マウスの遺伝子操作は、視床下部を介して開発

この手順の全体的な目的は、子宮内で発育しているマウス胚の視床下部にプラスミドDNAを導入し、目的遺伝子の機能を活性化または抑制することである。まず、妊娠マウスを麻酔し、開腹術によって子宮を露出させる。次に、胚の脳の第三脳室にDNA溶液を注入する。

次に、陽極を胎盤と胚の頭部の間の子宮内に配置します。陰極を子宮の外表面に配置し、電気パルスを印加します。最後のステップとして、6日後にトランスフェクションされた胚の脳を取り出します。

最終的に、蛍光顕微鏡を用いて、導入された細胞の表現型の変化（数、形状、位置、マーカーの発現など）を解析します。ウイルス導入などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、第一に特別な予防措置や2つの施設を必要としないこと、第二に特定の領域を標的とすることが可能であることです。そして第三に、電穿孔法を用いることで、候補遺伝子のスクリーニングをより迅速に行うことができます。

一般的に、この手法に不慣れな方は苦労することがあります。なぜなら、第三脳室へのDNA溶液の注入および針電極の適切な配置には、高度な手技と一定の経験が必要だからです。本手法は、視床下部の発生分野、特に細胞移動に関連する問いや、個々の領域や核がどのように遺伝的に規定されるかという問いを解決するのに役立ちます。羊水の喪失による初期の高い失敗率を低減するためには高品質なガラスマイクロピペットが不可欠であるため、まずピペットの作製からこの手順を開始してください。

DNAを調製するために、精製されたエンドトキシンフリーの血漿DNAを0.1% fast greenを含むPBSに溶解し、最終濃度を1〜2 µg/µLにします。fast greenを用いることで、注入液を胚の脳室内で可視化できます。次に、10 µLのDNA溶液をガラスマイクロピペットに充填します。

次に、ガラスマイクロピペットを注入システムまたはマウスピペットに接続します。このステップで、ヒーティングパッドを備えた手術台と手術器具を準備してください。胚の視認性を高めるために、寒色系光源を点灯させます。その後、ガラスビーズ滅菌器を用いて手術器具を消毒します。

次に、妊娠マウスをイソフルランで麻酔します。マウスの麻酔後、乾燥を防ぐため目に軟膏を塗布します。その後、麻酔を継続的に維持するためにマスクを顔に装着します。

次に、マウスを腹側が上になるようにヒートパッドの上に置きます。テープで4肢を固定し、体を安定させます。尾をつまんで反射を確認し、マウスが完全に麻酔状態にあることを確認してください。

次に、腹面を剃毛し、ヨード溶液で消毒します。腹壁の皮膚に約1〜1.5 cmの縦切開を加えます。その後、腹膜を切開します。

次に、切開部位の周囲に脱脂綿を配置します。脱脂綿をPBSで洗浄します。鈍的なピンセットを用いて慎重に引き出し、片側の子宮角を露出させます。

子宮筋層や子宮を強く引っ張らないようにしてください。子宮内が高圧になると、注入時に胚液が流出する可能性が高まり、結果として流産につながるためです。その後、子宮角をPBSで洗浄したガーゼの上に置き、数分おきにPBSで洗浄して湿った状態を維持してください。

次に、顕微鏡下で、脳室が視認できるように子宮を保持します。不適切な位置にある胚を無理に動かさないでください。これは流産の可能性を高めるだけです。

胚の頭部を上から見て、左右の大脳皮質半球の間の裂溝にある隙間を確認します。半球は容易に区別でき、その内部にある側脳室は通常、やや暗い形状として認識されます。DNA注入に最適な方向で胚が位置している場合は、子宮壁を貫通して一度に第三脳室に進入することが可能です。

あらかじめ調製したDNAが入ったガラスマイクロピペットを、子宮壁に対して45度の角度に保持し、大脳半球間裂の吻側端から、深さ約1 mmまで穿刺します。これにより、ガラスマイクロピペットの先端は側脳室ではなく、脳の第三脳室に入ります。その後、約1 µLのDNA溶液を第三脳室に注入します。注入が適切であれば、脳室内が緑色の液体で満たされます。同一の子宮角にあるすべての胚に対して、同様の手順を繰り返します。

これにより、DNA溶液が心室液と均一に混ざり合い、神経上皮全体に行き渡るための時間を確保できます。次に、エレクトロポレーターの電源を入れ、胚の齢に応じて設定を調整します。ステンレス製の針電極を陽極に、円形の平電極を陰極に使用し、背側を上にした胚を選択してエレクトロポレーションを行います。

次に、針電極の先端を押し下げて、胚の頭部の隣にある羊膜嚢と胎盤の間の子宮壁を貫通させます。このとき、もう一方の手の人差し指を突き当て台として使用します。中脳の高さ付近で、電極先端の約5 mmが羊膜嚢と子宮壁の間にあるようにしてください。

これがターゲット電極となるため、その位置によって視床下部神経上皮のどの部分が最も形質導入されやすいかが決定します。次に、もう一方の手で、胚の頭部の反対側にある子宮壁の外側に円形の平板電極を配置します。その後、電極の間で胚をそっと挟みます。

ペダルスイッチを使用して電圧を印加します。その後、もう一方の手の人差し指で子宮を固定しながら、針電極をゆっくりと子宮から引き抜きます。穿刺した壁から羊水が流出した場合、通常、胚は流産します。

すべての胚への注入および電穿孔が完了した後、子宮をマウスの腹腔内へ非常に慎重に戻し、元の位置に正確に配置します。次に、腹腔を生理食塩水で湿らせてから閉鎖します。腹膜を外科用キャットガットで縫合し、その後、より強度の高い縫合糸で皮膚を縫合します。

ヨード溶液で腹部表面を消毒し、疼痛緩和のために非ステロイド性抗炎症薬を皮下注射します。次に、母マウスを麻酔機から外し、ヒーティングパッドで加温したケージに入れます。マウスが麻酔から完全に回復するまで観察し、感染や疼痛の兆候なく処置から回復していることを確認するため、毎日チェックを行います。

このステップでは、解析予定日に合わせて胚または出生後個体を採取します。DNAを注入しエレクトロポレーションを行った胚を選択し、この実体顕微鏡下で脳を解剖します。その後、適切な領域に緑色蛍光シグナルがあるかを確認してください。

選択した胚の脳を解析するために、組織を4%パラアルデヒドで短時間固定します。次に、それを4%アガロースまたはゼラチン・アルブミンに包埋します。その後、ビブラトームを用いて脳を切片化します。

これらの図は、E 12.5において蛍光レポーター遺伝子（GFPまたはCFP）を保持するプラスミドDNAを子宮内でトランスフェクションした後の視床下部を示しています。こちらは、吻側から尾側にかけてトランスフェクションされた視床下部を示す矢状断であり、こちらは正中線から外側軸に沿った異なるレベルで標識細胞を示す横断切片です。この矢状断では、特異的にトランスフェクションされた乳頭体と、その特徴的な軸索樹の標識が示されており、この横断切片の electro parade 側には、E 12.5に誕生したニューロンに対応する標識帯が示されています。

切片をより詳細に解析するため、乳頭陥凹から伸びる放射状グリア突起の平面に平行な水平切片を作製した。E 12.5日にトランスフェクションされた神経上皮から出生したambi Oニューロンを、E 18.5日にGFP抗体を用いて同定した。

この例では、抗体によってMBO細胞の限定的なグループが標識されています。このグループは、E 12.5の前後に誕生したMBOニューロンに対応する、標識されていない外側および内側の2つのMBO領域の間に位置しており、nestinに対する抗体で共染色されています。赤色で示されているのは、神経上皮の放射状グリア突起上を移動する、個別に標識されたニューロンの移行様式です。この手法を習得し、適切に実施すれば、30分で完了させることができます。

このビデオを視聴することで、第三脳室へのDNA注入方法、および視床下部を効率的に標的とするために、胚、頭部、胎盤の間でどのように針を陽極として配置させるかを十分に理解できるはずです。本手順に続き、免疫組織化学染色やin situハイブリダイゼーションなどの他の手法を行うことで、形質転換されたニューロンの表現型に関するさらなる疑問を明らかにすることができます。