLコニカルチューブを、37 °Cの振盪水槽に直立させて設置します。この水槽は220～250 RPMで振動可能なものを使用し、シェーカーはオフにした状態にします。続いて、各50 mLコニカルチューブに95%酸素および5%二酸化炭素を5分間通気します。パスチャーピペットを用い、各チューブのキャップをしっかりと締め、振盪恒温水槽の水面下に横向きに配置します。6分目から開始し、16分目まで、1分おきに20秒間、220～250 RPMでチューブを振盪させます。振盪後、チューブを室温で400～500 Gsで遠心分離し、最大速度に達した直後に遠心機を停止させます。次に、ペレットを乱さないように注意しながら、バキュームトラップを用いて各チューブからコラゲナーゼ溶液を約22.5 milliliters吸引します。その後、ペレットを12.5 milliliterのHBSSで再懸濁し、チューブを穏やかにボルテックスしてペレットを分散させます。細胞の洗浄とボルテックスを行い、さらにHBSSを加えた後、各細胞懸濁液を1000 micronメッシュでろ過し、新しい個別の50 milliliterコニカルチューブに回収します。その後、細胞懸濁液を再度遠心分離し、真空トラップを用いて、ペレットを乱さないように注意しながらHBSSをすべて吸引します。HBSSをすべて除去したら、各チューブに25%F call solutionを4.8 milliliters加えます。ボルテックスでペレットを解きほぐした後、50 milliliterコニカルチューブを回転させながら、チューブの壁面に沿って23%20.5%および11%fial solutionを2.4 millilitersずつ慎重に分注します。FIコール溶液を遠心分離した後、層が均一になるように、外分泌組織のペレットが残るように注意しながら、すべてのFIコールを新しい50 milliliterコニカルチューブに分注します。新しいチューブに、50 milliliterの標線まで氷冷したHBSSを加えます。その後、キャップをしてチューブを4〜6回転倒混和します。FI callとHBSSを混合させます。バキュームトラップを使用して、緩いペレットを乱さないように注意しながら、HBSS混合液の大部分を慎重に吸引します。その後、ペレットを新しいチューブに移します。パスツールピペットを使用して、アイレットをアイレット培養液を含むペトリ皿に移します。この際、ASIN artの組織破片が混入しないように注意してください。ペトリ皿をバックライト付きの解剖顕微鏡に設置します。健康なアイレットは球形で、中心部がゴールデンブラウンからダークブラウンの色をしています。ASINや組織に付着しており、色がくすみ灰色に見えるアイレットは使用せず、廃棄してください。さらに、一晩のインキュベーション後に中心部に暗色の壊死が見られる大きなアイレットは、適切に機能しないため廃棄してください。アイレットの調製物に大量のデブリが含まれている場合は、新鮮な培地へ2回手作業でアイレットを移し、凝集を抑制するために消化緩衝液にDNAを添加します。まず、ペトリ皿の中央にアイレットが集まるように軽く回します。P 20ピペットを使用し、アイレットを5 mLのプレインキュベーション溶液が入った新しい15 mm × 60 mmポリスチレン製ペトリ皿に移し、アイレットからグルコース含有培養基を洗浄します。次に、P 20ピペットを用いて、新鮮なガス充填済みのKrebs ringer bicarbonate buffer 1 mLが入った個別のマイクロ遠心チューブに、アイレットを少なくとも13個分移します。その際、チューブ間でアイレットのサイズに一貫性を持たせてください。サンプルを37 °C、5% CO2で45分間インキュベートした後、チューブに蓋をし、迅速にボルテックスし、卓上遠心機を用いて室温で7,000から7,500 Gsまで遠心分離します。インスリンやその他の代謝物の後続解析を目的とする場合は、P 1000ピペットを用いて培地の一部をマイクロ遠心チューブに回収します。刺激培地の回収が不要な場合は、廃棄しても構いません。P 1000 ピペットを使用して、各マイクロ遠心チューブ内の Krebs 液の大部分を除去し、アイレットペレット上に約 10 ～ 15 µL の Krebs 液が残るようにします。次に、P 20 ピペットを用いてペレットに最も近い部分を除去します。最後に、アイレット上の Krebs 液が 10 ～ 15 µL 未満になったら、アイレットペレットを液体窒素で急速冷凍します。その後、cAMPを測定するまで、スナップ凍結したペレットを-80°Cで保存します。通常、薬剤がcAMP産生に及ぼす影響は、インスリン分泌への影響と直接的に相関します。本実験では、野生型または遺伝子ノックアウトマウスから単離した膵島を11.1 mMのグルコースで刺激し、細胞内サイクリックcAMP産生量を測定し、総細胞タンパク質量で標準化した。分泌インスリン量は標準的なインスリンELISA法を用いて測定し、同様に総細胞タンパク質量で標準化した。予想通り、cAMP産生量の変化は、グルコース刺激性インスリン分泌の増強と直接的に相関していた。このビデオを視聴することで、健康なマウスの眼球から培養細胞を単離し、cyclic aおよびpのレベルを測定できるようになります。

a-method-for-mouse-pancreatic-islet-isolation-intracellular-camp

Research

JoVE Journal

Biology

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学ぶマウス膵島単離法と細胞内cAMP測定法。膵臓の膨張・摘出、遠心分離による膵島分離、酵素免疫測定法を用いてβ細胞機能を評価します。糖尿病研究における膵島生理学の理解に貢献します。

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

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