Name: 糖尿病CD4の養子移入+ T細胞によるマウスの加速された1型糖尿病の誘導 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 学ぶCD4+T細胞の養子移入によるマウス1型糖尿病誘導法。BDC2.5トランスジェニックマウスからT細胞を単離し、NOD.scid受容体に移入することで2週間以内に糖尿病を発症させる再現性の高い手法です。

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私たちは、博士に感謝します。有益なコメントをロバートBonneauとニールクリステンセン。 この作品は、医学資金のペンシルバニア州立大学によってサポートされていました。

1。 BDC2.5マウスの脾臓およびリンパ節由来のT細胞の単離<ol><li>糖尿病誘発性CD4 + T細胞のドナーとして6週齢前糖尿病女性BDC2.5マウスを使用してください。尿糖測定（下記参照）によって決定されたマウスは糖尿病フリーでなければなりません。 </li><li> CO 2窒息を使用して、各マウスを安楽死させると脾臓を除去し、無菌条件下で腋窩と上腕リンパ節。脾臓を削除するには、70％エタノールで毛皮を浸し、その後カットして肌を撤回。脾臓は、マウスの左側にある暗赤色器官として見えるようになります。小さなハサミを使って腹膜に1インチ切開を加え、そっと小さなピンセットで中央に脾臓を把握する。慎重にできるだけ結合組織および添付脂肪をトリミングおよび脾臓を除去。 </li><li>氷上で15 mlコニカルチューブに10ミリリットルダルベッコ修飾イーグル培地（DMEM）中で脾臓とリンパ節を収集します。 </li><li>第を使用して、単一細胞懸濁液を調製しプランジ​​ャが優しく同じ50ミリリットルコニカルチューブに70μmのセルストレーナー（こしにつき1脾臓、ストレーナ当たり4-6リンパ節）を通ってリンパ器官を押して滅菌を10mlの注射器の電子終わり。 </li></ol>プロセス中に、ストレーナからの細胞の回収を最大化するために1ミリリットルDMEMで数回各ストレーナーをすすいでください。 <ol start="5"><li>室温で7分間300-400 XGで15 mlコニカルチューブと遠心分離機に50ミリリットルコニカルチューブから採取した細胞を移す。 </li><li>赤血球を溶解するために、上清を捨て5mlの塩化アンモニウムカリウム（ACK）緩衝液（pH7.2）中で細胞を再懸濁、及び5分間RTでACK細胞懸濁液をインキュベートする。 </li><li> ACK-細胞懸濁液にDMEMを10mlを加え、上記のようにチューブを遠心。一回10ミリリットルDMEMで細胞ペレットを洗浄します。 </li></ol> 2。糖尿病CD4の蛍光活性化細胞選別BDC2.5 +マウスからのT細胞<ol><li> 5ミリリットルFACS s内の再懸濁細胞バッファ寧トリパンブルー色素排除により生存細胞の数（位相差顕微鏡と血球計数器を用いて）数える。 </li><li> FACS緩衝液を用いて、5×10 7細胞/ mlの細胞懸濁液の音量を調節する。 〜1染色コントロールあたり×10 6細胞（染色1いや、3つのシングル汚れ）を取り外します。非活性化されたトランスジェニックCD4 +抗CD4とT細胞（APC）、抗TCRVβ4（FITC）及び15 mlチューブ中の抗CD62L（PE）モノクローナル抗体（モノクローナル）のためのサンプルを染色。暗闇の中で4℃で20〜30分間、製造元が推奨するのmAb濃度°Cを用いた細胞染色を行う。 </li><li> &gt; 3X染色反応音量でサンプルし、FACSバッファーを持つ単一の染色コントロールを洗ってください。 （1-2×10 7細胞/サンプルをソートするためのMLと300μlの単染色コントロール用）と氷の上で店の隣まで300-400 xgでチューブを遠心、上清を除去し、FACSバッファーで細胞を再懸濁ステップ。 </li><li> 35μmのセルを介して細胞サンプルを渡す細胞塊を除去するストレーナーキャップチューブ。訓練されたオペレータとセルソーターでCD4 + TCRVβ4+ CD62L +細胞のためのサンプルをソートします。を15mlチューブに3ミリリットルDMEMに選別された細胞を収集します。 2×10 4合計イベント/秒のソート率で1.5×10 8細胞（3ドナーマウスから得られた細胞の概数）ソートするには、セットアップを含む2.5-3時間を許可します。 〜2.5×10 6非活性ジェニックCD4 +細胞選別後のマウス当たりT細胞を期待しています。 </li><li>ソートの末尾に選別された細胞の絶対数を記録し、300から400×gで7分間のためにそれらを遠心。上清を廃棄し、再懸濁細胞（2×10 6細胞/ ml）中の滅菌リン酸緩衝養子T細胞転送用生理食塩水（PBS）マグネシウム（Mg 2 + / Ca 2 +の自由）。 </li></ol> 3。糖尿病CD4の養子移入+ BDC2.5マウス由来のT細胞<ol><li>再懸濁FACS精製CD4優しく、1ミリリットルの注射器と18-1½ゲージ針を用いて+1ミリリットルのシリンジをT細胞とをロードします。注射の準備のために、27½ゲージ針で18-1½ゲージの針を交換してください。 </li><li>彼らはグルーミング行動を示すまで加熱ランプに6-8週齢の雌NOD.SCIDレシピエントマウスを公開します。 </li><li>拘束のレシピエントマウスを抑制し、注射部位を消毒するために70％（v / v）のエタノールで自分の尾を拭いてください。 </li><li>外側尾静脈のいずれかに1〜2×10 6 FACS選別された細胞/マウスを（最大で500μlのPBS）に注入します。 </li></ol>プランジ​​ャーを無理に押し込まないでください。針が静脈に適切に配​​置されている場合は、注入はほとんど抵抗なく行われる。 4。高血糖のためにレシピエントマウスの監視とT1D <ol><li> T細胞移入後5日から開始して、NOD.SCIDレシピエントマウスは、製造業者の指示に従って、試薬ストリップ（バイエルDiastix）を使用して、上昇した尿糖を毎日監視される。二つの連続urin持つマウス電子グルコース測定値は&gt; 250ミリグラム/ dlと、糖尿病と考えられている。 </li></ol>

<ol><li>Makino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+of+a+non-obese%2C+diabetic+strain+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice.</a> Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).</li>
<li>van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+etiology%2C+immunology%2C+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies.</a> Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).</li>
<li>Delovitch, T. L., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonobese+diabetic+mouse+as+a+model+of+autoimmune+diabetes%3A+immune+dysregulation+gets+the+NOD%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD.</a> Immunity. 7, 727-738 (1997).</li>
<li>Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+autoimmune+diabetes+mellitus+with+splenocytes+from+nonobese+diabetic+%28NOD%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice.</a> Diabetes. 35, 855-860 (1986).</li>
<li>Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syngeneic+transfer+of+autoimmune+diabetes+from+diabetic+NOD+mice+to+healthy+neonates.+Requirement+for+both+L3T4%2B+and+Lyt-2%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells.</a> J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).</li>
<li>Haskins, K., McDuffie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+diabetes+in+young+NOD+mice+with+a+CD4%2B+islet-specific+T+cell+clone%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone.</a> Science. 249, 1433-1436 (1990).</li>
<li>Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+diabetes+into+immunodeficient+NOD-scid%2Fscid+mice.+Relative+contributions+of+CD4%2B+and+CD8%2B+T-cells+from+diabetic+versus+prediabetic+NOD.NON-Thy-1a+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors.</a> Diabetes. 42, 44-55 (1993).</li>
<li>Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+autoimmune+diabetes+in+the+NOD+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse.</a> Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).</li>
<li>Serreze, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+I-mediated+antigen+presentation+and+induction+of+CD8%2B+cytotoxic+T-cell+responses+in+autoimmune+diabetes-prone+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice.</a> Diabetes. 45, 902-908 (1996).</li>
<li>Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+maintenance%2C+and+adoptive+transfer+of+diabetogenic+T-cell+lines%2Fclones+from+the+nonobese+diabetic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse.</a> Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).</li>
<li>Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+cell+apoptosis+in+T+cell-mediated+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).</li>
<li>Amrani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-independent+beta-cell+destruction+by+diabetogenic+CD8%28%2B%29+T+lymphocytes+in+transgenic+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice.</a> J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).</li>
<li>Dobbs, C., Haskins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+T+cell+clone+and+of+T+cells+from+a+TCR+transgenic+mouse%3A+TCR+transgenic+T+cells+specific+for+self-antigen+are+atypical%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical.</a> J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).</li>
<li>Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-lymphocyte+clone+specific+for+pancreatic+islet+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen.</a> Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).</li>
<li>Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+a+diabetogenic+T+cell+from+genesis+through+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis.</a> Cell. 74, 1089-1100 (1993).</li>
<li>Stadinski, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromogranin+A+is+an+autoantigen+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes.</a> Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).</li>
<li>Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pinpointing+when+T+cell+costimulatory+receptor+CTLA-4+must+be+engaged+to+dampen+diabetogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-expanded+antigen-specific+regulatory+T+cells+suppress+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes.</a> J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).</li>
<li>Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-dependent+regulatory+circuits+in+immune+inflammation+highlighted+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes.</a> J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+defects+in+innate+and+adaptive+immunologic+function+in+NOD%2FLtSz-scid+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice.</a> J. Immunol. 154, 180-191 (1995).</li>
<li>Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autoimmune+diabetes+locus+Idd9+regulates+development+of+type+1+diabetes+by+affecting+the+homing+of+islet-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells.</a> J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).</li>
<li>Verdaguer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+autoimmune+diabetes+in+monoclonal+T+cell+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice.</a> J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).</li>
<li>Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+early+age-related+increase+in+the+frequency+of+CD4%2B+Foxp3%2B+cells+in+BDC2.5NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice.</a> Immunology. 121, 565-576 (2007).</li>
<li>Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonobese+diabetic+scid+mouse%3A+model+for+spontaneous+thymomagenesis+associated+with+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).</li>
</ol>

すべてのマウスは、ペンシルベニア州立大学の動物実験のガイドラインに準拠し、委員会を設置し、使用中の薬の特定病原体フリー（SPF）施設のペンシルベニア州立大学で飼育した。 著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

T1Dは、糖尿病のNODマウスの糖尿病又はT細胞クローンに由来するTCRトランスジェニックマウスからの脾臓細胞全体またはT細胞サブセットの養子移入することにより効率を変化させることで、レシピエントマウスに誘導することができる。我々はここにNOD.SCIDマウスにFACS精製CD62L + BDC2.5ジェニックCD4 + T細胞を転送することにより、100％の発生率で2週間以内に、レシピエントマウスにT1D誘導するための再現性のある方法を報告する。 BDC2.5 T細胞伝達モデルの特定の利点は、自発的な糖尿病カ月、最大糖尿病誘発T細胞サブセットまたはT細胞クローンによる糖尿病の転送のために数週間に比べT1Dの非常に短い誘導時間を含み、ここで説明した。また、その均一性に起因し、BDC2.5トランスジェニックT細胞を精製したわずかな数は、高効率及び一貫性T1D転送するために必要とされる。従来のtraにBDC2.5ジェニックT細胞のin vitroでの活性化のいくつかの他の T細胞転送方法とは対照的に、nsfer...

NODマウスは、自発的に自己免疫性糖尿病を発症し、広く人間T1D 1,2のための動物モデルとして使用されている。 NODマウスにおけるT1Dの病因は、T細胞とB細胞が続き、樹状細胞やマクロファージによるランゲルハンスの膵島の、生後3-4週で始まる、浸潤によって特徴付けられる。非破壊ペリ膵島炎のこの段階では、3歳の4〜6ヶ月まであからさまな糖尿病になり、インスリン産生膵β細胞の遅い、進行性の破壊につながる。 4,5脾細胞、CD4 +糖尿病NODマウスからの6,7またはCD8 + 8,9 T細胞の転送は、膵島反応性T細胞がT1D病因において中心的な役割を果たすことを示す、免疫不全NODマウスにおいて糖尿病を媒介することが示されている。実験条件に応じて、糖尿病は、これらの研究で数週間にわたって、徐々にレシピエントマウスで開発された。同様に、様々なT細胞クローンは時間とコストがかかることによって導出糖尿病誘発T細胞の培養は、数週間レシピエントマウス7,10への移行後に糖尿病を媒介することが報告されている。 CD4-CD8または拘束性糖尿病誘発T細胞クローンに由来するTCRを発現するトランスジェニックマウスの可用性と、いくつかの研究室は、その後、例えば、マウスからの脾臓T細胞は、レシピエント11-13に糖尿病を転送することができたことを示している。具体的には、BDC2.5 NODマウスは、クロモグラニンA、膵β細胞におけるタンパク質14-16に特異的なTCR BDC2.5、トランスジェニックである。あからさまに糖尿病または前糖尿病BDC2.5マウスからin vitroで活性化または非活性化の全体または画し脾臓細胞での転送効率を11,17-19を変えることで、新生児や免疫不全NODマウスに糖尿病を譲渡。 私たちは、精製されたトランスジェニックCD4を利用し簡単な方法+高効率とconsisteでレシピエントマウスにT1D誘導する前糖尿病BDC2.5マウスからT細胞を記述NCY。トランスジェニックTCRVβ4鎖を発現するナイーブ、膵島抗原特異的CD4 + T細胞はCD4ための蛍光活性化細胞選別（FACS）によって、これらのマウスから単離され+ CD62L + T細胞の多数。精製されたトランスジェニックT細胞を、次いで、官能性T細胞およびB細胞を欠き、膵島炎および糖尿病フリー20アールNOD.SCIDマウスに活性化せずに転送される。レシピエントマウスはT細胞移入後2週間以内に急速に発達T1Dを示す尿糖濃度の上昇のために監視されています。 他の方法とは対照的に不均一な特異性を有する糖尿病誘発性T細胞を移すことを、我々のプロトコルは、FACSソートしたCD4 +ほぼ独占的に糖尿病BDC2.5 TCRを発現したT細胞を使用しています。彼らの均質性に起因して、移入されたT細胞（〜1×10 6細胞/マウス）のほんの数は100％の発生率で2週間以内に急速T1D開発のために必要とされる。我々のプロトコルの別の利点は、irradiatioあるレシピエントマウスのnが、それはいくつかの他の方法のためにあるようにする必要はありません。この方法の潜在的な制限は、糖尿病の両方のCD4とCD8 T細胞サブセットまたは特にCD8 T細胞の寄与の調査を許可していないということです。 記述されたプロトコルは、ナイーブ、単一特異的CD4 +標的臓器への膵島抗原特異Th細胞のホーミングに介入するT細胞と同様に、治療戦略により仲介急速T1D開発を研究するために有用であろう。

<table><tbody><tr><td>BDC 2.5 TCRトランスジェニックNODマウス(NOD.CG-TG(TCR&アルファ;BDC 2.5、TCR&#946;BDC 2.5)</td><td>JAX</td><td>004460</td><td></td></tr><tr><td>NOD.SCIDマウス(NOD.CB17-Prkdcscid/J)</td><td>JAX</td><td>001303</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Themo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Bayer Diastix</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM2803</td><td></td></tr><tr><td>15 ml コニカルチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>50 ml コニカルチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>滅菌外科用ピンセット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み小型ペアハサミ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み大型ペアハサミ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m細胞ストレーナー</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu;m細胞ストレーナーキャップチューブ</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer</td><td></td><td></td><td>0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2</td></tr>O <tr><td>BD FACSFlowTM シース液</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FACS 染色緩衝液</td><td></td><td></td><td>PBS、0.2 mM EDTA、0.5% BSA/FCS、フィルター滅菌</td></tr><tr><td>位相差顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗CD4 (APC) mAb</td><td>バイオレジェンド</td><td>1005616</td><td>クローン RM4-5</td></tr><tr><td>抗TCR V&#946;4 (FITC) mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>553365</td><td>クローン KT4</td></tr><tr><td>抗CD62L (PE) mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>553151</td><td>クローン MEL-14</td></tr><tr><td>セルソーター</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>e.g. BD FACSAria III</td></tr><tr><td>ヒートランプ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウス レストレイン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml シリンジ</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>18-1&frac12; ゲージ針 (滅菌)</td> <td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>27&frac12; ゲージ針 (滅菌)</td> <td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr></tbody></table>

糖尿病cd4の養子移入+ t細胞によるマウスの加速された1型糖尿病の誘導

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

非肥満糖尿病（NOD）マウスは自発的に生後12週間後に自己免疫性糖尿病を開発し、人間の1型糖尿病（T1D）の中で最も広範囲に研究の動物モデルである。照射レシピエントマウスでセル転送研究はT細胞が、このモデルでT1D発症に極めて重要であることを確立した。我々は、本明細書に急速に精製され、プライマリCD4 +膵島特異的T細胞受容体（TCR）NOD.SCIDレシピエントマウスへのBDC2.5トランスジェニック前糖尿病NODマウス由来のT細胞の養子免疫伝達によってT1D誘導するための簡単​​な方法を述べる。糖尿病誘発T細胞の単離および養子移入は、同じ日以内に完了することができるこの技術の主な利点は、受信者の照射が必要とされないし、T1Dの高い発生率は、T細胞の転送後2週間以内に誘発される。したがって、T1Dにおける病因および治療介入の研究では、不均一なT細胞集団またはクローンに頼る方法よりも速い速度で進むことができます糖尿病NODマウス由来。

我々の結果は、このような膵臓リンパ節などの二次リンパ器官への家へのT細胞のために重要であるCD62Lを発現するトランスジェニックBDC2.5細胞の単離を示す。今回の知見は、さらに急速に転送し、効率的にNOD.SCIDレシピエントマウスにT1Dにするには、この単一特異的T細胞集団の強力な能力を実証する。 糖尿病CD4 + BDC2.5マウス由来のT細胞の単離は、図2に示されている。プールした脾臓およびリンパ節から約5×10 7個の細胞を、細胞選別前のドナーマウス当たり得た。フローサイトメトリーソート続いて、〜2.5×10 6個のトランスジェニックナイーブCD4 + T細胞（CD4 + TCRVβ4+ CD62L +）が表示されたゲーティング戦略を使用して、各BDC2.5ドナーマウスから得た。 CD4 + TCRVβ4+ CD62L +細胞（〜1×10 6細胞/マウス）の少数の予想どおり、養子移入すべてNOD...

私たちは、膵島抗原特異、プライマリーCD4 + T細胞の養子移入によって2週間以内に、マウスにおける1型糖尿病（T1D）を誘導するための再現可能な方法を提供する。

糖尿病CD4の養子移入+ T細胞によるマウスの加速された1型糖尿病の誘導

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

この手順の全体的な目的は、内因性のT細胞およびB細胞を欠損したマウスに、トランスジェニックマウスから糖尿病誘発性T細胞を移入することで、マウスに1型糖尿病を迅速に誘導することです。まず、ドナーマウスから脾臓とリンパ節を採取し、CD4陽性T細胞を精製します。次に、精製したドナーT細胞をnon-SKIDレシピエントマウスに養子移入します。その後、レシピエントマウスに1型糖尿病を発症するかどうかをモニターします。最終的に、このプロトコルは、他の手法と比較して、糖尿病の病態生理の研究や治療的介入の検討に利用できます。non-skidレシピエントにBDC 2.5 CD4陽性T細胞を移入するこの技術の主な利点は、1型糖尿病を迅速かつ再現性高く発症させられることです。Diabetogenic CD4陽性T細胞のドナーとして、尿糖測定により糖尿病ではないことが確認された、6週齢の糖尿病前段階の雌性BDC 2.5マウスを使用します。脾臓およびリンパ節を摘出するために、被毛に70% ethanolを浸し、皮膚を切開して前肢の筋肉が露出するまで皮膚を後退させます。前肢の付け根付近に、左右それぞれ2つのリンパ節が確認できます。小さなピンセットで各リンパ節を慎重に把持し、結合組織を切り離して摘出します。次に、小剪刀を用いて腹膜に1インチの切開を加えます。次に、脾臓の中央をそっと掴みます。結合組織と付着した脂肪を慎重に切り除いてください。その後、脾臓を取り出し、脾臓とリンパ節を氷上の10 millilitersのDMEMで洗浄します。滅菌済みの10 milliliterシリンジのプランジャーの端を用いて、リンパ組織を70 micrometerのセルストレーナーにそっと押し通します。これにより、単細胞懸濁液を得ます。細胞の回収率を最大にするため、各ストレーナーを1 mLのDMEMで数回洗浄します。その後、回収した細胞を15 mLのコニカルチューブに移し、400 Gsで7分間遠心分離します。室温で、細胞ペレットを3 mLのCKバッファーで再懸濁します。室温で5分間インキュベートします。赤血球を除去するため、12 mLのDMEMを加え、遠心分離により細胞をペレット化します。細胞ペレットを10 mLのDMEMで1回洗浄します。次に、細胞を5 mLのFACT染色緩衝液に懸濁し、位相差顕微鏡と血球計数計を用いて生存細胞数をカウントします。その後、染色コントロール1つにつき約1×10⁶個の細胞を分取します。また、非活性化トランスジェニックCD4陽性T細胞をソートするため、マウスモノクローナル抗体で細胞を染色します。これらのすべてのサンプルを4 °Cの暗所で30分間インキュベートします。次に、染色液量の3倍の量のFACSバッファーで細胞を洗浄し、ソーティング用サンプルは1～2 × 10⁷ cells/mL、シングルステインコントロールは300 µLとなるようにFACSバッファーで細胞を再懸濁します。続いて、細胞サンプルを35 µmのセルストレイナー付きチューブに通します。細胞の凝集を除去するため、熟練したオペレーターによるセルソーターでのサンプル処理を行います。約1.5 × 10⁸個のトータルのトランスジェニックnaive CD4陽性T細胞をソートする場合、セットアップ時間を含めて約3時間を想定してください。マウス1匹あたり約2.5 × 10⁶個の細胞が回収でき、BD FACSAriaなどの装置におけるソート速度は約2 × 10⁴ events/secとなります。ソートした細胞は3 mLのDMEMに回収してください。ソートされた細胞の絶対数を記録し、7分間遠心分離します。400 Gsで、細胞ペレットを滅菌済みのリン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、養子T細胞移入に備えます。1 mLシリンジと18ゲージ針を用いて、FACS精製したCD4陽性T細胞を穏やかに再懸濁します。1 mLシリンジに充填し、注入の準備として、27.5Gの針をシリンジに取り付けます。ノックアウト受容マウスを固定し、注射部位を消毒するために尾を70% ethanolで拭きます。その後、精製したCD4陽性T細胞の1×10⁶個を、各マウスのいずれかの側尾静脈に注入します。尾静脈注射を行う際は、プランジャーを無理に押し込まないようにしてください。針が正しく静脈に入っていれば、ほとんど抵抗なく注入できるはずです。T細胞移植の5日後から、NOD skidレシピエントマウスに1型糖尿病を発症していないか毎日観察してください。製造者の指示に従い、試薬ストリップを用いて尿糖を測定します。2回連続で尿糖値が250 mg/dLを超えたマウスを糖尿病と判定します。典型的な実験では、1匹のBDC 2.5ドナーマウスから、セルソート後に約2.5×10⁶個のナイーブ導入遺伝子CD4陽性T細胞が得られます。糖尿病誘発性CD4陽性T細胞を養生的移入した後、マウスの尿糖濃度をモニタリングしました。BDC 2.5ドナーマウスから少数の細胞を養子移植したところ、すべてのnon-skidレシピエントにおいて11日目までに1型糖尿病が誘導されました。適切に行えば、この手法は臓器採取からT細胞移植まで約8時間で完了させることができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々のプロトコルは、きれいに、簡単にマウスの腎被膜下膵島または細胞を提供するために開発されました。細胞は、腎臓の被膜下に細胞を移植に使用される最終的なチューブのペレットに集中している。このテクニックの使いやすさは、細胞とマウスへのストレスを軽減。...

糖尿病マウスの腎臓のカプセルに膵島の移植

我々は、ヘルパー依存性アデノウイルスベクター（HDAd）と高血糖の反転を用いた遺伝子Neurogenin3の転送（Ngn3）とベータセルリン（BTC）によりSTZにおける肝ネオ膵島形成（ストレプトゾトシン）誘発糖尿病マウスを記述します。我々の方法は、生体内伝達および長続きが遺伝子発現におけるそれらの高効率を持つヘルパー依存型アデノウイルスベクターの機能を活用できます。...

ヘルパー依存型アデノウイルスベクターによる遺伝子導入による糖尿病マウスの肝臓におけるネオ·膵島形成

このビデオは、非肥満の糖尿病性免疫不全マウスに移植されたルシフェラーゼ発現ベータ細胞を視覚化するイメージングベースの方法を示しています。糖尿病マウスからの脾細胞の導入は、進行性のベータ細胞の破壊をもたらし、基質導入後の発光の低下によって視覚的に確認されます。...

糖尿病性脾細胞を惹起した免疫不全マウスにおけるトランスジェニックβ細胞のイメージング

ここでは、同系CD4+CD45RB高T細胞をT細胞およびB細胞欠損レシピエントに養子として移すことにより、マウスに結腸炎症を誘発するプロトコールを提示します。臨床的および組織病理学的特徴は、ヒトの炎症性腸疾患を模倣しています。この方法により、結腸性炎症の開始と疾患の進行の研究が可能になります。...

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞

自己免疫性糖尿病モデルにおける機能試験用抗原特異的一次マウス細胞傷害性T細胞の高効率生成

このプロトコールでは、腸内微生物叢抗原特異的T細胞養子移入大腸炎モデルが記載されている。CD4+ T細胞は、CBir1...

免疫不全マウスへのCBir1 TCRトランスジェニックCD4+ T細胞の養子移入による腸管炎症の誘導

このプロトコルは、非肥満糖尿病(NOD)重症複合免疫不全マウスにNIT-1細胞を移植およびイメージングするための簡単で低侵襲な方法を説明しています。...

マウスにおける自己免疫性糖尿病の養子移植モデルにおける移植片生存の生物発光モニタリング

私たちは、免疫不全マウスへのヒト幹細胞由来膵幹細胞膵島の筋肉内移植のための低侵襲プロトコルを提供し、 生体内...

マウスにおけるヒト多能性幹細胞由来膵臓内分泌細胞の筋肉内移植

HIV感染細胞にナチュラルキラー細胞溶解反応を測定するために細胞毒性のアッセイは、標的細胞の純度によって制限されます。ここでは、CD4をダウンモジュレートするHIV - 1の能力を活用することにより、HIV -...

ナチュラルキラー細胞傷害性アッセイにおけるHIV - 1感染プライマリCD4 + T細胞を標的細胞としての準備と使用

特定のマウス系統では、ミエリン塩基性タンパク質で実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の誘導に抵抗することができます。ここで説明するには、無反応を逆にし、いくつかの典型的なEAE耐性マウスの汚れに麻痺性疾患を引き起こす単純な予防接種プロトコルです。...

移入、抗原チャレンジにより実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）抵抗性マウス系統の応答がないことを克服する

学ぶCD4+T細胞の養子移入によるマウス1型糖尿病誘導法。BDC2.5トランスジェニックマウスからT細胞を単離し、NOD.scid受容体に移入することで2週間以内に糖尿病を発症させる再現性の高い手法です。

糖尿病CD4の養子移入+ T細胞によるマウスの加速された1型糖尿病の誘導

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