マウス歯肉細胞の単離、処理と解析
July 2nd, 2013
この研究は、単一細胞培養を生成するために、マウス口腔から歯肉組織を分離して処理するための効率的な手法が記載されている。得られた細胞をさらにフローサイトメトリー分析および分子生物学的研究のために使用することができる。
この手順の全体的な目標は、ミリン歯肉を正確に分離して処理し、さらなるフローサイトメトリー分析を行うことです。これは、最初に歯肉を細心の注意を払って外科的に分離することによって達成されます。次に、切除された組織を処理して、単一細胞懸濁液を生成します。
その後、抗体による細胞外および細胞内染色を行います。最後に、サンプルをフローサイトメトリーで分析します。最終的には、フローサイトメトリー分析により、歯肉内の異なる細胞集団と、免疫学的傷害への曝露後に組織に起こる細胞変化を示す結果を得ることができます。
この手法の主な利点は、OC化学や単蛍光のようなオーバーリング法であり、多数の細胞を迅速かつ簡単に分析できる方法であり、複数の変数を同時に分析できるだけでなく、さまざまな細胞タイプを選別してさらなる実験を行うことができます。この方法は、微生物が歯肉の恒常性にどのように影響するか、歯周炎の実験モデルで炎症誘発性骨量減少とどのように関連しているかなど、免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。私たちは、歯周炎中のRI細胞の役割に取り組み始めたときに、この方法のアイデアを最初に思いつきました。遺伝子GVA加速技術は、サイズが小さく、MU one J gvaへのアクセスが比較的不便であるため、習得が難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。
まず、テキストプロトコルに従って培地溶液と滅菌手術器具を準備します。マウスを安楽死させた後、あなたの機関の動物管理および使用委員会の承認された方法に従って、鋭くて鈍いまっすぐなはさみを使用して、頬と下顎枝を含む口腔の両側を切り取り、下顎骨を引っ張って、腹骨の平面に垂直に向ける標準ハサミを引き下げます。軟組織と硬組織を想像上の線で、第3大臼歯の1ミリメートル後ろに切ります。
次に、切歯の2mm後ろにある軟組織と硬組織内に切開を行います。次に、口の前部を引き下げて鼻腔を露出させ、ハサミを口蓋と平行にします。一方の出血を鼻腔に入れ、もう一方の出血を使用して前庭を切開し、後部切開まで切り込みます。
上顎骨の反対側で切開を繰り返して、頭蓋骨から取り外します。次に、それを真ん中に切り取り、腹筋と鉗子を使用して各半上顎骨から口蓋組織をトリミングして歯槽骨に到達します。歯肉組織を前縁から剥がし、PBSと2%ウシ胎児血清またはFCSを入れたプレートに入れて歯肉を処理し、1ミリリットルのPBSで培養皿に移し、コラゲナーゼ2型1ミリリットルあたり2ミリグラム、DNA1ミリリットルあたり1ミリグラム。
15番の滅菌外科用ブレードを備えたタイプ。組織をよくミンチしてから、15ミリリットルの円錐形試験管に移します。プレートに残っている組織細胞を1ミリリットルのP-B-S-F-C-Sで洗い流し、チューブに移します。
予熱した振盪インキュベーターで、摂氏37度、回転数200rpmで組織を20分間インキュベートします。次に、20マイクロリットルの0.5モルEDTAを加え、さらに10分間インキュベートします。次に、P-B-S-F-C-Sを最大12ミリリットルまで加え、サンプルを摂氏4度、Gの400倍で8分間遠心分離します。
上清を取り除いた後、細胞を2ミリリットルのP-B-S-F-C-Sで懸濁します。70ミクロンのセルストレーナーでサンプルをろ過し、摂氏4度、Gの320倍で5分間フロースルーを回転させます。Resusは、細胞を300マイクロリットルのP-B-S-F-C-Sに懸濁します。
最後に、低温でライトを消灯したフードの下で働いている細胞を総容量100マイクロリットルで数え、選択した各抗体を1×10あたり0.2〜0.5マイクログラムを6番目の細胞に加え、短時間ボルテックスします。暗所で4°Cで15分間インキュベートした後、P-B-S-F-C-Sを2ミリリットル加え、Gの320倍、摂氏4°Cで5分間遠心分離します。細胞を固定するには、上清を吸引し、次に蘇生をボルテックスしながら、500マイクロリットルの冷たいBDサイトパーマを滴下して細胞を懸濁します。
サイト効果は、インキュベーションボルテックス後、暗所で40分間チューブを摂氏4度でインキュベートします。次に、1ミリリットルのBDパーマ洗浄液を加え、緩衝液を緩衝し、摂氏4度でGの800倍で7分間回転させます。洗浄を繰り返した後、300マイクロリットルの洗浄バッファーを除くすべてを吸引します。
次に、細胞を総量100マイクロリットルで細胞内に染色するために、選択した抗体を6つの細胞に1×10ごとにそれぞれ1マイクログラム加えます。短時間ボルテックスし、暗闇で30分間インキュベートします。前と同じように細胞を2回洗浄し、すべてのスーパーナトを除去した後、細胞を300マイクロリットルの新鮮な冷BDパーマ洗浄バッファーに再懸濁します。
短い渦巻きの後、サスペンションをファックスチューブにろ過します。ファックス分析を実行する準備ができるまで、チューブを氷の上または暗闇の冷蔵庫に保管してください。2匹のナイーブマウスからプールされた歯肉細胞。
LSR 2フローサイトメーターで実行し、FlowJoソフトウェアを使用して分析しました。ここに示す横散乱図と前方散布図は、セルの分布を示しています。リンパ球、単球、樹状細胞、および顆粒球を同定するためのゲーティング戦略は、比較目的で示されています。
この図は、実験的歯周炎の設定で経口強制経口投与の21日後にPジンジバリス感染マウスから精製された歯肉細胞を示すファックスプロットを表しています。さまざまな免疫細胞集団の増加は、ここに示すナイーブマウスと比較して、感染したマウスで容易に検出できます。処理された歯肉中の免疫細胞は、造血マーカーCD45を発現する細胞にゲーティングすることによって同定される。
これらの細胞は、この図に示されているCDの3つの陽性T細胞にさらに分離されました。好中球は、LY 6つのGおよびCD 11 B分子の発現によっても同定されました。最後に、ランガーハンド細胞および樹状細胞の上皮サブセットをMHCクラス2陽性CD11C陽性細胞およびEPAMおよびRIN CD2 0 7の発現にゲーティングすることによって同定
した。リアルタイムPCRのような他の方法は、シングルセル遺伝子発現のような追加の質問に答えるために実行することができます その開発後。この技術は、免疫学の分野の研究者が、歯周研究の分野におけるあらゆる侮辱に対するging GVAの局所応答を探求する道を開きました。この技術により、実験的歯周炎の病因におけるG GVAの免疫細胞と非免疫細胞の役割を解明することができました。
このビデオを見た後、尿GVAを分離して処理する方法を十分に理解し、シングルセル懸濁液を取得し、さらにフローサイトメトリー分析のために追加の細胞内vir染色を行う方法について理解できるはずです。
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概要
この研究は、マウスの口腔から歯肉組織を単離し処理して単一細胞培養を作り出す効率的な技術を説明しています。得られた細胞はフローサイトメトリー分析と分子研究に使用できます。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 免疫学
背景
- 歯肉組織は口腔の健康を理解する上で重要です。
- 単一細胞培養により詳細な細胞分析が可能になります。
- フローサイトメトリーは細胞集団を分析するための強力なツールです。
- 免疫学的ストレスは歯肉の細胞組成に影響を与える可能性があります。
研究の目的
- さらなる分析のために歯肉組織を単離すること。
- フローサイトメトリー用の単一細胞懸濁液を生成すること。
- 免疫学的露出後の細胞変化を研究すること。
使用した方法
- 歯肉の外科的単離。
- 切除した組織を単一細胞懸濁液に処理すること。
- 抗体による細胞外および細胞内染色。
- フローサイトメトリーを用いたサンプルの分析。
主要な結果
- 歯肉における異なる細胞集団の同定。
- 免疫学的ストレス後の細胞変化の観察。
- フローサイトメトリーは細胞ダイナミクスに関する詳細な洞察を提供しました。
- 結果は免疫チャレンジに対する歯肉の反応の理解に貢献します。
結論
- この技術により歯肉細胞の効率的な単離と分析が可能になります。
- フローサイトメトリーは歯肉の細胞反応を研究するのに効果的です。
- 結果は口腔免疫学に関する将来の研究に情報を提供する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Precise isolation and flow cytometric analysis of murine gingival cells enables high-resolution profiling of immune cell populations in a disease-relevant oral tissue. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for immunological pathways implicated in periodontal disease and bone remodeling. The method enhances predictive confidence for early discovery and translational research focused on oral and bone-immune interactions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell dynamics in gingival tissue under inflammatory conditions.
- Supports functional validation of immune targets relevant to oral and bone disease models.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing rare cell populations such as Langerhans and T regulatory cells.
- Provides quantitative data to inform portfolio triage and prioritization of immunomodulatory strategies.
Screening & Assay Development
- Generates validated single-cell suspensions suitable for multiparametric flow cytometry assays.
- Supports assay standardization and reproducibility for immune cell phenotyping in small tissue samples.
- Enables scalable analysis of cellular responses to experimental perturbations in preclinical models.
- Prepares samples for downstream molecular analyses, including gene expression profiling.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of periodontitis and bone loss for translational biomarker discovery.
- Provides continuity from discovery-stage immune profiling to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling robust immune monitoring in vivo.
- Facilitates exploration of local immune responses and their impact on tissue remodeling.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling immune cell profiling in murine models of oral inflammation and bone remodeling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on immune mechanisms driving periodontal disease and bone loss.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative flow cytometry outputs for immune cell subset analysis.
- Analytics: Provides multiparametric data for comparing immune responses across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges early discovery findings with preclinical biomarker and efficacy studies in relevant disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for immune cell isolation and analysis in oral and bone research pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune-targeted research.
- Operational Value: Standardizes immune cell isolation and analysis from challenging tissue sources.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust immune profiling early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunomodulatory and bone-targeted therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgical techniques and flow cytometry analysis.
- Demands access to specialized instrumentation for cell sorting and multiparametric analysis.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and staining protocols.
- May require adaptation for different mouse strains or disease models.
- Limited by the small size and accessibility of murine gingival tissue, impacting throughput.
