糖尿病CD4の養子移入+ T細胞によるマウスの加速された1型糖尿病の誘導

この手順の全体的な目標は、トランスジェニックマウスからの糖尿病性T細胞を内因性T細胞およびb細胞を欠くマウスに移すことにより、マウスに1型糖尿病を迅速に誘発することです。まず、ドナーマウスから脾臓とリンパ節を採取し、CDの4つの陽性T細胞を精製します。次に、精製したドナーT細胞をノンスキッドレシピエントマウスに養子として移します。

次に、レシピエントマウスの1型糖尿病の発症を監視します。最終的に、このプロトコルは、糖尿病の病因を研究し、他の方法と比較して治療的介入を調査するために使用できます。BDC 2.5、CD 4陽性T細胞をノンスキッドレシピエントに転写するこの技術の主な利点は、1型糖尿病の迅速かつ再現性のある発症です。

糖尿病性 CD のドナーの場合、4 つの陽性 T 細胞は、尿グルコース測定によって糖尿病がないと判断された 6 週齢の糖尿病前雌 BDC 2.5 マウスを使用します。脾臓とリンパ節を切除するには、毛皮を70%エタノールに浸してから皮膚をカットし、前肢の筋肉が露出するまで皮膚を引っ込めます。前肢の付け根近くに、両側の2つのリンパ節が見えるはずです小さなピンセットで各リンパ節を慎重につかみ、結合組織をトリミングして取り除きます。

次に、小さなハサミを使用して腹膜に1インチの切開を行います。次に、中央の脾臓をそっとつかみます。結合組織と付着した脂肪を慎重に切り取ります。

次に、氷上のDMEMの10ミリリットルで脾臓、レース、脾臓、リンパ節を取り除きます。滅菌済みの10ミリリットルシリンジプランジャーの最後に、70マイクロメートルのセルストレーナーを通してリンパ器官を優しく押します。単一細胞懸濁液を得るため。

各ストレーナを1ミリリットルのDMEMで数回すすぎ、細胞の回収を最大化します。次に、収集した細胞を15ミリリットルの円錐管に移し、400Gで7分間遠心分離します。室温で、細胞ペレットを3ミリリットルのCK緩衝液に再懸濁します。

次に、室温で5分間インキュベートします。赤血球を灰汁にするには、12ミリリットルのDMEMを追加し、遠心分離によって細胞をペレット化します。細胞ペレットをDMEM10ミリリットルに1回洗浄します。

次に、細胞を5ミリリットルのファクト染色バッファーに懸濁し、位相差顕微鏡とヘモサイトメーターを使用して生細胞の数をカウントします。次に、染色コントロールごとに6つの細胞のうち約10倍を除去します。また、マウスモノクローナル抗体で細胞を染色し、非活性化トランスジェニックCDの4陽性T細胞を選別します。

これらすべてのサンプルを摂氏4度で暗所で30分間インキュベートします。次に、ファックスバッファーの3倍の染色量で細胞を洗浄し、ファックスバッファー内の細胞を10の1〜2倍、サンプルの選別には1ミリリットルあたり7細胞、シングルステインコントロールには300マイクロリットルを再懸濁します。次に、細胞サンプルを35μmのセルストレーナキャップチューブに通します。

細胞塊を除去するには、訓練を受けたオペレーターと細胞ソーターのためのサンプルを処理し、セットアップ時間を含む約3時間、約1.5倍10から8番目の合計トランスジェニックナイーブCD4陽性T細胞をソートする。BD Fox Ariaのような装置では、マウスあたり6個の細胞のうち10個の約2.5倍、ソートレートは1秒あたり4番目のイベントの10の約2倍になると予想できます。選別した細胞を3ミリリットルのDMEMに集めます。

選別された細胞の絶対数を記録し、7分間遠心分離します。400 Gsで、細胞ペレットを滅菌リン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、養子T細胞移植を行います。18ゲージの針に1ミリリットルの注射器を使用して、ファックス精製したCDの4つの陽性T細胞を静かに再懸濁します。

1ミリリットルのシリンジをセットし、注射の準備として、シリンジに27ポイントハーフゲージ針を取り付けます。ノットスキッドレシピエントマウスを拘束し、70%エタノールで尾を拭いて注射部位を消毒します。次に、マウスごとに6つの精製CDのうち10分の1、4つの陽性T細胞を外側尾静脈のいずれかに注入します。

尾静脈注射を行うときは、プランジャーを無理に押し込まないように注意してください。針が実際に静脈内にある場合、T細胞移植の5日後から、注射はほとんど抵抗なく行われるはずです。1型糖尿病の発症について、うなずきスキッドレシピエントマウスを毎日監視します。

試薬ストリップを使用して、メーカーと指示に従って尿糖を測定します。250ミリグラム/デシリットルを超える2回連続した尿糖値を持つマウスは、糖尿病と見なされることに注意してください。.典型的な実験では、各BDC 2.5ドナーマウスは、糖尿病性CDの4つの陽性T細胞の養子移植後の細胞選別後の6つのナイーブトランスジェニックCD陽性T細胞のうち10倍約2.5倍を収め、マウスの尿グルコース濃度についてモニターした。

BDC 2.5ドナーマウスからの少数の細胞の養子移植は、11日目までにすべてのノンスキッドレシピエントで1型糖尿病を誘発しました。適切に行えば、この技術は臓器摘出からT細胞移植まで約8時間で行うことができます。