マウス歯肉細胞の単離、処理と解析

本手順の全体的な目的は、後のフローサイトメトリー解析に向けて、鏡面歯肉を精密に単離および処理することです。まず、外科的な手法を用いて歯肉を細心の注意を払って単離します。次に、摘出した組織を処理して単一細胞懸濁液を作成します。

次に、抗体を用いて細胞外および細胞内の染色を行います。最後に、フローサイトメトリーによりサンプルを解析します。これにより、最終的に、歯肉における異なる細胞集団や、免疫学的負荷への曝露後に組織で起こる細胞変化をフローサイトメトリー解析によって示す結果を得ることができます。

本手法の、OC化学や単色蛍光法などの他の手法に対する主な利点は、多数の細胞を迅速かつ簡便に解析でき、複数の変数の同時解析や、さらなる実験に向けた様々な細胞型の分取が可能である点です。この手法は、微生物がどのように歯肉の恒常性に影響を与えるか、またそれが歯周炎の実験モデルにおける炎症誘発性骨吸収とどのように関連しているかなど、免疫学分野における重要な疑問への回答に寄与します。私たちがこの手法を考案したのは、歯周炎におけるRI細胞の役割に取り組み始めたときでした。gene GVA加速法は、サイズが小さく、MU one J gvaへのアクセスが比較的困難であるため習得が難しく、本手法の視覚的な提示が極めて重要となります。

まず、テキストのプロトコルに従って、培地溶液および滅菌済みの手術器具を準備します。所属機関の動物実験委員会が承認した方法でマウスを安楽死させた後、鋭利で鈍いストレート鋏を用いて、頬および下顎枝を含む口腔の両側を切開し、標準的な鋏を口蓋骨の平面に対して垂直に direcion させて下顎を下げます。第3大臼歯の1 mm後方の仮想線上で、軟組織および硬組織を切断します。

次に、切歯から2 mm後方の軟組織および硬組織を切開します。その後、口の前方を下方へ牽引し、鋏を口蓋と平行に保持して鼻腔を露出させます。1つの止血鉗子を鼻腔内に留置し、もう一方の鉗子を用いて前庭を切開し、後方の切開線まで切り進めます。

上顎骨を頭蓋骨から切り離すため、上顎骨の反対側でも同様に切開を行います。次に、上顎骨を中央で切断し、ハサミとピンセットを用いて各半上顎骨から口蓋組織をトリミングし、歯槽骨を露出させます。前方縁から歯肉組織を剥離し、PBSおよび2%胎児牛血清（FCS）を入れたプレートに移して歯肉を処理します。その後、1 mLのPBS、2 mg/mLのコラゲナーゼ type II、および1 mg/mLのDNaseを入れた培養皿に移します。

15番の滅菌外科用メスで細切にします。組織を十分にミンチした後、15 mLコニカルチューブに移します。プレートに残っている組織細胞を1 mLのP-B-S-F-C-Sで洗浄し、チューブに移します。

予め加熱したシェーキングインキュベーターを用い、37 °C、200 RPMで組織を20分間インキュベートします。次に、0.5 M EDTAを20 µL加え、さらに10分間インキュベートします。続いて、P-B-S-F-C-Sを12 mLまで加え、サンプルを4 °C、400 ×gで8分間遠心分離します。

上清を除去した後、細胞を2 mLのPBS-FCSに懸濁します。サンプルを70 µmのセルストレーナーでろ過し、4 °C、320 ×gで5分間遠心分離します。その後、細胞を300 µLのPBS-FCSに再懸濁します。

最後に、低温に設定し照明を消したフード内で、全量100 µL中の細胞数をカウントし、選択した各抗体を1 × 10⁶ cellsあたり0.2〜0.5 µg添加して、短時間ボルテックスします。サンプルを4 °Cの暗所で15分間インキュベートした後、2 mLのPBS-FCSを加え、320 ×g、4 °Cで5分間遠心分離します。細胞を固定するため、上清を吸引し、ボルテックスしながら冷BD CytoPerms 500 µLを滴下して再懸濁します。

細胞への影響を抑えるため、インキュベーション後、チューブを4 °Cの暗所で40分間静置します。次に、BD Perm Wash Bufferを1 mL加え、4 °Cで800 ×gにて7分間遠心分離します。洗浄工程を繰り返した後、洗浄バッファーを300 µL残してすべて吸引除去します。

次に、全量 100 µL で細胞を細胞内染色するため、1 × 10⁶ 個の細胞につき、選択した抗体をそれぞれ 1 µg ずつ加えます。短時間ボルテックスし、暗所にて 30 分間インキュベートします。前述と同様に細胞を 2 回洗浄し、上清をすべて除いた後、冷やした新鮮な BD perm wash buffer 300 µL で細胞を再懸濁します。

短時間ボルテックスした後、懸濁液をfaxチューブにろ過します。fax解析を行うまで、チューブを氷上または冷蔵庫内の暗所に保管してください。ナイーブマウス2匹からプールした歯肉細胞。

LSR II フローサイトメーターを用いて解析し、FlowJo ソフトウェアで分析を行った。ここに示すサイドスキャッターおよびフォワードスキャッターのプロットは、細胞の分布を示している。比較目的のため、リンパ球、単球、樹状細胞、および顆粒球を特定するためのゲーティング戦略を示している。

この図は、実験的歯周炎モデルにおいて、経口投与から21日後のP gingivalis感染マウスから精製された歯肉細胞を示す FACS プロットです。ここに示されている未処置マウスと比較して、感染マウスでは様々な免疫細胞集団の増加が容易に検出されます。処理済み歯肉中の免疫細胞は、造血マーカーである CD 45 を発現する細胞をゲーティングすることで同定されています。

これらの細胞は、本図に示すように、さらにCD3陽性T細胞へと分画されました。好中球は、LY6GおよびCD11b分子の発現に基づいて同定されました。最後に、MHCクラスII陽性かつCD11c陽性細胞をゲートし、EPCAMおよびRIN CD207の発現を確認することで、ランゲルハンス細胞および上皮性樹状細胞サブセットを同定しました。この手法に習熟し、本手順に従って適切に実施すれば、3.5時間から5時間で完了させることができます。

開発後、単一細胞の遺伝子発現などの追加的な疑問に答えるために、リアルタイムPCRなどの他の手法を行うことができます。この技術により、免疫学分野の研究者は、歯周病研究におけるあらゆる刺激に対する歯肉GVAの局所反応を探索することが可能となりました。また、本手法を用いることで、実験的歯周炎の病態形成におけるG GVAの免疫細胞および非免疫細胞の役割を解明することができました。

このビデオを視聴することで、フローサイトメトリー解析のための細胞外および細胞内ウイルス染色に供する単一細胞懸濁液を得るために、尿中GVAを分離および処理する方法について十分に理解することができます。