Name: ハイスループットマイクロプレートアッセイを用いてウォーターズ、土壌、および底質中の微生物細胞外酵素活性の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-01T09:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: 学ぶマイクロプレートアッセイによる微生物細胞外酵素活性の測定法。水、土壌、底質サンプルを用いたハイスループット分析で、微生物生態学の研究に有用です。

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この仕事の側面のための資金は、米国農務省の特定協力協定58-6408-1-595、国立科学財団（賞1049911）など、さまざまなソースから提供された。

土壌や堆積物中の細胞外酵素活性の比色分析 1。酵素活性の比色分析用基板及び緩衝溶液の調製<ol><li> 50ミリリットルの0.1M酢酸（2.87ミリリットル500mlの水で氷酢酸）を150 mlの0.1 M酢酸ナトリウム、およびH 2 Oを200mlの蒸留を混合することによって、50mMの酢酸緩衝液（pH 5.0〜5.5）を調製必要に応じて、0.1M酢酸で5.0〜5.5にpHを調整する。 </li><li>蒸留H 2 O中に1 M水酸化ナトリウム（NaOH）の溶液を調製</li><li> 50 mMの酢酸緩衝液中のPのNP-連結基質溶液を調製する。ホスファターゼをアッセイする50mM酢酸緩衝液中で5 mMのP NP-リン酸を準備し、β-グルコシダーゼは5 mMのP NP-β-グルコピラノシドを準備アッセイするナガセは2 mMのPNP-β-N-acetylglucosaminideを準備アッセイする。無菌15ミリリットルまたは50ml遠心チューブ内のすべての基質溶液を準備します。溶液は2〜3週間、4℃で保存することができる。 </li></ol> 2。 Pの NP濃度に吸光度を変換するための標準の決定<ol><li> 50mM酢酸緩衝液中のp-ニトロフェノールの標準溶液を調製する。濃度は、MM 0.025から1の範囲であるべきである。 </li><li>透明な96ウェルマイクロプレートへの転送各濃度の100μLの3回の反復を。各ウェルに、H 2 Oを蒸留10μlの1 M NaOHおよび190を添加する。 </li><li>マイクロプレートリーダーを用いて410nmでの記録的吸光度。 </li><li> 0.3による標準曲線で増殖濃度は、300μlの反応体積あたりのマイクロモルのp NPを取得します。 Pの NPのマイクロモル対吸光度の曲線をプロットします。曲線の傾きは、各酵素反応でのp NPの吸光度をμモルに関連するであろう変換係数（C）となる。 </li></ol> 3。酵素アッセイを実施<ol><li>土壌については、concentrで15mlの滅菌遠心管にアッセイされる各試料のスラリーを調製約1グラム/ミリリットル-1 50mM酢酸緩衝液を使用することのATION。堆積物については、スラリーを簡単にpipettable作るのに十分な酢酸緩衝液を追加します。必要なスラリーの正確な量は、アッセイの酵素の数に応じて異なるが、5ミリリットルの最小を推奨します。渦土壌や堆積物のすべての塊が分散し、最終容量に注意してまで、各スラリー。 </li><li>再渦各スラリーし、すぐに96ウェルディープウェルブロック（ 図1）上の6ウェルのそれぞれに150μlのピペット。これは、懸濁液中の土壌粒子を維持するために十分に、頻繁にボルテックスすることが重要である。基板制御として機能するために、空のブロックごとに少なくとも2つのウェルを残す。注意：土壌スラリーはヒントを詰まらせる傾向があるので、前にピペッティングをハサミでピペットチップの端をクリップする。アッセイすべき各酵素の1 96ウェルブロックを準備します。 </li><li>ピペットリザーバ内の酢酸緩衝液約5ミリリットルを注ぎ、Lに150μlのバッファーを追加するには、8チャンネルピペッターを使用各試料の2つのウェル（これらは、サンプルバッファコントロールなる）と2つの基板のコントロールとなるウェル（ 図1）はast </li><li>ピペットリザーバに適切なPのNP-基質溶液を約10ミリリットルを注ぎ、（ 図1）、各サンプルの最初の4つのウェルと2基板制御ウェルに基質溶液150μlを追加するには、8チャンネルピ ​​ペッターを使用しています。反応は、すぐに基質溶液を添加するとして始まり、時間に注意してください。 </li><li> 0.5〜4時間、室温（22℃）で培養する。正確なインキュベーション時間は、活性が試料中のレベルとアッセイされるべき酵素に依存して変化する。長瀬他の酵素は、&gt; 2時間のインキュベーション時間を必要とするのに対し、ほとんどの土壌や堆積物の場合は、ホスファターゼ、β-グルコシダーゼは、0.5〜1.5時間のインキュベーション時間を必要とする。 </li><li>アッセイは、吸光度の読み取りにマイクロプレート透明な96ウェルを準備インキュベートされている。 （ すなわち 、各Eに対する各ディープウェルブロックごとに1マイクロプレートを準備しますnzyme）アッセイした。ピペット10μlの1 M NaOHで、マイクロプレートの各ウェルに蒸留水190μL。注：NaOHを酵素反応を遅くし、NPは、反応中に放出されたpの色を強化し、pHを上昇させる。 </li><li>インキュベーション後、土壌粒子をペレット化し、5分間2,000〜5,000×gで96ウェルブロックを遠心する。 </li><li>ペレットを与えないように注意しながら、各ウェルから100μlのを撤回するマルチチャンネルピペットを使用して、準備明確な96ウェルマイクロプレートに対応するウェルに移す。 </li><li>マイクロプレートリーダーの電源をオンにし、必要なソフトウェアをセットアップします。 410 nmの吸光度を記録。特定のウェルの吸光度はプレートリーダーの直線検出限界を超えている場合、水と再測定値とそのウェル1:1に希釈する。吸光度は依然として高すぎる場合、アッセイは、より短いインキュベーション時間で繰り返されるべきである。 </li></ol> 4。サンプルの乾燥質量の決定<ol><li>各SAMPLのピペット1ミリリットル<html>予め秤量したアルミニウム製パンにEスラリー。 </li><li> 48時間75℃の乾燥炉内の乾燥と比較検討する。スラリーの1ミリリットルの土壌や堆積物の乾燥質量を得るために、この値から、パンの重量を差し引く。酵素アッセイにおいて、各ウェルに添加し、150μlの試料の乾燥質量を決定するために0.15の係数で乗算する。 </li></ol> 5。土壌や堆積物の乾燥質量あたりの酵素活性の計算<ol><li>サンプルアッセイ吸光度からサンプル制御吸光度を差し引くことにより、各試料の最終吸光度を計算します。基板のコントロールは高い吸光度（およそ&gt; 0.060）がある場合、また、それらを引きます。 </li><li> μモル時間で酵素活性を算出-1グラム乾燥質量を-1方程式から： </li></ol>酵素活性=最終吸光度/（C xのインキュベーション時間×サンプル乾燥質量） 天然水中の細胞外酵素活性の蛍光分析酵素活性の蛍光分析用基板、標準、およびバッファソリューション&gt; 1。準備TLE」 <ol><li>無菌に適切な基質を溶解させることによりMUB-連結基板（ 例えば 4-MUB-β-グルコピラノシド、4 - MUB -リン酸、4 - MUB-N-アセチル-β-D-グルコサミニド）の200μMの溶液を調製する（オートクレーブ処理）蒸留15mlの滅菌又はを50ml遠心管中のH 2 O。光を排除し、使用前に冷蔵庫に保存するためにアルミホイルでチューブを包みます。この方法で保存した場合の基板は、少なくとも1週間は安定であるべきである。 </li><li>滅菌蒸留H 2 O中の100μMの4 -メチルウンベリフェロンの原液を作ることでMUB標準を準備するストアは琥珀色、またはアルミホイルにくるまれた瓶の中に冷蔵した。使用直前に、酵素アッセイのために10μMの作業溶液を作るために、滅菌H 2 O中に1/10、100μMのストック溶液を希釈する。 </li><li>のNaHCO &lt;8.4gを溶解することによって100mMの重炭酸塩緩衝液のストック溶液を調製サブ&gt; 3 1 LH 2 O、オートクレーブに。酵素アッセイのための5mMの作業溶液を作製するために、必要に応じて、滅菌を H 2 Oに、この原液を1/20に希釈する。 </li></ol> 2。 96ウェル黒色マイクロプレート上の編成水試料<ol><li> 図2に示した例以下の各酵素のためのマイクロプレートを整理。十分な複製、標準、およびコントロールを可能にこの手順は1 96ウェル黒色マイクロプレート上で最大9水のサンプルのための単一の酵素の活性を測定できることに注意してください。 </li><li>ピペットリザーバーに最初のサンプルの約5ミリリットルを注ぎ、マイクロプレート（S）のカラム1のウェルの全てにμLpipette200する8チャンネルピペッターを使用しています。使用済みのピペットチップを破棄し、列1-9を埋めるために、各試料水のために必要に応じて繰り返します。 </li></ol> 3。サンプル、標準、急冷し、基板コントロールの設定<ol><li>標準試料を考慮して制御を設定サンプルと同じ黒色マイクロプレート（ 図2）のS、基板焼入れ。 </li><li>サンプルコントロールは試料水と重炭酸塩緩衝液を含んでおり、活動の計算に使用されていないが、実験の過程全体の一貫性を読んでデモンストレーションを行います。急冷コントロールは、サンプル水および蛍光タグの標準量からなり、試料水中の蛍光の回折を測定するために使用される。基板と標準コントロールは、基板結合またはそれぞれの標準蛍光タグ、および重炭酸塩緩衝液のどちらかで構成されています。 </li><li>きれいなピペットリザーバーに5 mMの重炭酸塩緩衝液約5ミリリットルを注ぐ。サンプルあたりのサンプルコントロールの2反復ウェルを形成する行DとEでのマイクロプレートウェルに緩衝液をピペット50μlの1〜9。チェンジピペットチップはその後10〜12行を通してウェルに重炭酸塩緩衝液200μlを移すAとH. </li><li>李調光またはオフにすることで、周囲の照明を減らす蛍光標準としてGHTSは光に敏感である。 </li><li>きれいなピペットリザーバーに10μMの4 - メチルウンベリフェロンの約5ミリリットルを注ぐ。クエンチサンプルあたりのコントロールと、全体的な標準のコントロールの3回の反復を形成する行GおよびFへのマイクロプレートウェルにピペット50μL行のH 1〜12、およびウェルに1〜9。暗闇の中でマイクロプレートを置くか、MUBの光劣化を低減する不透明な蓋をかぶせどちらか。 </li><li>蛍光光度計の電源を入れ、セットアップし、必要なソフトウェアを基質を添加する前に必ずお読み準備ができている。注：一部の蛍光光度電球は3分以上のウォームアップ時間が必要な場合があります。 </li><li>きれいなピペットリザーバに適切なMUB-連結基質（ 例えば 4-MUB -リン酸）を約5ミリリットルを注ぐ。各試料の3つの複製アッセイおよび3基板のコントロールを形成するために、1行のBおよびC 1〜9行Aの12を通ってマイクロプレートウェルに50μlのピペット、およびウェルにするために12チャンネルピペッターを使用してください。 ImmediatelYは、蛍光を記録し、4.1に進みます。 </li></ol> 4。記録蛍光<ol><li>直ちにマイクロプレートへの基質添加後の初期の蛍光を読む。蛍光を読んだ後、いずれかの暗いまたはMUBの光劣化を低減するために、不透明な蓋で覆われた中で（22°C）RTでマイクロプレートをインキュベートする。 </li><li>水サンプル中の最大の潜在的酵素活性を測定するために必要なインキュベーション時間は、試料内の酵素濃度に依存するであろう。アッセイを完了する前に、これが不明であるため、マイクロプレートは、複数の時間ステップで読み出されなければならない。ある種の酵素のための非常に高い活性を持つサンプルは10分前のピークかもしれないが、通常、1時間にわたって10〜15分間隔で読み取ると、多くの酵素が許容される。 </li><li>少なくとも1時間、ご指定の時間間隔で、マイクロプレートの蛍光を読み続ける。読書の間、マイクロプレートカバーや暗闇の中を保つようにしてくださいS。 </li></ol> 5。水の容量あたりの酵素活性の計算<ol><li>初期サンプル蛍光（ウェルDおよびE）を意味する、平均最終試料の蛍光（ウェルAC）、平均±標準蛍光（ウェルH10-11）、および平均は対照蛍光を消光（ウェル：各時間間隔で各試料について計算するFG）。 </li><li>各時間間隔については、ナノモル時間で酵素活性を算出-1 ml -1の式から： </li></ol>酵素活性=（サンプル平均蛍光 - 初期サンプル平均蛍光）/（（）HRの時間（x）を0.2ミリリットル（標準的な蛍光）×平均/制御蛍光を消光意味（標準的な蛍光/ 0.5モル）×平均） <ol start="3"><li>各時間ステップに対して計算活性値を調べてください。最も高い活性を持つ時間ステップからの最終的な潜在的活性を決定する。活性値が増加し続ける場合は、後の時間ステップが必要になることがあり、活性値が落ちた場合をthrougホウトランのコースは、より短い時間ステップで再度実行してください。最終的な活性は、基質が消費時間-1 -1ミリリットルのナノモルであるが、時間-1 Lは-1マイクロモルとして表現するためにスケールアップすることができます。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

土壌や堆積物中の微生物の細胞外酵素の様々な活性を測定することは、栄養無機化と有機物処理17の速度に有益な洞察を提供することができます。しかし、土壌はそれらの水分レベルで変化させることができるので、土壌の乾燥重量に対して活性を標準化することが重要である。これは単に、酵素活性を測定することを越えて（典型的には2日間の）追加の乾燥工程を必要とする。このように、瞬間的な結果の近くで提供する水試料中の酵素活性のアッセイとは対照的に、土壌や堆積物中の酵素活性の信頼できるアッセイは、数日かかる。いくつかの土壌については、それも乾燥手順以外に、追加のアッシング工程（500℃、典型的には2時間）を必要とする、有機物又は灰分フリー乾燥重量のグラム当たり活性を発現することがより適切であり得る。関係なく、土壌または堆積物の酵素活性の比色アッセイにおいて最も重要な工程は、ディープウェルブロックfからの上清の撤退であるインキュベーション期間の終了時に、遠心分離をollowing。この手順では、吸光度を測定することに依存しているため、最終的なマイクロプレートのいくつかの浮遊土壌粒子であっても存在が誤った結果につながることができます。自体ははるか...

細菌や真菌などの微生物は、細胞外酵素の産生を介して複雑な有機化合物からの栄養と炭素を得る。これらの酵素は、典型的には、細胞内に取り込まれ得るより小さなサブユニットにポリマーを加水分解する。そのため、生態系のレベルでは、これらの微生物の細胞外酵素は、栄養の石灰化や自然環境の中で発生する有機物分解の多くを担当している。このようなビオヒドロラーゼ（CBH）およびβ-グルコシダーゼなどの酵素は、微生物の取り込みや同化のための利用可能な炭素基材を提供する1,2グルコースへのセルロースの加水分解を触媒するために一斉にセルロース分解や仕事のために重要である。有機リン酸からの酵素ホスファターゼ放出性無機リン酸基、本質的にリン酸塩を鉱化し、ほとんどの生物3による使用に利用可能にする。例えば、N-アセチル（ナガセ）のような他の酵素は、importanですTキチン分解における微生物の取得4用の炭素と窒素の両方を利用できるようにすることができます。 自然環境中の微生物の細胞外酵素活性のアッセイのための手順のいずれかは人工的なp-ニトロフェニル（p個の NP）の使用は、本来の土壌5ホスファターゼ活性を検出するために開発されたアプローチの基板を連結している。このアプローチは、人工基質を適切な酵素によって加水分解されるときに放出される着色最終生成物、p-ニトロフェノールの検出に依存する。 p-ニトロフェノールは、その後、周りの400〜410nmでの吸光度を測定することによって比色定量することができる。この方法は、例えば、日時のNAGase 6のような他の酵素を検出するために適用されており、土壌や堆積物7-9中の微生物細胞外酵素活性を調べる様々な研究で使用されている。 originallた別のアプローチyは10,11が 4 -メチルウンベリフェロン（MUB）連結された基材を使用する水環境における細胞外グルコシダーゼ活性を評価するために開発された。 （4 - メチルウンベリフェロン）放出最終生成物は、高度に蛍光性であり、460分の360付近の励起/発光の設定で蛍光光度計を用いて検出することができる。 MUB連動人工様々な基材は、P NP-基質比色手順を用いてアッセイすることができるように少なくとも同じ数の酵素（ 例えば 、β-グルコシダーゼ、ビオヒドロラーゼ、長瀬ホスファターゼ）の活性の蛍光測定を可能に用意されています。このようなタンパク質分解ロイシンアミノペプチダーゼのような他の微生物の細胞外酵素は、7 - アミノ-4 - メチルクマリン（COU）リンクされた基質を用いて蛍光定量的にアッセイすることができる。両方MUB-とカップリンクされた基板は、様々な陸上および水生サンプル12,13中の酵素活性を測定するために使用されている。 これまでの研究では、一行コメントがありますがアイベッド蛍光または比色マイクロプレートは、細胞外酵素活性14を決定するために近づくと、このようなアッセイを実施する方法の明確なプレゼンテーションが必要とされている。ここでは、比色Pの NP-連結基板アプローチを使用して土壌と堆積物中の蛍光MUB-連結基板技術を用いて、天然水中の細胞外酵素活性の分析のためのハイスループットマイクロプレート法を実施するための手順を示しています。我々は、β-グルコシダーゼ、のNAGaseの活性の測定に注目し、これらの酵素のようなホスファターゼは、それぞれ、炭素、窒素、およびリン循環に接続することができる。しかしながら、ここで説明する手順は、異なる人工基質を用いて他の細胞外酵素の測定に適用することができる。

<table><tr><tbody><td colspan="4">試薬と材料</strong</td></tr><tr><td>>Glacial酢酸</td><td></td><td></td><td>各種サプライヤー</td></tr><tr><td>酢酸</td><td></td><td></td>ナトリウム <td>各種サプライヤー</td></tr><tr><td>水</td><td></td><td></td>酸化ナトリウム <td>各種サプライヤー</td></tr><tr><td>p-Nitrophenol</td><td></td><td>Fisher BP612-1</td><td>代替品が利用可能</td></tr><tr><td>p-ニトロフェニル (pNP)-リン酸</td><td>シグマ</td><td>N3234</td><td>pNP-基板</td></tr><tr><td>pNP-&#946;-グルコピラノシド</td><td>シグマ</td><td>N7006</td><td>pNP-substrate</td></tr><tr><td>pNP-&#946;-N-アセチルグルコサミニド</td><td>Σ</td><td>N9376</td><td>pNP基板</td></tr><tr><td>クリア96ウェルマイクロプレート</td><td>フィッシャー</td><td>12-563-301</td><td>オルタネートが利用可能</td></tr><tr><td>96ウェルディープウェルブロック</td><td>Costar</td><td>3958</td><td>オルタネートが利用可能</td></tr><tr><td>アルミ製計量パン</td><td></td><td></td><td>様々なサプライヤー</td></tr><tr><td>滅菌済み 15ml遠心分離チューブ</td><td></td><td></td><td>様々なサプライヤー</td></tr><tr><td>滅菌済み50ml遠心分離チューブ</td><td></td><td></td><td>さまざまなサプライヤー</td></tr><tr><td>4-メチルウンベリフェロン</td><td></td><td>Σ M1381</td><td></td></tr><tr><td>4-メチルウンベリフェリル (MUB)-リン酸</td><td></td><td>Σ M8883</td><td>MUB基板</td></tr><tr><td>4-MUB-グルコピラノシド</td><td></td><td>Σ M3633</td><td>MUB基板</td></tr><tr><td>4-MUB-N-アセチルグルコサミニド</td><td>Σ</td><td>M2133</td><td>MUB基板</td></tr><tr><td>重曹</td><td></td><td></td><td>各種サプライヤー</td></tr><tr><td>黒色 96ウェルマイクロプレート</td><td>Costar</td><td>3792</td><td></td></tr><tr><td>ピペットリザーバー</td><td></td><td></td><td>各種サプライヤー</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</strong</td></tr><tr><td>>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機ローター</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-81</td><td>マイクロプレート/ディープウェルブロック用</td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td>オルタネートあり</td></tr><tr><td>マイクロプレート蛍光光度計</td><td>BioTek</td><td>FLx 800</td>オル<td>タネートあり</td></tr><tr><td>8チャンネルピペッター</td><td></td><td></td><td>各種サプライヤー</td></tr></tbody></table>

ハイスループットマイクロプレートアッセイを用いてウォーターズ、土壌、および底質中の微生物細胞外酵素活性の測定

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

自然環境での栄養循環と炭素処理の多くは、微生物が発表した細胞外酵素の活性を介して行われます。従って、これらの細胞外酵素の活性の測定は、このような有機物分解または窒素およびリンの石灰化などのエコシステムレベルプロセスの速度への洞察を与えることができる。環境試料中の細胞外酵素活性のアッセイは、典型的には人工的な比色または蛍光基質にサンプルを曝露し、基質加水分解の速度を追跡することを含む。ここでは、短い時間枠内で多数のサンプルの分析を可能にするこれらの手順のために、マイクロプレートベースの方法を記載している。サンプルを、ディープウェルマイクロプレート·ブロック96ウェルマイクロプレート内で人工的基質と反応させ、酵素活性は、その後、標準的なマイクロプレートReadeのを使用して得られた最終生成物の吸収または蛍光によって決定されるRまたは蛍光光度計。そのようなハイスループットの手順は、空間的に別個の部位又は生態系間の比較を容易にするだけでなく、実質的にサンプルごとに必要な全体的な試薬容量を低減することによりそのようなアッセイのコストを低減するだけでなく。

土壌や水生堆積物は、一般的に粒子の表面上に成長して付着した微生物群集（バイオフィルム）の結果として、細胞外酵素活性のかなりのレベルを持っている。第三の表層堆積物から得られた粒子の大きさによっては、この活動がどのように変化するかを図3に示す図北部ミシシッピ州、米国の順ストリーム。以前の研究では、このストリームからの堆積物の粒子上の細菌のコミュニティは、コミュニティ構造の分子分析に基づいて、三つの異なるグループに分離することができることを示した：0.063ミリメートル粒子は、0.125のそれら、0.25、0.5mmの粒子上のもの、およびそれらの1ミリメートルと15粒子 。細胞外酵素活性のパターンの分析は、この結論を支持している。ホスファターゼ（ 図3A）で0.125、0.25、0.5mmの粒子に類似しているしかし、p個の NP-連結された基板技術を用いて測定したとき1および0.063ミリメートルの画分にはるかに高い。 O例えば、β-グルコシダーゼ（ 図3B）、ナガセ（...

マイクロプレートベースの手順は、細胞外酵素活性の比色または蛍光分析に記載されている。これらの手順は、管理可能な時間枠内で環境サンプルの大規模な数のこのような活動の迅速なアッセイを可能にします。

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

本手順の全般的な目的は、さまざまな自然環境における微生物の細胞外酵素活性を迅速に測定することです。これは、水サンプルまたは土壌スラリーをマイクロプレートに添加し、十分な反復数を確保することで達成されます。第二のステップとして、マイクロプレートのウェルに人工的な比色または蛍光基質を添加し、酵素反応を進行させます。次に、吸光度または蛍光を測定し、反応中に放出された最終産物の量を決定します。結果は、最終反応の吸光度または蛍光に基づいたサンプル間の細胞外酵素活性の差を示しています。本日は、自然環境における細胞外酵素活性の測定方法について実演します。この手法は、土壌、堆積物、および水域における有機物処理速度や栄養塩の無機化など、微生物生態学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。一般的に、この手法を初めて用いる方は、特に大量のサンプルを分析する場合、粒子と反応溶液の分離が困難であるため、苦労することがあります。プレートのレイアウトを習得することは困難であり、また複数のタイムステップで測定を行うことで手順がより複雑になるため、本手順の視覚的なデモンストレーションが極めて重要です。土壌および堆積物における細胞外酵素活性の比色分析は、まず、テキストプロトコルに記載されている基質緩衝液および標準溶液の調製から開始します。土壌については、分析対象の各サンプルのスラリーを滅菌済みの15 milliliter遠心チューブに調製します。堆積物の場合は、50 millimolar酢酸緩衝液を用いて、濃度を約1 g/mLに調整して添加します。スラリーを簡単にピペッティングできるよう、十分な量の酢酸緩衝液を加えます。必要なスラリーの正確な量は、分析する酵素の数によって異なりますが、最低5 mLを推奨します。土壌や堆積物の塊がすべて分散するまで、各スラリーをボルテックスします。最終容量に注意してください。ピペット操作の前に、ハサミでピペットチップの先端を切断します。土壌懸濁液はチップを詰まらせやすいため、各懸濁液を再度ボルテックスし、直ちに6つのウェルそれぞれに150 µLずつ分注してください。96ウェルディープウェルブロックを用いて行います。十分に、かつ頻繁にボルテックスすることが重要です。土壌粒子を懸濁状態に保つため、基質コントロールとして1ブロックあたり少なくとも2つのウェルを空けておいてください。分析する各酵素に対して、96ウェルブロックを1つずつ準備します。酢酸バッファーを約5 mLピペットリザーバーに注ぎ、8チャンネルピペッターを使用して、各サンプルの最後の2ウェルにバッファーを150 µLずつ加えます。サンプルバッファーコントロールおよび2つの基質コントロールウェルに添加します。適切なp-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド（PNP）基質溶液を約10 millilitersピペットリザーバーに注ぎ、8チャンネルピペッターを用いて、各サンプルの最初の4ウェルと2つの基質コントロールウェルに基質溶液を150 µLずつ加えます。基質溶液を添加した直後の、反応開始時刻を記録してください。プレートを室温で0.5〜4時間インキュベートします。正確なインキュベーション時間は、サンプルの活性レベルおよび測定する酵素によって異なります。アッセイのインキュベーション中に、透明な96ウェルマイクロプレートを1枚準備します。吸光度を測定するため、各ディープウェルブロックのマイクロプレートの各ウェルに、蒸留水 190 µL と 1 M 水酸化ナトリウム 10 µL をピペットで分注します。水酸化ナトリウムは酵素反応を遅延させ、pHを上昇させることで、インキュベーション後の反応中に放出されたPNPの色を濃くします。96ウェルブロックを 2000 ～ 5,000 ×g で5分間遠心分離し、土壌粒子を沈殿させます。ペレットを乱さずに液相を除去することは困難な場合があります。最初に使用する土壌サンプルの量を多くしすぎないようにしてください。十分な時間遠心分離を行い、慎重かつ迷いのない動作で液を吸引してください。マルチチャンネルピペットを使用し、ペレットを避けながら、各ウェルから100 µLを分取します。液体を準備済みの透明な96ウェルマイクロプレートの対応するウェルに転移させます。マイクロプレートリーダーの電源を入れ、必要なソフトウェアを設定します。410 nmでの吸光度を測定します。テキストプロトコルに記載されているサンプルの乾燥質量の決定後、サンプルアッセイの吸光度からサンプルコントロールの吸光度を差し引くことで、各サンプルの最終吸光度を算出します。基質コントロールの吸光度が0.060より高い場合は、その値を差し引いてください。また、以下の式を用いて、乾燥重量1gあたり1時間あたりのマイクロモル数として酵素活性を算出します。テキストプロトコルに示されている例に従って、各酵素用にブラックマイクロプレートを準備し、最初の水サンプル約5 mLをピペットリザーバーに注ぎ、8チャンネルピペッターを使用して、すべてのウェルに200 µLずつ分注してください。マイクロプレートの1列目に、使用済みのピペットチップを廃棄し、1列目から9列目までが埋まるまで、各水サンプルに対して必要に応じてこの操作を繰り返します。サンプル、標準物質、基質、およびクエンチングを考慮したコントロールを、サンプルと同じ黒色マイクロプレート上に設定します。サンプルコントロールにはサンプル水と重炭酸緩衝液が含まれており、活性の計算には使用しませんが、実験期間全体を通じた読み取りの整合性を実証するために用います。クエンチコントロールは、サンプル水と標準量の蛍光タグで構成され、蛍光の回折を測定するために使用されます。サンプル水基質および標準コントロールは、それぞれ基質結合体または標準蛍光タグと重炭酸緩衝液で調製します。5 mMの重炭酸緩衝液を約5 mL、清潔なピペットリザーバーに注ぎます。d行およびe行の1番から9番のマイクロプレートウェルに、バッファーを50 µLずつ分注し、サンプルあたり2つの複製コントロールウェルを作成します。ピペットチップを交換し、A行およびH行の10番から12番のウェルに重炭酸バッファーを200 µL転送します。本デモンストレーションでは撮影のために照明を明るくしていますが、蛍光標準物質は光に敏感であるため、照明を落とすか消灯して周囲の光を減らす必要があります。約5 mLの10 µM 4-メチルムニロン（MUB）を清潔なピペットリザーバーに注ぎ、H行の1番から12番のマイクロプレートウェルに50 µLずつ分注します。次に、G行およびF行の1番から9番のウェルに50 µLずつ分注し、サンプルあたり3つの複製クエンチコントロールおよび全体的な標準コントロールを作成します。MUBの光分解を抑えるために、マイクロプレートを暗所に置くか不透明な蓋で覆い、フルオリメーターの電源を入れて、基質を添加する前に読み取り準備が整うよう必要なソフトウェアを設定します。適切なMUBライニング基質を約5 mL、清潔なピペットリザーバーに入れます。12チャンネルピペットを用いて、マイクロプレートのA行1〜12ウェル、およびB行とC行の1〜9ウェルに50 µLずつ分注し、各サンプルにつき3つの複製アッセイと3つの基質コントロールを作成します。その後、直ちに蛍光測定を行います。基質をマイクロプレートに添加した直後に初期蛍光値を読み取ります。測定後、マイクロプレートを室温で、暗所または不透明な蓋で覆った状態でインキュベートします。MUBの光分解を抑制するためです。最大潜在酵素活性を測定するために必要なインキュベーション時間は、試料中の酵素濃度によって異なります。この濃度は未知であるため、試料をアッセイする前に、マイクロプレートを複数の時間ステップで測定する必要があります。ほとんどの酵素において、1時間の間で10〜15分間隔で測定することが適切ですが、高濃度のサンプルの中には10分前にピークに達するものもあります。指定の間隔で、少なくとも1時間はマイクロプレートの蛍光読み取りを継続してください。読み取りの間は、必ずマイクロプレートに蓋をするか、暗所に保管してください。各時間間隔における各サンプルについて、各時間間隔の平均初期サンプル蛍光、平均最終サンプル蛍光、平均標準蛍光、および平均クエンチコントロール蛍光を算出します。テキストプロトコルにある式を用いて、1時間あたり1ミリリットルあたりの酵素活性（m）を算出してください。各タイムステップで算出された活性値を調べ、活性値が最大となったタイムステップから最終的な潜在的活性を決定します。活性値が上昇し続けている場合は、より後のタイムステップが必要になる可能性があります。また、ランの過程を通じて活性値が低下している場合は、タイムステップを短くして再度ランを行ってください。土壌や水圏堆積物には、粒子の表面で増殖する付着微生物群集の結果として、通常、かなりのレベルの細胞外酵素活性が存在します。この図は、米国ミシシッピ州北部の3次河川の表層堆積物から得られた粒子のサイズによって、この活性がどのように変化するかを示しています。先行研究により、この河川の堆積物粒子上の細菌群集は、群集構造の分子解析に基づき、3つの異なるグループに分けられることが示されています。0.063 mm粒子、0.125、0.25、および0.5 mm粒子、ならびに1 mm粒子上のそれらである。細胞外酵素活性のパターンの分析はこの結論を支持しており、PNP連結基質法を用いて測定した際、ホスファターゼは0.125、0.25、および0.5 mm粒子で同程度であったが、1 mmおよび0.063 mmの画分では大幅に高かった。β-グルコシダーゼやN-アセチルグルコサミニダーゼ（NAGase）などの他の酵素は、最も微細な粒子で同様のピークを示すが、1 mm粒子では上昇していない。異なる酵素が異なる環境分布を示す可能性があること、および本アッセイを用いてそれを明らかにできることが強調されています。誤差棒が比較的小さいことは、堆積物における酵素活性の比色アッセイに再現性があり、統計解析に適していることを示しています。異なる環境試料を比較すると、天然水は土壌や堆積物（1gあたり）よりも、1mLあたりの細胞外酵素活性が低い傾向にあります。そのため、MUB結合基質を用いて、これらの酵素を蛍光光度法で測定する必要があります。この図は、ホスファターゼ、β-グルコシダーゼ、およびN-アセチル-β-D-グルコサミニダーゼ（NAGase）の活性が水深に応じてどのように変化するかを示しています。米国ミシシッピ州北部の浅い湖において、この湖は栄養が乏しいことが知られており、それは有機化合物からリン酸を獲得するために微生物が産生するホスファターゼおよび関連酵素の活性が相対的に高いことからも示唆されています。3つの酵素すべてにおいて、水面および水深50 cmで採取したアッセイサンプルは同様の活性を示しました。一方で、100 cmのサンプルでは活性が上昇していましたが、このサンプルは実質的に水底界面から採取されたものであり、サンプル中に含まれる堆積物粒子が、特にbeta gluccoおよびn AGAsで見られた高い活性の原因であると考えられます。PNP基質と同様に、エラーバーが小さいことは、わずか3回の繰り返し測定であっても、MUB基質を用いた蛍光光度アッセイの再現性が高いことを示しています。水サンプルの酵素活性の単位はnmolの基質消費量であるのに対し、堆積物粒子の酵素活性の単位は、単位サイズあたりの値が同程度であるにもかかわらず、µmolの基質消費量であることに注意してください。これは、土壌や堆積物が天然水よりもはるかに高い細胞外活性を持つ傾向があるという事実を強調しています。また、MUB結合基質法の感度の高さと、習得した後は水サンプルの細胞外酵素活性を測定するためにこの手法を用いる必要性があることを示しています。この手法を用いることで、1時間強で最大9つの水試料の酵素活性を測定できます。土壌や堆積物でこの手順を試みる際は、活性を乾燥重量ベースで表現できるよう、既知量の物質を使用することが重要です。このビデオを視聴することで、比色法または蛍光法を用いて、さまざまな自然環境における細胞外酵素活性を測定する方法を十分に理解できるはずです。

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における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌</em

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この研究は、理論的には200以上の酵素に適用できる普遍的な遺伝的酵素スクリーニングシステムを使用したハイスループットスクリーニングの方法を提示しています。ここでは、シングルスクリーニングシステムで、使用する基質(p-ニトロフェニルアセテート、p-ニトロフェニル-β-D-セロビオシド、およびフェニルリン酸)を変更するだけで、3つの異なる酵素(リパーゼ、セルラーゼ、アルカリホスファターゼ)を同定します。...

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担鉄細胞の潜在的な地上システムで微量栄養素のバイオアベイラビリティと売り上げ高に貢献環境試料の急速なスクリーニングのためのプロトコルを提案します。...

環境試料からの担鉄細胞高スループット スクリーニング: 植物細胞、一括土壌および根圏土壌

このプロトコルで提示される共培養相互作用アッセイは、安価で高いスループットとシンプルです。これらのアッセイは、共培養における微生物相互作用を観察し、相互作用パターンを同定し、ヒトおよび環境病原体に対する関心のある微生物株の阻害可能性を特徴付けるために使用することができる。...

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学ぶマイクロプレートアッセイによる微生物細胞外酵素活性の測定法。水、土壌、底質サンプルを用いたハイスループット分析で、微生物生態学の研究に有用です。

ハイスループットマイクロプレートアッセイを用いてウォーターズ、土壌、および底質中の微生物細胞外酵素活性の測定

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