Name: 組織工学のための二軸メカニカルローディングバイオリアクターの設計 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学ぶ二軸メカニカルローディングバイオリアクターの設計と操作方法。軟骨バイオコンポジットへの機械的ひずみ負荷により、細胞の生化学的応答と組織強度を向上させる組織工学手法を解説します。

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この作品は、研究開発、RR＆Dサービス、退役軍人の米国エネルギー省、NIH COBRE 1P20RR024484、NIH K24 AR02128と防衛W81XWH-10-1から0643の部門のオフィスによってサポートされていました。

1。二軸ロードバイオリアクターの設計<ol><li>バイオリアクターは、偉大な負荷用量の精度（振幅と周波数）と多種多様のアプリケーションを使用して、設計された組織への一軸又は二軸の機械的ひずみを適用するための精密誘導レーザーアプリケーション用のトール·ラボ（ニュートン、マサチューセッツ州）製の二つの段階を採用単一の24ウェルプレート（ 図1）組織培養条件。 </li><li>二軸荷重は2 TravelMax段階（LNR50SE）によって達成される。これらのステージは、XZ構成で直角に取り付けられている。水平ステージは、X軸に沿って振動させることにより、動的せん断動きを提供します。縦のステージはZ軸に沿って振動することによって、動的圧縮荷重を提供しています。これらの段階は、50ミリメートル移動範囲を有し、マイクロステップ機能を備えた閉ループステッピングモータドライバ（BSC102）によって制御されるステッピングモータアクチュエータ（DRV014）によって独立に駆動され、より小さいステップサイズを可能にする50nmである。 </li><li>装置は、剛性25センチメートルに装着され×30メートル×12.5機械の部品組立のためのプラットフォームとして組織培養プレートを装着するために使用されるミリメートルのアルミベースプレート。調整可能なストップは、キネマティックアルミニウム基板上に所定の位置に組織培養プレートをロックするために使用される。これらの運動が停止し、そうでなければ手では達成できない正確な位置合わせを可能にするために、微調整ネジを持っている。ベースプレートのモジュール設計は、異なるサイズおよび形状（ペトリ皿対マルチウェルプレート）のプレートを収容するためにこれらの運動学的ストップの柔軟な配置を可能にする。 </li><li>カスタム加工ポリスルホンロードプラテンは、精密機械加工直角ブラケットを介して二軸移動プラットフォームに接続されている。ポリスルホン材料は、その生体適合性により、加工のしやすさ、および滅菌を容易にするために選ばれた。 </li><li>ステージの動きはトール·ラボ[詳細ポジショニング技術（APT）は、ソフトウェアによって制御されます。ステッピングモータドライバは、私たちです。独立かつ同時に周波数及び剪断及び圧縮の両方の振幅の負荷パラメータの調整を可能にするソフトウェアとの組み合わせオピニオン。 </li><li>位置フィードバックは、各移動架台に取り付けられ、ソフトウェアと統合されている非線形光学エンコーダによって提供される。エンコーダシステムは、旅行の完全な50ミリメートル以上3μm未満の位置精度に翻訳し、0.1μmの双方向再現性と20nmの解像度を持っています。これらのエンコーダは、真のナノ位置決め機能を確保するために、ドライブ·エレクトロニクスと絶対位置を直接読み出しに必要な位置フィードバックを提供します。 </li><li>プラテンと試料間の接触を検出するために必要な力フィードバックを提供し、ローディング応答、ローディングプラテンと可動プラットフォーム（ 図2）との間に配置される精度ミニチュアロードセル（ハネウェルモデル31）に評価するためである。ロードセルは、高い精度を有する0.15％〜0.25％フルスケール。ロードセルする表示部（SC500）は、小数点以下5桁までの荷重測定を提供することができる。さらに、コンピュータ上でデータ収集を可能にするためにRS-232ポートを有している。 </li></ol> 2。細胞播種アガロースコンストラクト<ol><li> 4％アガロースを準備：50ミリリットルのフラスコに、沸騰してから70に留めておく°使用するまでCのオーブンで20ミリリットルDMEM（無添加）に0.8グラムアガロースを追加。 </li><li>所望の細胞播種密度の二重量のための細胞懸濁液の量を調整します。この懸濁液は、所望の播種密度で2％アガロースゲルを作成するために4％w / vのアガロースの等量混合する。 </li><li>インキュベーター内で細胞懸濁液と1つの10ミリリットルピペットの両方を配置します。 </li><li>ゲルキャスティングシステムを設定します。 One 1.5ミリメートルと1 0.75ミリメートルスペーサープレートが2.25ミリメートルの厚さのゲルを作成するために一緒に配置する必要があります。他のサイズのスペーサプレートは、異なる厚さのゲルを作成するために使用することができる。ゲルキャストシステムは、これらのプレートtogetを保持するのに十分な大きさではない彼女には、ので、それらは確実に漏れを防ぐためにテープで固定しなければならない。 </li><li>次のステップは、アガロースが固化する前に迅速にゲルモールドに予め用意アガロースとピペットを用いて細胞懸濁液を混合することである。オーブンから液体アガロースを取り外し、中の滅菌温度計を配置。アガロースは°C細胞と混合する前に42-43に冷却しなければなりません。 37℃に細胞懸濁液を温めるアガロースが43に当たったら℃、迅速に所望の量をピペットで、その後すぐにミックスするには、上下に数回の細胞懸濁液をピペット。その後、直ちにゲル型に混合物全体をピペット。 </li><li>ゲルは10〜15分間固化した後、慎重に水平位置に傾けることができます。 </li><li>トップガラス板と生検パンチとパンチディスクを削除します。ディスクは小さな滅菌スパチュラでピックアップすることができます。我々の経験では、9ミリリットルゲルが百以上の5 mmの直径のディスクを作るのに十分な大きさでした。 </li></ol> 3。文化ディスク</p&gt; <ol><li> 24ウェル非組織培養処理プレートの各ウェルに置きつのディスクを。 </li><li>各ウェルに無血清軟骨分化培地2mlを加える。 </li><li> （37℃、5％CO 2）インキュベーターにプレートを置く。 </li><li>メディアの変更については、1ミリリットル当たりよく2〜3日ごとに交換してください。 </li></ol> 4。機械的負荷のためのサンプルの固定化<ol><li> 4％アガロース（無細胞懸濁液を添加していない）を準備し、ゲルは、サンプル自身（ロード時の干渉を防ぐために）よりも薄くする必要があります。推奨厚さは1.5〜1.9ミリメートル（339 mm厚のサンプルのため）です。 </li><li>かつて24ウェルプレート用ポンチ直径16mmディスクは、ゲル化した。必要に応じて各ディスクには、サンプルのためのパンチ1 5ミリメートル穴をインチ配置される、メディアの変化の間に配置されるピペットのディスクの端に別の5ミリメートルの穴を開ける。 </li><li> 図3に示すように、一度アガロースウェルを、24ウェルプレート内の場所なされている。 </li><li>アガロースW一度エルボは、24ウェルプレートにあり、各ウェルにサンプルを圧入。サンプルはアガロース井戸の上部から突出する必要があります。 </li></ol> 5。機械的荷重<ol><li>プラテンします（ 図2）滅菌する。 </li><li>セルをロードするためにアルミ板を固定します。セキュアプラテン/ステージにロードセル/アルミニウムプレートアセンブリをロードする。 </li><li>ステッピングモータコントローラ（背面のスイッチ）をオンにします。 </li><li> PCとオープン&quot;APTユーザー&quot;プログラム（ 図4）をオンにします。 <ol><li>左の画面は、水平ステッピングモータを制御する。右の画面は縦のステッピングモータを制御する。各画面では、 &quot;グラフィックコントロール&quot;タブでは、手動位置を可能にし、 &quot;移動シーケンサ&quot;タブでは、自動化が可能になります。すべてのユニットはミリです。 </li></ol></li><li>両方の画面の &quot;グラフィックコントロール&quot;タブに移動し、 &quot;ホーム/ゼロ&quot;ボタンを押してください。両方のステッピングモータは50mmの範囲を有する。 &quot;ホーム/ゼロ&quot;を押すと、ゼロ位置（トップと一番右の位置）にステッピングモーターの両方を送信します。 </li><li>た準備各ウェルから一部のメディアを除去することにより、ロードするための24ウェルプレートでの電子のサンプル。メディアのこれ以上より1 mlをロード中にオーバーフローを防ぐために、各ウェルに残しておく必要があります。十分なメディアがサンプルをカバー保つために十分に残されていることを確認してください。 <ol><li>インキュベーターは、機器の故障を防ぐために、低湿度条件に保持されることに留意されたい。 </li></ol></li><li>場所24ウェルプレートバイオリアクターで、慎重にプラテンに並ぶ。 <ol><li>プレートは、4つの調整可能な運動ロケータを使用してバイオリアクターに固定されている。それが簡単にプラテンを整列できるようにするため、左側の2つのロケータが事前に配置されている。プレートが安全であるように、右側の2つのロケータを締めます。バイオリアクターベースの前面とアップフラッシュプレートを並べるようにしてください。 </li><li> &quot;グラフィックコントロール&quot;タブでは、特定のステッピングモーターの位置を手動で位置ボックスをクリックして入力することができます。ゆっくりプラテンを下げ、プレートと並ぶように水平方向に移動するには、この機能を使用します。 </li> &lt;/ OL&gt; </li><li>プラテン、サンプルに接触に近くなると、非常に遅く単位でプラテンをダウンさせるために開始（0.1mm）をあなたが所定の開始位置に到達するまで（パート6を参照）。 </li><li>開始位置に到達すると、タブ &quot;シーケンサを移動&quot;を押すことにより、所望の移動シーケンスをロードするために行く &quot;ロード&quot;をその後、開始するには、 &quot;ファイル名を指定して実行&quot;を押します。 （ 図5）パート7を参照してください。投与プロトコルを記述する。 </li><li>ロードが完了したら、手動でプラテンを上げる。任意のサンプルがプラテンに立ち往生している場合は、慎重に滅菌スパチュラを用いてよく、適切にそれらを戻す。 </li><li>バイオリアクターからの24ウェルプレートを取り外し、メディアを交換してください。 </li><li>慎重にロードセルからプラテンを削除してから、楽器をオフにします。 </li></ol> 6。キャリブレーションの読み込みプラテン適切な株はサンプルに適用されるようにするには、各プラテンは慎重に実験を開始する前に校正する必要があります。 <ol><l私は&gt; 5.8に手順5.1を実行してください。 </li><li>手動で25ミリメートルの位置に水平ステッピングモータを置く。 </li><li>それはちょうどかろうじてバイオリアクターの底に接触して慎重に下プラテン来るまで。ロードセルは、この時点で増加した負荷を示す。縦のステッピングモータ（すべての圧縮ひずみ測定は、この値から計算されるように、できるだけ正確に）の正確な位置に注意してください。 </li><li>位置を記録。この値は、試料の寸法と所望の菌株をもとにして投与プロトコルを書き込むために使用される。 </li></ol> 7。投薬プロトコルを書く<ol><li>バイオリアクターは、同時にまたは個別に、圧縮及びせん断ひずみの両方を適用することができる。風袋圧縮ひずみ、動的ひずみ振幅、周波数をロードする：3つの主要なパラメータが決定しなければなりません。 </li><li>風袋株は試料からプラテンのリフトオフを防止するために適用される。 </li><li>サンプルの動的ひずみ振幅と周波数荷重周波数が選択されています。 </li></ol>本研究では、次のように圧縮とせん断ひずみを定義します。 <img alt="式（1）" fo:content-width="3.26in" fo:src="/files/ftp_upload/50387/50387eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50387/50387eq1.jpg" />例えば二軸投与·プロトコル 試料の厚さ：2.25ミリメートル 風袋ひずみ（圧縮）：試料の厚さの10％（0.225ミリメートル） 動的なひずみ振幅（圧縮）：10％（+ / - 試料の厚さの5％） 周波数（コンプレッション）：1 Hzの 動的なひずみ振幅（せん断）：試料の厚さの25％（0.5625ミリメートル）：せん断応力は 水平に移動するプラテンにより試料に適用。 周波数（せん断）：0.5 Hzの 典型的な投与プロトコルは、一日あたりのローディング3時間である。 この例では、動的および剪断荷重を同時にではなく順次に印加される。私たちは、このパターン良いMIMを信じる人間の膝でICS複雑なローディング環境。 <ol start="4"><li>投与プロトコルが選択されると、圧縮移動シーケンスプログラムが書き込まれなければならない。 </li><li>移動シーケンスは、ステッピングモータは、指定の加速度と最大速度でに移動することを位置のリスト、のように聞こえるかを正確です。 </li><li>プロトコルとプラテンの校正値（パート6から）投薬に基づいて、所望の垂直位置を計算します。 </li><li>プラテン1のサンプル計算は、以下に提供されています： </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 校正値との差 </td><td> 垂直位置 </td></tr><tr><td>プラテン校正値（バイオリアクターのタッチボトム） </td><td> 0ミリメートル</td><td> 29.7700ミリメートル</td></tr><tr><td>プラテンは、サンプルと接触（339ミリメートルサンプル）になります</td><td> 4.4140ミリメートル</td><td> 25.3560ミリメートル</td></tr><tr><td>セント雨（5％厚さ） </td><td> 4.3015ミリメートル</td><td> 25.4705ミリメートル</td></tr><tr><td>株（10％厚さ） </td><td> 4.1890ミリメートル</td><td> 25.5810ミリメートル</td></tr><tr><td>歪み（15％厚さ） </td><td> 4.0765ミリメートル</td><td> 25.6955ミリメートル</td></tr></tbody></table><ol start="8"><li>一度位置が正しい周波数を得るために、加速と最大速度値を持つ実験を計算されます。サイクル数は、（1 Hzで3時間、例えば 10,800サイクル）に応じて、選択されるべきである。 </li><li>例動的圧縮移動シーケンスプログラム（10％風袋圧縮、10％のダイナミックひずみ振幅、1Hz）で（ 図5） </li><li>動的剪断移動シーケンスプログラム：サイクルの数は、所望の周波数および持続時間（0.5 Hzで3時間、例えば 5,400サイクル）に従って選択されるべきである。 </li><li>例動的剪断移動シーケンスプログラム（10％風袋圧縮、0.5625ミリメートル（厚さの25％）は、動的せん断ひずみ振幅、0.5Hz）を（ 図5）。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益がないことを宣言します。

私たちは、移植のために製造された組織工学構造物に一軸又は二軸の機械的な歪みを加えることが可能なローディング装置を設計しました。デバイスは、天然組織の前に又は他の治療後の機械的特性を記述するために設計されたバイオ複合材料のin vitro培養用のバイオリアクターとして、または検査装置として用いることができる。デバイス被験者は24ウェルプレートへの単一の大きな負荷用量の精度（振幅と周波数）と組織培養条件の多種多様なアプリケーションとの二軸機械的負荷に組織構造を設計。 せん断荷重のアプリケーションは、このシステムの設計のための固有の課題の組を提示した。栄養素伝達を最大にするために、構築物は、最初に24ウェルプレートの各ウェル内に閉じ込められた。風袋圧縮歪があること被保険者として、これは、動的圧縮のために問題を提示しませんでしたサンプルプラテン接触が失われていませんでした。せん断ひずみがプロトコルに追加されたとき、しかし、一軸サンプルはプレートの底に沿ってスライドとプラテンといくつかの失わ接触。さらに、軸荷重プロトコールサンプル中に一貫性のないロードを引き起こして、裏返し...

私たちは、移植のために製造されたバイオ複合材料工学組織に一軸又は二軸の機械的な歪みを加えることが可能なローディングバイオリアクターを設計しました。この装置は、主に関節軟骨のために設計された代替のためのバイオリアクターとして設計され、それはまた、人体の他の耐荷重組織を使用することができる。このバイオリアクター設計の私たちのモチベーションは、動きの欠如に起因する麻痺ニワトリ胚における関節軟骨の異常形成の精液の観察を行ったDrachmanとソコロフ1、に由来する。同様に、物理的な運動は、通常の筋肉と骨の開発に不可欠である。この考え方に沿って、多くの研究グループは、in vitro培養中に物理的刺激の方法の異なるモードを調べた細胞バイオ複合生体材料および組織外植片2-7の生化学的および機械的特性を調節する。機能的な組織工学の概念組織の機能的特性を向上させ、機械的刺激のインビトロでの使用に伴い、 インビボ応力と歪み8,9 に耐えることが予想される組織を有効にする機械的特性、即ち 。多くの研究では、関節の関節のために設計軟骨構造を刺激するせん断および圧縮の観点から使用機械的荷重を報告している。 Mauck ら 10は、単独で機械的負荷がさらに不可欠とみなされる成長因子の非存在下で、間葉系幹細胞の軟骨形成を誘導することができることを示唆している。そのような組織培養中の圧縮またはせん断などの断続的な機械的荷重の印加が軟骨及び骨形成を調節することが示されているが、しかしながら荷重の最適な線量は、細胞および組織特性11と異なっている。 関節軟骨の最も重要な機能は、内圧縮および剪断力に耐える能力であるジョイントは、したがって、それは高い圧縮および剪断弾性率を有していなければならない。工学軟骨における機能機械的強度および生理学超微細構造の欠如は、in vivoでのネオ軟骨で内訳と関節の軟骨交換戦略の失敗をもたらした。圧縮及びせん断は、一般的に変調し、関節軟骨のバイオ複合材料の機械的強度を向上させることが実証されているが、合成アプローチは6,12-15稀である。 Wartellaとウェイン16は半月板軟骨の交換を生成するために引張圧縮を適用されたバイオリアクターを設計しました。ウォルドマンら 15は、多孔性カルシウムポリリン酸基質で培養軟骨細胞への圧縮とせん断を適用するデバイスを設計しました。総統ら 17ゲルおよび軸メカの適用における成人イヌ軟骨細胞のin vitroでの栽培とネイティブ軟骨のマッチング機械的特性を実証しanicalローディング（圧縮変形のロードと摺接ロード）。 二軸機械的荷重バイオリアクターは、もともと組織工学軟骨で形態素適応を誘導するために全体的な目標に我々の研究室でダニエルチュウによって設計されました、現在入手可能な18よりも高い圧縮とせん断弾性係数の結果構築します。私たちは、この研究が大幅にメカノは、臨床的に関連する組織をエンジニアに変調することができる方法の我々の広範な理解を高めると信じています。

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>DMEM, 高グルコース, ピルビン酸</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>アガロース II 型</td><td>Sigma</td><td>CAS 39346-81-1</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン グルタミン 100X</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>ITS+ Premix</td><td>BD Biosciences</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>Pen 連鎖球菌 グルタミン</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシンB</td><td>Invitrogen</td><td>041-95780</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマ</td><td>A-2218</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸溶液 100x</td><td>Sigma</td><td>M-7145</td><td></td></tr><tr><td>L-プロリン</td><td>Σ</td><td>P-5607</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Σ</td><td>D-2915</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトトランスフォーミング成長因子 &#946;1</td><td>R&D Systems</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Model 31 ロードセル (1000 g)</td><td>Honeywell</td><td>AL311</td><td></td></tr><tr><td>モデル 31 ロードセル (1000 g)</td><td>Honeywell</td><td>AL311</td><td></td></tr><tr><td>シングルチャンネルディスプレイ</td><td>Honeywell</td><td>SC500</td><td></td></tr><tr><td>50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator</td><td>Thorlabs</td><td>LNR50SE/M</td><td></td></tr><tr><td>2チャンネルステッピングモータコントローラ</td><td>Thorlabs</td><td>BSC102</td><td></td></tr><tr><td>50 mm台形ステッピングモータドライブ (2)</td><td>Thorlabs</td><td>DRV014</td><td></td></tr><tr><td>調整可能なキネマティックロケータ (4)</td><td>Thorlabs</td><td>KL02</td><td></td></tr><tr><td>精密直角プレート</td><td>Thorlabs</td><td>AP90/M</td><td></td></tr><tr><td>垂直取り付けブラケット</td><td>Thorlabs</td><td>LNR50P2/M</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mmおよび0.75 mmスペーサープレートBioRad</td><td></td><td>#1653312および#1653310</td><td></td></tr>使い捨て生検パンチ、5 mm Miltex、Inc.を備えた<tr><td>固体アルミニウムブレッドボード</td><td>Thorlabs</td><td>MB3030 / M</td><td></td></tr>ゲル鋳造システム<tr><td></td><td></td><td>33-35</td><td></td></tr><tr><td>16 mm 中空パンチ</td><td>Neiko Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>非組織培養処理プレート、24 ウェル、平底</td><td>BD Biosciences 351147</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラテン積載用超耐湿ポリスルホン シート</td><td>McMaster-Carr</td><td>86735k19</td><td>カスタム加工</td></tr></tbody></table>

組織工学のための二軸メカニカルローディングバイオリアクターの設計

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

私たちは、移植のために製造された組織工学バイオ複合材料に一軸又は二軸の機械的な歪みを加えることが可能なローディング装置を設計しました。装置は主にネイティブ機械的歪みを模倣するバイオリアクターとして機能するが、それはまた、力フィードバックまたは構築物の機械的試験を提供するためのロードセルを装備している。デバイス被験者はローディング線量の高い精度（振幅と周波数）で軸機械的負荷に対する軟骨構造を設計し、標準的な組織培養インキュベーター内に収まるように十分コンパクトです。それは、直接組織培養プレートにサンプルをロードし、多板サイズは、システムと互換性がある。装置は、精密誘導レーザ·アプリケーションのために製造コンポーネントを使用して設計されている。二軸荷重は、2つの直交する段によって達成される。ステージ50ミリメートル移動範囲を有し、ステッピングモータアクチュエータによって独立に駆動されることによって制御50nm未満のステップサイズを可能にする、マイクロステップ機能を備えた閉ループステッピングモータドライバ。ポリスルホンローディングプラテンは、二軸可動プラットフォームに連結されている。ステージの動きはトール·ラボの高度なポジショニング技術（APT）は、ソフトウェアによって制御されます。ステッピングモータドライバは、周波数及び剪断及び独立かつ同時に圧縮の両方の振幅の負荷パラメータを調整するためのソフトウェアで使用される。位置フィードバックは、旅行の完全な50ミリメートル以上3μm未満の位置精度に翻訳し、0.1μmの双方向再現性と20nmの分解能を持っている非線形光学エンコーダによって提供されます。これらのエンコーダは、真のナノ位置決め機能を確保するために、ドライブ·エレクトロニクスに必要な位置フィードバックを提供します。検出するためのフォースフィードバックのロード応答に連絡し、評価を提供するためには、精密小型ロードセルローディングプラテンとmovinの間に配置されているグラムプラットフォーム。ロードセルは、0.15％〜0.25％フルスケールの高い精度を有している。

装置を20万個の細胞/ mlの軟骨とアガロースゲルシードを使用してテストし、一軸（圧縮）または軸（圧縮及びせん断）機械的荷重の存在下で培養した。一次ブタ軟骨細胞は2-4ヶ月のブタの関節軟骨から分離した。直径5mm及び厚さ1.5mmのサンプルを定義した軟骨細胞培養培地（高グルコースDMEM、1％ITS +プレミックス、100 U / mlのペニシリン、100μg/mlの/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、2.5μgの/ mlの2mlに培養したアムホテリシンB、37、24ウェルプレート中の50μgの/ mlのアスコルビン酸、0.1mMの非必須アミノ酸（NEAA）、プロリン0.4ミリモル）°C、5％CO 2。 10 -7 Mデキサメタゾンおよび10 ng / mlのTGF-β1は、培養の最初の10日間の供給した。サンプルは10から30日の間に3時間/日のためにロードされた。一軸負荷が10％圧縮ピーク·ツー·ピーク振幅から構成され、1Hzの二軸荷重は0.15ミリメートル（10％厚さ）圧縮および0.075から成っmmのせん断ピーク·ツー·ピーク振幅、1 Hzの。動的なひずみ振幅と負荷周...

私たちは、関節軟骨欠損部に移植前に軟骨バイオ複合に一軸又は二軸の機械的ひずみを適用できる新規な機械的負荷バイオリアクターを設計しました。

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

本実験の全体的な目的は、移植用の機能的な組織工学バイオ複合体を作製することです。これは、3次元バイオ材料複合体中の細胞に生物物理学的刺激を与えるため、精密な一軸または二軸の機械的歪みを負荷することで達成されます。第二のステップとして、バイオリアクターにロードセルを装備し、負荷中のバイオ複合体の力フィードバックおよび機械的試験を可能にします。次に、バイオ複合体を数週間にわたって培養し、構成物の生化学的成分と強度にマクロスケールの変化を誘導します。その結果、グリコサミノグリカンおよびコラーゲン含有量、スキャフォールドの厚さ、および平衡弾性率の有意な差に基づき、異なる種類の負荷の影響が示されます。この手法は、工学的軟骨組織に対する二軸負荷の影響に関する知見を提供できますが、骨や腱などの他の低荷重組織にも適用可能です。本手順の実演は、当研究室のAmy MayとRob Stefaniが行います。まず、ここに示すように二軸バイオリアクターをセットアップしてください。バイオリアクターのベースは、25 cm × 30 cm × 12.5 mmのアルミニウムプレートで構成されています。可変の位置調整オプションにより、異なる形状やサイズの組織培養プレートを柔軟に取り付けることが可能です。次に、水平ステージがx軸方向にのみ振動して動的なせん断力を提供するように、ベースにステージを取り付けてください。垂直ステージは、Z軸方向にのみ振動させることで動的圧縮を与えます。次のステップは、カスタムのポリスルホン製ローディングプレートを作製することです。ポリスルホン素材は、生体適合性が高く、切削加工や滅菌が容易であるため、この用途に最適です。精密加工された直角ブラケットを用いて、プレートと2軸移動プラットフォームを結合します。ベースプレートに取り付けられたキネマティックストップには微調整ネジが備わっており、手作業では不可能な培養プレートの精密なアライメントが可能です。次に、各プラットフォームにステッピングモーターアクチュエータを取り付けます。これにより、ソフトウェア用の位置フィードバックが取得されます。ここに示すステッピングモーターアクチュエータは、0.1 µmの双方向繰り返し精度と20 nmの分解能を備えており、50 mmの移動範囲にわたって3 µm未満の精度を実現しています。Thor Labs社の高度なポジショニング技術ソフトウェアを使用して、ステージの動作を制御します。このソフトウェアでステッピングモーターを制御し、せん断および圧縮の両方の負荷パラメータである周波数と振幅を、独立かつ同時に調整します。次に、小型の5ポンドロードセルを負荷プラチナと可動プラットフォームの間に配置し、プラチナと構築物の接触検出および負荷応答の評価に必要なフォースフィードバックを確保します。ロードセルの精度がフルスケールの0.15%から0.25%の高精度であること、およびロードセルのディスプレイユニットにコンピュータでのデータ収集が可能なRS 2 32ポートが備わっていることを確認してください。24ウェルプレートのウェル内でサンプルを固定するために、1.5 millimeterのスペーサーを備えたゲルキャスティングシステムを用いて、厚さ1.5 millimeterのアガロースゲルの型を準備します。組み立て後、2枚のガラスプレートの間に4%アガロース溶液を注ぎ、混合液を冷却させます。次に、トッププレートを取り外し、アグロスラブから直径16 mmのディスクを打ち抜きます。各ディスクの各ウェルサンプルについて、サンプルを配置するための穴を開けます。完成したディスクを24ウェルプレートの各ウェルに配置します。次に、厚さ2.25 millimeter、直径5 millimeterの組織構築物を各ゲルホルダーに押し込みます。サンプルが各エアロスホルダーの上端から突き出ている状態にしてください。続いて、各ウェルに1.5 millilitersの培地を加え、カバーを戻します。その後、サンプルをロードするまでプレートをインキュベーターに戻します。組織構築物の機械的負荷を開始するには、アルミニウムプレートをロードセルに固定し、常に垂直ステージに滅菌済みのプラチンアセンブリを取り付けてください。機器の故障を防ぐため、インキュベーターは低湿度条件下で運転してください。次に、ステッピングモーターコントローラーとPCの電源を入れます。高度ポジショニング技術（advanced positioning technology）のユーザープログラムを開き、両方の画面でグラフィカルコントロールタブを表示します。ホームゼロボタンを押し、両方のステッピングモーターを、最上部かつ右端として定義されているゼロ位置に移動させます。メカニカルローディング中のオーバーフローを防ぐため、各ウェルから培地を一部除去し、サンプルのロード準備を行います。次に、24ウェルプレートをバイオリアクターに設置し、4つの調整可能なキネマティックロケーターを使用して、プレートをプラテンに慎重に合わせます。このとき、プレートが正しく整列していることを確認してください。グラフィカルコントロールタブで、バイオリアクターベースの前方と面合わせにします。手動で微調整します。位置ボックスをクリックして水平方向に移動させ、アライメントを調整してください。プレートがプレートのウェルと一致したら、サンプルに最初に接触するまでプレートを下げ始めます。開始位置に到達したら、「move sequencer」タブに移動し、[load]を押して目的の移動シーケンスを読み込むか、このビデオに付随するテキストプロトコルに従って独自のプログラムを作成してください。次に、[run]を押してプログラムを開始します。ソフトウェアがモーターを制御し、サンプルに目的のコンディショニングレジメンを適用します。プログラムが終了したら、プレートを手動で持ち上げ、組織培養プレートの上端から離します。次に、24ウェルプレートをバイオリアクターから取り出し、培地を交換します。最後に、ロードセルからプラチナを慎重に取り外し、機器の電源を切ります。本ビデオで説明した二軸バイオリアクターの使用は、組織工学構築物内の細胞によって分泌されるグリコサミノグリカンおよびコラーゲンの量に大きな影響を及ぼしました。コンディショニングは、10%の圧縮歪みおよび5%の剪断歪みを1 Hzで、1日3時間、週5日実施しました。30日間の培養後、二軸負荷にさらされた軟骨細胞によって分泌されたグリコサミノグリカンおよびコラーゲンの量は、対照群のサンプルよりも有意に高い値を示しました。一方、一軸負荷ではグリコサミノグリカンの量のみが有意に増加しました。さらに、二軸性負荷によって構築物はより厚くなりましたが、構築物の弾性に影響は見られませんでした。この投与プロトコールに従い、30日間のコンディショニングと培養後、組織構築物の横断面を、サフランブルーやII型コラーゲンなどの代表的な軟骨マーカーで染色しました。3つの異なるグループは、コンディショニングなし、一軸性負荷、および二軸性負荷です。すべての群でアリシアンブルーおよびサフラニンOによる陽性染色が認められましたが、二軸負荷をかけたサンプルでは、無負荷および一軸負荷のサンプルと比較して、II型コラーゲンの量が増加していることがわかります。このビデオを視聴することで、組織工学的に作製した構築物の成長過程において、一軸または二軸負荷を適用する方法について十分に理解できたはずです。

design-biaxial-mechanical-loading-bioreactor-for-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

当社グループは、植込み型小径人工血管を再生成する心臓血管系の生理的拍動性のストレスを模倣したバイオリアクター培養システムを開発しました。...

拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

生理学的および病理学的圧力の条件に心臓弁組織を施すことのできる周期的圧力のバイオリアクターを設計されています。...

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

エレクトロ足場は、組織工学アプリケーションのためのポストプロダクションを処理することができます。ここでは、複雑な足場を回転するためのメソッドを（連続した回転で）記述し、厚い足場（マルチレイヤーによる熱を使用するか、水蒸気アニール）を行うために、無菌性（無菌製造又は殺菌のポストプロダクション）を達成するために、適切な生体力学的特性を達成するために。...

組織工学のためのエレクトロ繊維のポスト処理

我々は、この資料に複雑な異方性軸の機械的変形に単一細胞応答を調査し、生物学的組織の機械的特性を定量化するために使用することができる新規な延伸プラットフォームを提示する。...

細胞および組織メカノでのアプリケーションのためのプラットフォームをストレッチ小説

この研究では、コラーゲン、平滑筋細胞、内皮細胞を直接培養することにより、生体血管組織を迅速に作製する技術を紹介します。さらに、人工血管組織の機械的特性評価のための新しいプロトコルについて説明します。...

エンジニアリング3D細胞化血管組織再生のためのコラーゲンゲル

ここで純粋な一軸荷重マシンを開発するためのプロトコルを提案する.重要な設計の側面は、正確で再現性のあるテスト結果を確保するため用いられます。...

一軸荷重マシン開発のデザイン面のアプリケーション

三次元単軸的な機械的刺激バイオリアクターシステムは、腱由来幹細胞の形質特異的分化およびネオ腱形成のための理想的なバイオリアクターである。...

腱由来幹細胞の発熱分化を誘導する三次元単軸機械刺激バイオリアクターシステムの適用

このプロトコルの目的は、剪断応力と環状ストレッチの分離を可能にするバイオリアクターを使用して、材料駆動組織再生を調査するために、管状の電気スピン足場でヒトマクロファージと筋線維芽細胞の動的共培養を実行することです。...

フローとストレッチの下でバイオ材料の炎症と再生能力を評価するマルチキューバイオリアクター

幹細胞由来の心筋細胞を用いてバイオエンジニアリングされた3次元心臓組織は、健康なヒト心筋と病気のヒト心筋を in vitro...

人工心臓組織のデータ取得とモデルスループットを向上させるバイオリアクターの設計

このプロトコルは、灌流中の血管の ex vivo 培養のために、新たに開発された3Dプリントされたバイオリアクターのセットアップと操作を示しています。このシステムは、他のユーザーが簡単に採用できるように設計されており、実用的で手頃な価格で、基礎生物学や薬理学的研究などのさまざまな実験アプリケーションに適応できます。...

Ex Vivo(エクス・ビボ )3Dプリントされたバイオリアクターでの大血管の灌流培養

学ぶ二軸メカニカルローディングバイオリアクターの設計と操作方法。軟骨バイオコンポジットへの機械的ひずみ負荷により、細胞の生化学的応答と組織強度を向上させる組織工学手法を解説します。

組織工学のための二軸メカニカルローディングバイオリアクターの設計

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