ハイスループットマイクロプレートアッセイを用いてウォーターズ、土壌、および底質中の微生物細胞外酵素活性の測定

本手順の全般的な目的は、さまざまな自然環境における微生物の細胞外酵素活性を迅速に測定することです。これは、水サンプルまたは土壌スラリーをマイクロプレートに添加し、十分な反復数を確保することで達成されます。第二のステップとして、マイクロプレートのウェルに人工的な比色または蛍光基質を添加し、酵素反応を進行させます。次に、吸光度または蛍光を測定し、反応中に放出された最終産物の量を決定します。

結果は、最終反応の吸光度または蛍光に基づいたサンプル間の細胞外酵素活性の差を示しています。本日は、自然環境における細胞外酵素活性の測定方法について実演します。この手法は、土壌、堆積物、および水域における有機物処理速度や栄養塩の無機化など、微生物生態学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。一般的に、この手法を初めて用いる方は、特に大量のサンプルを分析する場合、粒子と反応溶液の分離が困難であるため、苦労することがあります。

プレートのレイアウトを習得することは困難であり、また複数のタイムステップで測定を行うことで手順がより複雑になるため、本手順の視覚的なデモンストレーションが極めて重要です。土壌および堆積物における細胞外酵素活性の比色分析は、まず、テキストプロトコルに記載されている基質緩衝液および標準溶液の調製から開始します。土壌については、分析対象の各サンプルのスラリーを滅菌済みの15 milliliter遠心チューブに調製します。堆積物の場合は、50 millimolar酢酸緩衝液を用いて、濃度を約1 g/mLに調整して添加します。

スラリーを簡単にピペッティングできるよう、十分な量の酢酸緩衝液を加えます。必要なスラリーの正確な量は、分析する酵素の数によって異なりますが、最低5 mLを推奨します。土壌や堆積物の塊がすべて分散するまで、各スラリーをボルテックスします。

最終容量に注意してください。ピペット操作の前に、ハサミでピペットチップの先端を切断します。土壌懸濁液はチップを詰まらせやすいため、各懸濁液を再度ボルテックスし、直ちに6つのウェルそれぞれに150 µLずつ分注してください。

96ウェルディープウェルブロックを用いて行います。十分に、かつ頻繁にボルテックスすることが重要です。土壌粒子を懸濁状態に保つため、基質コントロールとして1ブロックあたり少なくとも2つのウェルを空けておいてください。

分析する各酵素に対して、96ウェルブロックを1つずつ準備します。酢酸バッファーを約5 mLピペットリザーバーに注ぎ、8チャンネルピペッターを使用して、各サンプルの最後の2ウェルにバッファーを150 µLずつ加えます。

サンプルバッファーコントロールおよび2つの基質コントロールウェルに添加します。適切なp-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド（PNP）基質溶液を約10 millilitersピペットリザーバーに注ぎ、8チャンネルピペッターを用いて、各サンプルの最初の4ウェルと2つの基質コントロールウェルに基質溶液を150 µLずつ加えます。基質溶液を添加した直後の、反応開始時刻を記録してください。

プレートを室温で0.5〜4時間インキュベートします。正確なインキュベーション時間は、サンプルの活性レベルおよび測定する酵素によって異なります。アッセイのインキュベーション中に、透明な96ウェルマイクロプレートを1枚準備します。

吸光度を測定するため、各ディープウェルブロックのマイクロプレートの各ウェルに、蒸留水 190 µL と 1 M 水酸化ナトリウム 10 µL をピペットで分注します。水酸化ナトリウムは酵素反応を遅延させ、pHを上昇させることで、インキュベーション後の反応中に放出されたPNPの色を濃くします。96ウェルブロックを 2000 ～ 5,000 ×g で5分間遠心分離し、土壌粒子を沈殿させます。

ペレットを乱さずに液相を除去することは困難な場合があります。最初に使用する土壌サンプルの量を多くしすぎないようにしてください。十分な時間遠心分離を行い、慎重かつ迷いのない動作で液を吸引してください。

マルチチャンネルピペットを使用し、ペレットを避けながら、各ウェルから100 µLを分取します。液体を準備済みの透明な96ウェルマイクロプレートの対応するウェルに転移させます。マイクロプレートリーダーの電源を入れ、必要なソフトウェアを設定します。410 nmでの吸光度を測定します。テキストプロトコルに記載されているサンプルの乾燥質量の決定後、サンプルアッセイの吸光度からサンプルコントロールの吸光度を差し引くことで、各サンプルの最終吸光度を算出します。

基質コントロールの吸光度が0.060より高い場合は、その値を差し引いてください。また、以下の式を用いて、乾燥重量1gあたり1時間あたりのマイクロモル数として酵素活性を算出します。テキストプロトコルに示されている例に従って、各酵素用にブラックマイクロプレートを準備し、最初の水サンプル約5 mLをピペットリザーバーに注ぎ、8チャンネルピペッターを使用して、すべてのウェルに200 µLずつ分注してください。

マイクロプレートの1列目に、使用済みのピペットチップを廃棄し、1列目から9列目までが埋まるまで、各水サンプルに対して必要に応じてこの操作を繰り返します。サンプル、標準物質、基質、およびクエンチングを考慮したコントロールを、サンプルと同じ黒色マイクロプレート上に設定します。サンプルコントロールにはサンプル水と重炭酸緩衝液が含まれており、活性の計算には使用しませんが、実験期間全体を通じた読み取りの整合性を実証するために用います。

クエンチコントロールは、サンプル水と標準量の蛍光タグで構成され、蛍光の回折を測定するために使用されます。サンプル水基質および標準コントロールは、それぞれ基質結合体または標準蛍光タグと重炭酸緩衝液で調製します。5 mMの重炭酸緩衝液を約5 mL、清潔なピペットリザーバーに注ぎます。

d行およびe行の1番から9番のマイクロプレートウェルに、バッファーを50 µLずつ分注し、サンプルあたり2つの複製コントロールウェルを作成します。ピペットチップを交換し、A行およびH行の10番から12番のウェルに重炭酸バッファーを200 µL転送します。本デモンストレーションでは撮影のために照明を明るくしていますが、蛍光標準物質は光に敏感であるため、照明を落とすか消灯して周囲の光を減らす必要があります。約5 mLの10 µM 4-メチルムニロン（MUB）を清潔なピペットリザーバーに注ぎ、H行の1番から12番のマイクロプレートウェルに50 µLずつ分注します。次に、G行およびF行の1番から9番のウェルに50 µLずつ分注し、サンプルあたり3つの複製クエンチコントロールおよび全体的な標準コントロールを作成します。MUBの光分解を抑えるために、マイクロプレートを暗所に置くか不透明な蓋で覆い、フルオリメーターの電源を入れて、基質を添加する前に読み取り準備が整うよう必要なソフトウェアを設定します。

適切なMUBライニング基質を約5 mL、清潔なピペットリザーバーに入れます。12チャンネルピペットを用いて、マイクロプレートのA行1〜12ウェル、およびB行とC行の1〜9ウェルに50 µLずつ分注し、各サンプルにつき3つの複製アッセイと3つの基質コントロールを作成します。その後、直ちに蛍光測定を行います。基質をマイクロプレートに添加した直後に初期蛍光値を読み取ります。測定後、マイクロプレートを室温で、暗所または不透明な蓋で覆った状態でインキュベートします。

MUBの光分解を抑制するためです。最大潜在酵素活性を測定するために必要なインキュベーション時間は、試料中の酵素濃度によって異なります。この濃度は未知であるため、試料をアッセイする前に、マイクロプレートを複数の時間ステップで測定する必要があります。

ほとんどの酵素において、1時間の間で10〜15分間隔で測定することが適切ですが、高濃度のサンプルの中には10分前にピークに達するものもあります。指定の間隔で、少なくとも1時間はマイクロプレートの蛍光読み取りを継続してください。読み取りの間は、必ずマイクロプレートに蓋をするか、暗所に保管してください。

各時間間隔における各サンプルについて、各時間間隔の平均初期サンプル蛍光、平均最終サンプル蛍光、平均標準蛍光、および平均クエンチコントロール蛍光を算出します。テキストプロトコルにある式を用いて、1時間あたり1ミリリットルあたりの酵素活性（m）を算出してください。

各タイムステップで算出された活性値を調べ、活性値が最大となったタイムステップから最終的な潜在的活性を決定します。活性値が上昇し続けている場合は、より後のタイムステップが必要になる可能性があります。また、ランの過程を通じて活性値が低下している場合は、タイムステップを短くして再度ランを行ってください。

土壌や水圏堆積物には、粒子の表面で増殖する付着微生物群集の結果として、通常、かなりのレベルの細胞外酵素活性が存在します。この図は、米国ミシシッピ州北部の3次河川の表層堆積物から得られた粒子のサイズによって、この活性がどのように変化するかを示しています。先行研究により、この河川の堆積物粒子上の細菌群集は、群集構造の分子解析に基づき、3つの異なるグループに分けられることが示されています。

0.063 mm粒子、0.125、0.25、および0.5 mm粒子、ならびに1 mm粒子上のそれらである。細胞外酵素活性のパターンの分析はこの結論を支持しており、PNP連結基質法を用いて測定した際、ホスファターゼは0.125、0.25、および0.5 mm粒子で同程度であったが、1 mmおよび0.063 mmの画分では大幅に高かった。β-グルコシダーゼやN-アセチルグルコサミニダーゼ（NAGase）などの他の酵素は、最も微細な粒子で同様のピークを示すが、1 mm粒子では上昇していない。

異なる酵素が異なる環境分布を示す可能性があること、および本アッセイを用いてそれを明らかにできることが強調されています。誤差棒が比較的小さいことは、堆積物における酵素活性の比色アッセイに再現性があり、統計解析に適していることを示しています。異なる環境試料を比較すると、天然水は土壌や堆積物（1gあたり）よりも、1mLあたりの細胞外酵素活性が低い傾向にあります。

そのため、MUB結合基質を用いて、これらの酵素を蛍光光度法で測定する必要があります。この図は、ホスファターゼ、β-グルコシダーゼ、およびN-アセチル-β-D-グルコサミニダーゼ（NAGase）の活性が水深に応じてどのように変化するかを示しています。米国ミシシッピ州北部の浅い湖において、この湖は栄養が乏しいことが知られており、それは有機化合物からリン酸を獲得するために微生物が産生するホスファターゼおよび関連酵素の活性が相対的に高いことからも示唆されています。

3つの酵素すべてにおいて、水面および水深50 cmで採取したアッセイサンプルは同様の活性を示しました。一方で、100 cmのサンプルでは活性が上昇していましたが、このサンプルは実質的に水底界面から採取されたものであり、サンプル中に含まれる堆積物粒子が、特にbeta gluccoおよびn AGAsで見られた高い活性の原因であると考えられます。PNP基質と同様に、エラーバーが小さいことは、わずか3回の繰り返し測定であっても、MUB基質を用いた蛍光光度アッセイの再現性が高いことを示しています。

水サンプルの酵素活性の単位はnmolの基質消費量であるのに対し、堆積物粒子の酵素活性の単位は、単位サイズあたりの値が同程度であるにもかかわらず、µmolの基質消費量であることに注意してください。これは、土壌や堆積物が天然水よりもはるかに高い細胞外活性を持つ傾向があるという事実を強調しています。また、MUB結合基質法の感度の高さと、習得した後は水サンプルの細胞外酵素活性を測定するためにこの手法を用いる必要性があることを示しています。

この手法を用いることで、1時間強で最大9つの水試料の酵素活性を測定できます。土壌や堆積物でこの手順を試みる際は、活性を乾燥重量ベースで表現できるよう、既知量の物質を使用することが重要です。このビデオを視聴することで、比色法または蛍光法を用いて、さまざまな自然環境における細胞外酵素活性を測定する方法を十分に理解できるはずです。