糖尿病CD4の養子移入+ T細胞によるマウスの加速された1型糖尿病の誘導
2013年5月6日
私たちは、膵島抗原特異、プライマリーCD4 + T細胞の養子移入によって2週間以内に、マウスにおける1型糖尿病（T1D）を誘導するための再現可能な方法を提供する。
この手順の全体的な目標は、トランスジェニックマウスからの糖尿病性T細胞を内因性T細胞およびb細胞を欠くマウスに移すことにより、マウスに1型糖尿病を迅速に誘発することです。まず、ドナーマウスから脾臓とリンパ節を採取し、CDの4つの陽性T細胞を精製します。次に、精製したドナーT細胞をノンスキッドレシピエントマウスに養子として移します。
次に、レシピエントマウスの1型糖尿病の発症を監視します。最終的に、このプロトコルは、糖尿病の病因を研究し、他の方法と比較して治療的介入を調査するために使用できます。BDC 2.5、CD 4陽性T細胞をノンスキッドレシピエントに転写するこの技術の主な利点は、1型糖尿病の迅速かつ再現性のある発症です。
糖尿病性 CD のドナーの場合、4 つの陽性 T 細胞は、尿グルコース測定によって糖尿病がないと判断された 6 週齢の糖尿病前雌 BDC 2.5 マウスを使用します。脾臓とリンパ節を切除するには、毛皮を70%エタノールに浸してから皮膚をカットし、前肢の筋肉が露出するまで皮膚を引っ込めます。前肢の付け根近くに、両側の2つのリンパ節が見えるはずです小さなピンセットで各リンパ節を慎重につかみ、結合組織をトリミングして取り除きます。
次に、小さなハサミを使用して腹膜に1インチの切開を行います。次に、中央の脾臓をそっとつかみます。結合組織と付着した脂肪を慎重に切り取ります。
次に、氷上のDMEMの10ミリリットルで脾臓、レース、脾臓、リンパ節を取り除きます。滅菌済みの10ミリリットルシリンジプランジャーの最後に、70マイクロメートルのセルストレーナーを通してリンパ器官を優しく押します。単一細胞懸濁液を得るため。
各ストレーナを1ミリリットルのDMEMで数回すすぎ、細胞の回収を最大化します。次に、収集した細胞を15ミリリットルの円錐管に移し、400Gで7分間遠心分離します。室温で、細胞ペレットを3ミリリットルのCK緩衝液に再懸濁します。
次に、室温で5分間インキュベートします。赤血球を灰汁にするには、12ミリリットルのDMEMを追加し、遠心分離によって細胞をペレット化します。細胞ペレットをDMEM10ミリリットルに1回洗浄します。
次に、細胞を5ミリリットルのファクト染色バッファーに懸濁し、位相差顕微鏡とヘモサイトメーターを使用して生細胞の数をカウントします。次に、染色コントロールごとに6つの細胞のうち約10倍を除去します。また、マウスモノクローナル抗体で細胞を染色し、非活性化トランスジェニックCDの4陽性T細胞を選別します。
これらすべてのサンプルを摂氏4度で暗所で30分間インキュベートします。次に、ファックスバッファーの3倍の染色量で細胞を洗浄し、ファックスバッファー内の細胞を10の1〜2倍、サンプルの選別には1ミリリットルあたり7細胞、シングルステインコントロールには300マイクロリットルを再懸濁します。次に、細胞サンプルを35μmのセルストレーナキャップチューブに通します。
細胞塊を除去するには、訓練を受けたオペレーターと細胞ソーターのためのサンプルを処理し、セットアップ時間を含む約3時間、約1.5倍10から8番目の合計トランスジェニックナイーブCD4陽性T細胞をソートする。BD Fox Ariaのような装置では、マウスあたり6個の細胞のうち10個の約2.5倍、ソートレートは1秒あたり4番目のイベントの10の約2倍になると予想できます。選別した細胞を3ミリリットルのDMEMに集めます。
選別された細胞の絶対数を記録し、7分間遠心分離します。400 Gsで、細胞ペレットを滅菌リン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、養子T細胞移植を行います。18ゲージの針に1ミリリットルの注射器を使用して、ファックス精製したCDの4つの陽性T細胞を静かに再懸濁します。
1ミリリットルのシリンジをセットし、注射の準備として、シリンジに27ポイントハーフゲージ針を取り付けます。ノットスキッドレシピエントマウスを拘束し、70%エタノールで尾を拭いて注射部位を消毒します。次に、マウスごとに6つの精製CDのうち10分の1、4つの陽性T細胞を外側尾静脈のいずれかに注入します。
尾静脈注射を行うときは、プランジャーを無理に押し込まないように注意してください。針が実際に静脈内にある場合、T細胞移植の5日後から、注射はほとんど抵抗なく行われるはずです。1型糖尿病の発症について、うなずきスキッドレシピエントマウスを毎日監視します。
試薬ストリップを使用して、メーカーと指示に従って尿糖を測定します。250ミリグラム/デシリットルを超える2回連続した尿糖値を持つマウスは、糖尿病と見なされることに注意してください。.典型的な実験では、各BDC 2.5ドナーマウスは、糖尿病性CDの4つの陽性T細胞の養子移植後の細胞選別後の6つのナイーブトランスジェニックCD陽性T細胞のうち10倍約2.5倍を収め、マウスの尿グルコース濃度についてモニターした。
BDC 2.5ドナーマウスからの少数の細胞の養子移植は、11日目までにすべてのノンスキッドレシピエントで1型糖尿病を誘発しました。適切に行えば、この技術は臓器摘出からT細胞移植まで約8時間で行うことができます。
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概要
本記事では、膵島抗原特異的な一次CD4+ T細胞の養子移植により、2週間以内にマウスに1型糖尿病（T1D）を誘発させる再現可能な手法を紹介します。このプロトコールによりT1Dを迅速に発症させることが可能となり、糖尿病の病態生理や治療介入に関する研究を促進します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 免疫学
- 糖尿病研究
- トランスジェニックマウスモデル
背景
- 1型糖尿病は、インスリンを産生するβ細胞の破壊を特徴とする自己免疫疾患である。
- 1型糖尿病のメカニズムを理解することは、より優れた治療戦略につながる可能性がある。
- 現在の1型糖尿病の誘導法は、時間がかかり、ばらつきが生じる可能性がある。
- 本研究は、研究のためのより効率的なモデルを提供することを目的としている。
研究の目的
- マウスにおいて、迅速かつ再現可能なT1D誘発法を開発すること。
- 糖尿病の病態生理の研究を促進すること。
- T1Dに対する潜在的な治療的介入を探索すること。
使用した手法
- ドナーマウスから脾臓およびリンパ節を採取する。
- 採取した組織からCD4+ T細胞を精製する。
- 精製したT細胞を、内因性T細胞およびB細胞を欠損したレシピエントマウスに養子移入する。
- レシピエントマウスにおいて1型糖尿病を発症するかをモニタリングする。
主な結果
- この手法により、レシピエントマウスにおいて2週間以内にT1Dを誘導することに成功した。
- 糖尿病発症における再現性が実証された。
- 糖尿病の病態生理におけるCD4+ T細胞の役割についての知見が得られた。
- 治療介入に関するさらなる研究を促進した。
結論
- このプロトコールは、マウスにおいてT1Dを研究するための信頼性の高いアプローチを提供します。
- 糖尿病の根底にあるメカニズムを調査するために利用可能です。
- 本手法により、T1Dに対する新しい治療法の開発が促進される可能性があります。
よくある質問
産業界への適用性
精製された膵島特異的CD4+ T細胞の養生的転移によるNOD.SCIDマウスへの1型糖尿病の迅速な誘導は、疾患メカニズムの評価および治療的介入の検討を加速させます。このモデルは、自己免疫性糖尿病研究において再現性が高く時間効率の良いシステムを提供することで、初期の発見およびメカニズム的なリスク低減を合理化します。本アプローチは、前臨床免疫学パイプラインにおける実験的なばらつきとサイクルタイムを短縮し、ポートフォリオの意思決定を支援します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見とターゲットバリデーション
- β細胞破壊を駆動する自己免疫メカニズムの直接的な検証を可能にする。
- 糖尿病誘発性T細胞ターゲットのin vivoにおける機能的検証を促進する。
- T1Dにおけるターゲットとパスウェイの関係性に対する予測の信頼性を向上させる。
- 初期段階のポートフォリオにおける免疫調節戦略の選別を加速させる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 候補となる介入策を評価するための、標準化された迅速発症のin vivoシステムを提供する。
- 再現性のある疾患誘導を実現し、アッセイの信頼性と比較可能性を担保する。
- 尿糖閾値による糖尿病発症の定量的なモニタリングを可能にする。
- 後続の化合物スクリーニングワークフローに向けて、検証済みの動物モデルを調製する。
トランスレーショナル・前臨床研究
- ヒトの1型糖尿病（T1D）で観察される疾患関連の免疫メカニズムと一致している。
- メカニズムの解明から前臨床的な治療検証までの連続性をサポートする。
- リスク調整後の推進決定に不可欠なデータを得るまでの時間を短縮する。
- 制御された疾患誘導を可能にすることで、バイオマーカーの開発を促進する。
パイプラインおよびワークフローの統合
この養導入モデルは、in vivoで自己免疫性糖尿病を迅速かつ再現性高く誘導することを可能にし、初期の発見から前臨床検証までの橋渡しをします。
- 探索生物学： T細胞介在性のベータ細胞破壊および免疫経路の関与に関する仮説検証を支援します。
- スクリーニング： 免疫調節化合物およびバイオ医薬品を評価するための堅牢なプラットフォームを提供します。
- 分析： 尿糖測定を用いて、疾患の発症と進行の定量的な読み取りを可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 前臨床段階の継続性を確保するため、ヒトの疾患メカニズムとの整合性を促進します。
- エンタープライズ再利用： 免疫学の研究チーム間で適応可能な、スケーラブルで即日完結のワークフローを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：T細胞駆動性糖尿病モデルにおける予測の信頼性とターゲット検証を向上させます。
- 運用上の価値：プロトコルの所要時間を短縮し、放射線を排除することで、スループットと再現性を向上させます。
- 戦略的価値：免疫学資産および治療候補薬に関するgo/no-go判断の迅速化を可能にします。
- ポートフォリオへの影響：迅速かつ信頼性の高いin vivo有効性データを提供することで、リスク調整後の優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- T細胞の分離、フローサイトメトリー、および動物取り扱いの専門知識が必要です。
- セルソーターおよび認定済みの動物実験施設へのアクセスが必要です。
- 細胞調製および糖尿病モニタリングプロトコルのチーム間での標準化が求められます。
- 他の自己免疫モデルへ適応させる場合は、プロトコルの最適化が必要になる可能性があります。
- 免疫不全のレシピエント系統および膵島特異的TCRトランスジェニックドナーに限定されます。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:05
Title
1:11
Isolation of T Cells from Spleen and Lymph Nodes of BDC2.5 Mice
2:52
Fluorescence-activated Cell Sorting of Diabetogenic CD4+ T Cells from BDC2.5 Mice
4:28
Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells from BDC2.5 Mice
5:12
Monitoring Recipient Mice for Hyperglycemia and T1D
5:36
Results: Adoptive T-cell Transfer
6:10
Conclusion
