組織工学のための二軸メカニカルローディングバイオリアクターの設計

本実験の全体的な目的は、移植用の機能的な組織工学バイオ複合体を作製することです。これは、3次元バイオ材料複合体中の細胞に生物物理学的刺激を与えるため、精密な一軸または二軸の機械的歪みを負荷することで達成されます。第二のステップとして、バイオリアクターにロードセルを装備し、負荷中のバイオ複合体の力フィードバックおよび機械的試験を可能にします。

次に、バイオ複合体を数週間にわたって培養し、構成物の生化学的成分と強度にマクロスケールの変化を誘導します。その結果、グリコサミノグリカンおよびコラーゲン含有量、スキャフォールドの厚さ、および平衡弾性率の有意な差に基づき、異なる種類の負荷の影響が示されます。この手法は、工学的軟骨組織に対する二軸負荷の影響に関する知見を提供できますが、骨や腱などの他の低荷重組織にも適用可能です。本手順の実演は、当研究室のAmy MayとRob Stefaniが行います。まず、ここに示すように二軸バイオリアクターをセットアップしてください。

バイオリアクターのベースは、25 cm × 30 cm × 12.5 mmのアルミニウムプレートで構成されています。可変の位置調整オプションにより、異なる形状やサイズの組織培養プレートを柔軟に取り付けることが可能です。次に、水平ステージがx軸方向にのみ振動して動的なせん断力を提供するように、ベースにステージを取り付けてください。

垂直ステージは、Z軸方向にのみ振動させることで動的圧縮を与えます。次のステップは、カスタムのポリスルホン製ローディングプレートを作製することです。ポリスルホン素材は、生体適合性が高く、切削加工や滅菌が容易であるため、この用途に最適です。

精密加工された直角ブラケットを用いて、プレートと2軸移動プラットフォームを結合します。ベースプレートに取り付けられたキネマティックストップには微調整ネジが備わっており、手作業では不可能な培養プレートの精密なアライメントが可能です。次に、各プラットフォームにステッピングモーターアクチュエータを取り付けます。これにより、ソフトウェア用の位置フィードバックが取得されます。

ここに示すステッピングモーターアクチュエータは、0.1 µmの双方向繰り返し精度と20 nmの分解能を備えており、50 mmの移動範囲にわたって3 µm未満の精度を実現しています。Thor Labs社の高度なポジショニング技術ソフトウェアを使用して、ステージの動作を制御します。このソフトウェアでステッピングモーターを制御し、せん断および圧縮の両方の負荷パラメータである周波数と振幅を、独立かつ同時に調整します。次に、小型の5ポンドロードセルを負荷プラチナと可動プラットフォームの間に配置し、プラチナと構築物の接触検出および負荷応答の評価に必要なフォースフィードバックを確保します。

ロードセルの精度がフルスケールの0.15%から0.25%の高精度であること、およびロードセルのディスプレイユニットにコンピュータでのデータ収集が可能なRS 2 32ポートが備わっていることを確認してください。24ウェルプレートのウェル内でサンプルを固定するために、1.5 millimeterのスペーサーを備えたゲルキャスティングシステムを用いて、厚さ1.5 millimeterのアガロースゲルの型を準備します。組み立て後、2枚のガラスプレートの間に4%アガロース溶液を注ぎ、混合液を冷却させます。

次に、トッププレートを取り外し、アグロスラブから直径16 mmのディスクを打ち抜きます。各ディスクの各ウェルサンプルについて、サンプルを配置するための穴を開けます。完成したディスクを24ウェルプレートの各ウェルに配置します。

次に、厚さ2.25 millimeter、直径5 millimeterの組織構築物を各ゲルホルダーに押し込みます。サンプルが各エアロスホルダーの上端から突き出ている状態にしてください。続いて、各ウェルに1.5 millilitersの培地を加え、カバーを戻します。

その後、サンプルをロードするまでプレートをインキュベーターに戻します。組織構築物の機械的負荷を開始するには、アルミニウムプレートをロードセルに固定し、常に垂直ステージに滅菌済みのプラチンアセンブリを取り付けてください。機器の故障を防ぐため、インキュベーターは低湿度条件下で運転してください。

次に、ステッピングモーターコントローラーとPCの電源を入れます。高度ポジショニング技術（advanced positioning technology）のユーザープログラムを開き、両方の画面でグラフィカルコントロールタブを表示します。ホームゼロボタンを押し、両方のステッピングモーターを、最上部かつ右端として定義されているゼロ位置に移動させます。

メカニカルローディング中のオーバーフローを防ぐため、各ウェルから培地を一部除去し、サンプルのロード準備を行います。次に、24ウェルプレートをバイオリアクターに設置し、4つの調整可能なキネマティックロケーターを使用して、プレートをプラテンに慎重に合わせます。このとき、プレートが正しく整列していることを確認してください。グラフィカルコントロールタブで、バイオリアクターベースの前方と面合わせにします。

手動で微調整します。位置ボックスをクリックして水平方向に移動させ、アライメントを調整してください。プレートがプレートのウェルと一致したら、サンプルに最初に接触するまでプレートを下げ始めます。

開始位置に到達したら、「move sequencer」タブに移動し、[load]を押して目的の移動シーケンスを読み込むか、このビデオに付随するテキストプロトコルに従って独自のプログラムを作成してください。次に、[run]を押してプログラムを開始します。ソフトウェアがモーターを制御し、サンプルに目的のコンディショニングレジメンを適用します。

プログラムが終了したら、プレートを手動で持ち上げ、組織培養プレートの上端から離します。次に、24ウェルプレートをバイオリアクターから取り出し、培地を交換します。最後に、ロードセルからプラチナを慎重に取り外し、機器の電源を切ります。

本ビデオで説明した二軸バイオリアクターの使用は、組織工学構築物内の細胞によって分泌されるグリコサミノグリカンおよびコラーゲンの量に大きな影響を及ぼしました。コンディショニングは、10%の圧縮歪みおよび5%の剪断歪みを1 Hzで、1日3時間、週5日実施しました。30日間の培養後、二軸負荷にさらされた軟骨細胞によって分泌されたグリコサミノグリカンおよびコラーゲンの量は、対照群のサンプルよりも有意に高い値を示しました。一方、一軸負荷ではグリコサミノグリカンの量のみが有意に増加しました。

さらに、二軸性負荷によって構築物はより厚くなりましたが、構築物の弾性に影響は見られませんでした。この投与プロトコールに従い、30日間のコンディショニングと培養後、組織構築物の横断面を、サフランブルーやII型コラーゲンなどの代表的な軟骨マーカーで染色しました。3つの異なるグループは、コンディショニングなし、一軸性負荷、および二軸性負荷です。

すべての群でアリシアンブルーおよびサフラニンOによる陽性染色が認められましたが、二軸負荷をかけたサンプルでは、無負荷および一軸負荷のサンプルと比較して、II型コラーゲンの量が増加していることがわかります。このビデオを視聴することで、組織工学的に作製した構築物の成長過程において、一軸または二軸負荷を適用する方法について十分に理解できたはずです。