Name: マウスの遺伝子操作は、視床下部を介して開発子宮内エレクトロポレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 学ぶマウス子宮内電気穿孔法による視床下部への遺伝子導入技術。DNA溶液を第三脳室に注入し電極を配置して遺伝子機能を操作し、発生神経科学の研究に応用できます。

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この作品は、ドイツ研究協会（ドイツ学術振興）によって賄われていた。

1。注射用DNAとガラスマイクロピペットの作製<ol><li>良質のガラスマイクロピペットは、羊水の損失のために初期高い流産率を減少させるために不可欠です。ガラスマイクロピペットを引っ張るための手順は、よく13,18,25を文書化されています。ヒート= 300;; 1.2ミリメートル径の毛細管を使用し、設定P = 500と従来のサターでP-97のデバイスを引っ張っ= 40を引いて、速度= 50;時間= 50。 3ミリメートル &quot;トラフ&quot;フィラメント（サッタートゥルFT330B）でプーラーを取り付けます。 2ミリメートル径フィラメントは私たちのために少なく満足のいく結果が得られている。一方、マイクロピペットの先端を面取りすると、私たちのために結果を改善していないようです。 </li><li> 1から2μgの/μlに最終濃度0.1％ファストグリーンを含むPBSで精製し、エンドトキシンフリーのプラスミドDNA（細胞培養グレード）に溶解する。ファストグリーンは、胚の脳室に注入された目に​​見える解決策を作ります。 </li><li>ガラスマイクロピペットへのDNA溶液10μlをロードします。 </lI&gt; <li>噴射システム（ピコポンプ）や口のピペットにガラスマイクロピペットを接続します。 </li></ol> 2。麻酔加熱パッドや手術器具で手術台を準備します。胚の可視化を容易にするために、冷光源をオンにします。例えばガラスビーズ滅菌器を使用した手術器具を消毒する。 三つの異なる麻酔手順は、（説明を参照）は、このプロトコルのために可能です。ここで我々は麻酔導入（流量0.5 L /分）と同様のメンテナンス（流量1リットル/分）のためにイソフルラン吸入を使用して、最善を考えるものを説明します。 <ol><li>チューブの短い長さによってKomesaroffマーク5麻酔デバイスに接続されている（そのため、マウスが表示されたまま）、透明の小さな容器に妊娠しているマウスをご紹介します。 </li><li>イソフルランを気化器を満たし、その後、デバイスに接続されている酸素ボンベを開きます。 isoflの1つまたは2つのパルスを吹くurane /麻酔が入って設定するためのマウスと時計を保持する容器への酸素（0.5L /分） </li><li>マウスを取り出し、乾燥からそれらを防ぐために、すぐに頭に流れ麻酔マスクに適合するように軟膏との目をカバーしています。 </li></ol> 3。開腹<ol><li>加熱パッド（そうでなければ、その体温が回復の可能性を減少させる、非常に高速に下がるだろう）上に腹マウスを置き、テープで側面に4つの足を固定することにより、所定の場所に、その本体を固定します。反射刺激（しっかり圧例えばつま先またはテールピンチ）への応答の損失のためにチェックすることによって、麻酔の深さを評価する。 </li><li>腹部の表面を剃るとiodophorpovidone-ヨウ素（Braunoderm）でそれを消毒。 </li><li>腹部皮膚上の縦切開（1〜1.5センチメートル長い）を作る。その後、腹膜を切った。切開の周り綿ガーゼを置きます。 1子宮角が見えるようにし、PBS-すすぎgauzに鈍ピンセットで慎重にそれを引き出し電子。非常に多くの場合、それは常に（ 図2Aおよび2B）湿ら保つためにPBSで子宮を洗浄します。全体の手順の間に子宮内部の高い圧力が中絶になり注射により流体の損失の可能性を増加胚に送信しますので、タイトな子宮間膜や子宮を引っ張って避けてください。 </li></ol> 4。脳室へのDNAインジェクション<ol><li>脳室を可視化することができるような方法で子宮を保持する。広範囲に不利な立場にある胚の位置を変えてはいけない - これが唯一の中絶の可能性が高くなります。 </li><li>上部から胚の頭を見て、視覚的に左右の皮質半球間のギャップや亀裂をローカライズ。半球は区別することが容易であり、それらの内側側脳室は（対象としないように）通常はやや暗めの形状として認識することができます。胚（FIGUR DNA注射のために完全に配向させることが判明した場合ES 2C及び2D）、それが貫通する子宮壁可能であり、一度に第三脳室に入る。約1mmのために貫通、皮質半球間のギャップの吻側終わりに子宮壁と穿刺それに45°のガラスマイクロピペットを保持します。このようにして、ガラスマイクロピペットの先端は、脳（ではない側脳室）（ 図2Cおよび2D）の第三脳室に入ります。それは胚の頭部の近傍で最初貫く子宮壁（常に45°）に便利です不利指向の胚では、皮質半球の間に正しい位置にマイクロピペットの先端を配置し、だけにして脳を穿孔。第三脳室（良い注射が緑流体で心室を埋める）にDNA溶液を約1μLを注入します。 1子宮ホーンのすべての胚と同じ手順を繰り返します。これは、DNA溶液を、心室流体で均等に混ぜるとentirに到達するためのいくつかの時間を可能にします電子神経上皮。 </li></ol> 5。エレクトロポレーションのための視床下部を標的<ol><li>にエレクトロを切り替えて胚年齢（E12.5のために我々は5方形波パルスを使用し、50 V、50ミリ秒ON/950ミリ秒OFF）に応じて設定を調整します。正極として、ステンレス製の針電極（CUY550-10）を使用し、負極ラウンドフラット電極（CUY700P4L）として。 （電流だけでなく、それを介して胚の周りを流れそうでないので、それは、電極胚よりも小さいことが重要である。） </li><li>エレクトロポレーションのために、その背側（それらのほとんどがあるように）（ つまり、実験者の方を向いて）アップしているそれらの胚を選択して、その方向性に有利で ​​はないものを捨てる。これは、エタノール消毒指で、または手袋を子宮に触れても安全です。鉗子で子宮を持って、しかし、エレクトロポレーション時の電流の流れを妨げる。 </li><li>ピアースAMNの間に胚の頭で子宮壁針電極の先端とそれを介して下方へ突き出すことによりiotic嚢と胎盤。スラストブロックとしてもう一方の手の人差し指を使用してください。電極先端の5mm程度は中脳（ 数字は2Eと2F）の程度のレベルで、羊膜嚢と子宮壁との間で今でなければなりません。これは &quot;ターゲット電極&quot;であることを忘れないので、その位置は、トランスフェクトされ得る可能性が最も高い視床下部の神経上皮のどの部分を決定します。胚は非常に優しく、電極間に &quot;圧迫&quot;されなければならない。 </li><li>一方、位置と胚の頭（ 図2Eと2G）の反対側の子宮壁の外側ラウンドフラット電極。 </li><li>電圧（50 V、50ミリ秒ON、950ミリ秒OFF、5方形波パルス）を適用するためにペダルスイッチを使用します。 </li><li>もう一方の手の人差し指で子宮をバック保持しながらゆっくりと子宮の針電極を引き出します - もしamnioチック液がパンクした壁を通して失われ、通常胚は妊娠中絶を受けることになる。すべての胚との手順を繰り返します。 </li><li>腹部に子宮ホーンを返し、残りの角の注射およびエレクトロポレーションを繰り返します。 </li></ol> 6。手術を終えて<ol><li>すべての胚の注入とエレクトロポレーションした後、彼らはそれを閉じる前に生理食塩水で腹腔前と湿っていたとおりに正確に配置され、非常に慎重に腹部に子宮を後ろに置きます。 </li><li>手術腸線（VICRYLポリグラクチン910、5-0、エチコンV4914）で腹膜を縫合。肌用の閉鎖methodwithより耐性縫合（Supramidナイロン、6-0、Serag Wiessner 07171L TO） &quot;ステッチが中断&quot;。 </li><li>ポビドンヨード（Braunoderm）と腹部の表面を消毒し、非ステロイド皮下抗炎症（ 例えば 、0.9％NaCl中Rimadyl 1:10の溶液100μl）、または、より良い、BUのようなオピオイドを注入prenorphine（Temgesic、0.9％NaCl中0.05〜mg / kg体重）痛みを緩和する。 </li><li>麻酔マシンから母親を外し、加熱パッドにより加熱されるケージに入れてください。それは完全に麻酔から回復されるまで、継続的にマウスを監視します。その後、感染症や痛みの兆候なしで、彼らはプロシージャから回復して保証するために、毎日動物を確認してください。 </li></ol> 7。結果の分析<ol><li>分析の希望日に応じて胚（またはpostnatals）収穫。出生後のマウス（1から2日齢）を断頭により殺される。 </li><li>以前エレクトロ注釈によると、すべての胚を分離。実体顕微鏡下で脳を解剖して、適切な地域の緑色蛍光シグナル（GFPレポーターから）のために顕微鏡下で確認してください。 </li><li>選択された脳は、 &quot;新鮮&quot;を分析することができます：4％パラホルムアルデヒド中で短い時間のために組織を固定し、アガロース4％またはゼラチンで埋め込むlbumin、その後ビブラトーム型デバイス上のセクション（ 図3）。より詳細な免疫組織化学的分析のために（ 図4）、10月マウンティング培地（ティッシュテック）に埋め込 ​​む30％ショ糖溶液を、脳を凍結保護はその後クライオスタットで20μmのセクションをカット。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

麻酔について：視床下部に子宮内エレクトロポレーションでは技術的に困難であると長い麻酔時間を必要とすることができるので、我々は、酸素とイソフルランの混合物を投与することにより麻酔を誘導し、維持することを好む。我々の経験では、動物は少なくとも1時間までの期間について、このように適切に麻酔残ることができ、母親の回復は非常に高速であり、胚の生存率が向上しました。麻酔への他のアプローチもご用意しています。最も簡単な手順は、0.9でケタミン（25 mg / ml）で、キシラジン（1.2 mg / mlの）とAcepromazin（0.35 mg / ml）での混合物の体重の2.5ミリリットル/ kgを腹腔内注射により麻酔を誘導し、維持することから成り％無菌のNaCl（ &quot;トリプルコンボ&quot;）。一人でこの混合物を用いて、ここで推奨用量で、約30分（場合によっては最大45分）の麻酔が誘導される。これは、E12.5（INJを通してで子宮内エレクトロポレーションで皮質に通常十分です側脳室でECTION）。この方法の利点は、それが完全に麻酔·デバイスや他の機器の必要性を...

マウス胎児の脳の遺伝子操作が発達規制について学ぶために好ましいアプローチである。変異マウス線の生成は、しかし遅く、高価である。哺乳類の脳の神経細胞の開発に特定の遺伝的変化を導入する一つの有力な方法は、 子宮内エレクトロポレーションである。本質的に、この技術は、胚は、一定時間生き残る脳を収集し、可能な新規な、有益な表現型のためにそれらを調べることができ、その後、電気的パルスによって胚脳の神経上皮へのDNAのトランスフェクションから構成される。この方法では、実験者は、マウス変異体の生産に必要な長い待機期間なしでほとんど即座仮説をテストすることができます。 発展途上胚へのDNAのトランスフェクションは、ニワトリ胚1上のOVOエレクトロポレーションで始まりました。マウスに不可欠な概念実証は、文化の中で行われた<s2&gt;まで。これは、すぐに子宮内 3,4 でマウスの技術の最初の説明が続いた。 主な問題は、それらまたは母を殺すことなく、 子宮内での開発の胚の脳をトランスフェクトすることです。必要な手術（開腹、インジェクション、エレクトロポレーション）を実行するために学ぶことは、長い訓練期間を必要とします。手術が胚の生存率が許容できるポイントに習得された後、次の重要な問題は、次のとおりです。脳構造がアクセス可能である？驚くことではないが、 子宮内エレクトロポレーションで得られた結果を示した最初の論文は、皮質開発5-9に焦点を当てた。外科的処置に最もアクセス現像マウス脳の領域が皮質（ 図1）であるので、これは、この技術を用いて出版物のほとんどは依然として当てはまる。皮質に子宮内エレクトロポレーションでの手順が記載されているプリント10とビデオ11〜14インチ技術の変更が終脳の腹側部分、大脳基底核15を標的するために使用することができる。 終脳を超えて、間脳は（古典的視床と視床下部に分けて）に到達することがより困難脳の領域である。その背と最もアクセス部分、視床16-19の標的論文·レポートの数が少ない。 視床下部は、脳の中で最も腹側部分であるので、1背面（皮質）（ 図1）から最も深くローカライズ。この領域は、遺伝的に子宮内でマウスの脳を操作することを約束し研究者のための困難な課題である。我々の知る限りでは、ごく少数の記事では、マウスの視床下部20,21に子宮内トランスフェクションの結果を報告する。しかし、視床下部cannoの機能的重要性それは食べたり飲んだり、交配、繁殖と子育て22のような行動を規制するため、T、誇張すること。また、視床下部の開発の変化は、肥満、高血圧、糖尿病、思春期早発症23のような生活条件の後半発信に貢献しています。開発中に遺伝的に視床下部を変更することができることは、それを理解するための非常に強力なツールを提供するでしょう。 我々はここで使用している妊娠マウスの開腹するための基本的な外科的プロトコルは、他のプロトコル11,13,14,24で使用されているものと似ています。私たちは、完全を期すためにここで簡単にそれらを記述します。我々の手順の鍵と、他方では、麻酔のタイプ、注入の代わりに、電極の種類や挿入および胚の頭部に対する正電極の位置である。前者は可能にするため、我々は、単純な腹腔内麻酔上ガス吸入による麻酔を誘導し、維持することを好む難しい手術に必要な麻酔のやや長い期間。麻酔からの迅速な復旧にイソフルラン吸入結果、通常、母親は既に手術後の分を通常の動作を示しているので。ガラスマイクロピペットでDNA溶液を注入するための最も簡単な点は、しかし、視床下部のエレクトロポレーションのために完全には不向きである側脳室、です。直接第三脳室に注入は確かに深い間脳構造を標的とすることが重要です。標準の、既製の電極にE12.0またはE12.5から視床下部をトランスフェクトすることができる。私たちは、特にこの目的に適してNEPAジーン（千葉県、日本）によって製造された電極の一部を発見した。 私たちの手順では、我々は全体の視床下部神経上皮や電極の向きに応じて部分的な、地域のトランスフェクションのトランスフェクションを得る。ここで我々は間違いなく、乳頭体をトランスフェクトすることによって技術を実証深いとすべての視床核の最も凹んだ。さらに、我々は、解像度の細胞レベルにトランスフェクションされた細胞の詳細な組織学的分析を下に示す。 子宮内でマウスの脳の発達をトランスに他のアプローチと子宮内エレクトロポレーションでの比較は考察の項に記載されています。

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>REAGENTS</td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Sanofi GmbH</td><td></td><td>麻酔薬</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>バクスター</td><td></td><td>HDG9623 麻酔薬</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Pharma GmbH</td><td></td><td>麻酔薬</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Fluka</td><td>44715</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>リマジル</td><td>ファイザー</td><td></td><td>非ステロイド性抗炎症</td></tr><tr><td>ブラウノダーム</td><td>ブラウン</td><td>3887138</td><td>ポビドンヨード</td></tr><tr><td>リン酸緩衝液生理食塩水PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>テムゲシック(ブプレノルフィン)</td><td>エセックスファーマ</td><td></td><td>オピオイド鎮痛剤</td></tr><tr><td>眼軟膏</td><td>パンオフタール</td><td>7136926</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>バイエル</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>EQUIPMENT</td></tr><tr><td>麻酔器具 Komesaroff Mark-5</td><td>Medical Developments Australia</td><td>ACN 004 903 682</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>キャピラリープーラー P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>圧縮機</td><td>精密Instr.</td><td>VF-300</td><td>ビブレータ型共</td></tr><tr><td>焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ</td><td>CM3050S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>エレクトロポレーター</td><td>ネパジーン(株)</td><td>CUY21EDIT</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>電極1</td>:<td>ネパジーン(株)</td><td>CUY550-10</td><td>ステンレス鋼針電極、10 mmチップ、直径0.5 mm。</td></tr><tr><td>電極2</td><td>ネパジーン(株)</td><td>CUY700P4L</td><td>カバー 丸型プラチナプレート 直径4mm</td></tr><tr><td>光ファイバー冷光源</td><td>ライカ</td><td>KL2500 LCD</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー</td><td>ハーバード装置</td><td>GC120T-15</td><td>1.2 mm O.D. x 0.94 mm I.D.</td></tr><tr><td>ガラスビーズ滅菌器</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ヒーティングパッド</td><td>ハーバード装置</td><td>py872-5272</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>注入装置</td><td>ワールド精密機器</td><td>空気圧ピコポンプPV820</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>縫合糸コーティング Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>V4914</td><td>腹膜縫合</td></tr>糸 <tr><td>Thr. Supramid</td><td>Serag Wiessner</td><td>TO07171L</td><td>Skin Suture</td></tr></tbody></table>

マウスの遺伝子操作は、視床下部を介して開発<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーション

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

開発哺乳類の脳の特定の領域の遺伝子組み換えは非常に強力な実験的なアプローチです。しかし、小説のマウス変異体を生成することはしばしばいらいら遅いです。これは、合理的なポスト手術用生存率と子宮内現像マウスの脳へのアクセスが可能であることが示されている。それでも、この手順と結果は脳の発達の最も表面的かつ簡単にアクセスできる部分はほぼ全面的に報告されており、皮質、すなわち 。視床、狭く、より内側の領​​域は、ターゲットへのより困難であることが判明しました。特に深い核、視床下部のものへのトランスフェクションは、最も困難なので、非常にいくつかの結果が報告されているかもしれないです。ここでは、全体の視床下部の神経上皮またはエレクトロを通じてトランスフェクションのためにその一部を（視床下部の領域）が対象とする手順を示しています。我々のアプローチの鍵は、長い昏睡回、T中の注射ですhird心室、適切な種類と電極の位置。さらに、我々はターゲティング最も凹ん視床核、乳頭体のその後の組織学的分析の結果を示す。

ほとんどの視床下部のニューロンはやや短いマウス開発27,28に翻訳ラット26で出生デートの分析によると、E11.5 E15.2の間に生まれています。視床下部の神経発生のピークはE12.5 29-31に到達する。そこで、本研究（E12.5）のために選択されたトランスフェクションの年齢で、視床下部ニューロンの大部分は、任意の与えられた吻側 - 尾レベルでラベルを付けることができます。 厚いビブラトームタイプのセクションにE18.5で分析（ 図3Aおよび3B）は視床下部の神経上皮の全体の吻側-尾拡張はエレクトロポレーション（ 図3A）にアクセス可能であることを示しています。任意の年齢で、ニューロンは系統学32と一致して、すべてのメディオ·横のレベル（ 図3B）で標識することができます。乳頭体（MBO）が最もventraに凹部を並べる神経上皮から開発する神経核であるlお...

視床下部の機能や医療の重要性にもかかわらず、<em&gt;子宮内</emその開発の&gt;遺伝子操作はほとんど試みられていない。私たちは、の詳細な手順を示す<em&gt;子宮内</em&gt;マウスの視床下部へのエレクトロポレーションと合計と部分（地域）視床下部のトランスフェクションの代表的な結果を示しています。

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

この手順の全体的な目的は、子宮内で発育しているマウス胚の視床下部にプラスミドDNAを導入し、目的遺伝子の機能を活性化または抑制することである。まず、妊娠マウスを麻酔し、開腹術によって子宮を露出させる。次に、胚の脳の第三脳室にDNA溶液を注入する。次に、陽極を胎盤と胚の頭部の間の子宮内に配置します。陰極を子宮の外表面に配置し、電気パルスを印加します。最後のステップとして、6日後にトランスフェクションされた胚の脳を取り出します。最終的に、蛍光顕微鏡を用いて、導入された細胞の表現型の変化（数、形状、位置、マーカーの発現など）を解析します。ウイルス導入などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、第一に特別な予防措置や2つの施設を必要としないこと、第二に特定の領域を標的とすることが可能であることです。そして第三に、電穿孔法を用いることで、候補遺伝子のスクリーニングをより迅速に行うことができます。一般的に、この手法に不慣れな方は苦労することがあります。なぜなら、第三脳室へのDNA溶液の注入および針電極の適切な配置には、高度な手技と一定の経験が必要だからです。本手法は、視床下部の発生分野、特に細胞移動に関連する問いや、個々の領域や核がどのように遺伝的に規定されるかという問いを解決するのに役立ちます。羊水の喪失による初期の高い失敗率を低減するためには高品質なガラスマイクロピペットが不可欠であるため、まずピペットの作製からこの手順を開始してください。DNAを調製するために、精製されたエンドトキシンフリーの血漿DNAを0.1% fast greenを含むPBSに溶解し、最終濃度を1〜2 µg/µLにします。fast greenを用いることで、注入液を胚の脳室内で可視化できます。次に、10 µLのDNA溶液をガラスマイクロピペットに充填します。次に、ガラスマイクロピペットを注入システムまたはマウスピペットに接続します。このステップで、ヒーティングパッドを備えた手術台と手術器具を準備してください。胚の視認性を高めるために、寒色系光源を点灯させます。その後、ガラスビーズ滅菌器を用いて手術器具を消毒します。次に、妊娠マウスをイソフルランで麻酔します。マウスの麻酔後、乾燥を防ぐため目に軟膏を塗布します。その後、麻酔を継続的に維持するためにマスクを顔に装着します。次に、マウスを腹側が上になるようにヒートパッドの上に置きます。テープで4肢を固定し、体を安定させます。尾をつまんで反射を確認し、マウスが完全に麻酔状態にあることを確認してください。次に、腹面を剃毛し、ヨード溶液で消毒します。腹壁の皮膚に約1〜1.5 cmの縦切開を加えます。その後、腹膜を切開します。次に、切開部位の周囲に脱脂綿を配置します。脱脂綿をPBSで洗浄します。鈍的なピンセットを用いて慎重に引き出し、片側の子宮角を露出させます。子宮筋層や子宮を強く引っ張らないようにしてください。子宮内が高圧になると、注入時に胚液が流出する可能性が高まり、結果として流産につながるためです。その後、子宮角をPBSで洗浄したガーゼの上に置き、数分おきにPBSで洗浄して湿った状態を維持してください。次に、顕微鏡下で、脳室が視認できるように子宮を保持します。不適切な位置にある胚を無理に動かさないでください。これは流産の可能性を高めるだけです。胚の頭部を上から見て、左右の大脳皮質半球の間の裂溝にある隙間を確認します。半球は容易に区別でき、その内部にある側脳室は通常、やや暗い形状として認識されます。DNA注入に最適な方向で胚が位置している場合は、子宮壁を貫通して一度に第三脳室に進入することが可能です。あらかじめ調製したDNAが入ったガラスマイクロピペットを、子宮壁に対して45度の角度に保持し、大脳半球間裂の吻側端から、深さ約1 mmまで穿刺します。これにより、ガラスマイクロピペットの先端は側脳室ではなく、脳の第三脳室に入ります。その後、約1 µLのDNA溶液を第三脳室に注入します。注入が適切であれば、脳室内が緑色の液体で満たされます。同一の子宮角にあるすべての胚に対して、同様の手順を繰り返します。これにより、DNA溶液が心室液と均一に混ざり合い、神経上皮全体に行き渡るための時間を確保できます。次に、エレクトロポレーターの電源を入れ、胚の齢に応じて設定を調整します。ステンレス製の針電極を陽極に、円形の平電極を陰極に使用し、背側を上にした胚を選択してエレクトロポレーションを行います。次に、針電極の先端を押し下げて、胚の頭部の隣にある羊膜嚢と胎盤の間の子宮壁を貫通させます。このとき、もう一方の手の人差し指を突き当て台として使用します。中脳の高さ付近で、電極先端の約5 mmが羊膜嚢と子宮壁の間にあるようにしてください。これがターゲット電極となるため、その位置によって視床下部神経上皮のどの部分が最も形質導入されやすいかが決定します。次に、もう一方の手で、胚の頭部の反対側にある子宮壁の外側に円形の平板電極を配置します。その後、電極の間で胚をそっと挟みます。ペダルスイッチを使用して電圧を印加します。その後、もう一方の手の人差し指で子宮を固定しながら、針電極をゆっくりと子宮から引き抜きます。穿刺した壁から羊水が流出した場合、通常、胚は流産します。すべての胚への注入および電穿孔が完了した後、子宮をマウスの腹腔内へ非常に慎重に戻し、元の位置に正確に配置します。次に、腹腔を生理食塩水で湿らせてから閉鎖します。腹膜を外科用キャットガットで縫合し、その後、より強度の高い縫合糸で皮膚を縫合します。ヨード溶液で腹部表面を消毒し、疼痛緩和のために非ステロイド性抗炎症薬を皮下注射します。次に、母マウスを麻酔機から外し、ヒーティングパッドで加温したケージに入れます。マウスが麻酔から完全に回復するまで観察し、感染や疼痛の兆候なく処置から回復していることを確認するため、毎日チェックを行います。このステップでは、解析予定日に合わせて胚または出生後個体を採取します。DNAを注入しエレクトロポレーションを行った胚を選択し、この実体顕微鏡下で脳を解剖します。その後、適切な領域に緑色蛍光シグナルがあるかを確認してください。選択した胚の脳を解析するために、組織を4%パラアルデヒドで短時間固定します。次に、それを4%アガロースまたはゼラチン・アルブミンに包埋します。その後、ビブラトームを用いて脳を切片化します。これらの図は、E 12.5において蛍光レポーター遺伝子（GFPまたはCFP）を保持するプラスミドDNAを子宮内でトランスフェクションした後の視床下部を示しています。こちらは、吻側から尾側にかけてトランスフェクションされた視床下部を示す矢状断であり、こちらは正中線から外側軸に沿った異なるレベルで標識細胞を示す横断切片です。この矢状断では、特異的にトランスフェクションされた乳頭体と、その特徴的な軸索樹の標識が示されており、この横断切片の electro parade 側には、E 12.5に誕生したニューロンに対応する標識帯が示されています。切片をより詳細に解析するため、乳頭陥凹から伸びる放射状グリア突起の平面に平行な水平切片を作製した。E 12.5日にトランスフェクションされた神経上皮から出生したambi Oニューロンを、E 18.5日にGFP抗体を用いて同定した。この例では、抗体によってMBO細胞の限定的なグループが標識されています。このグループは、E 12.5の前後に誕生したMBOニューロンに対応する、標識されていない外側および内側の2つのMBO領域の間に位置しており、nestinに対する抗体で共染色されています。赤色で示されているのは、神経上皮の放射状グリア突起上を移動する、個別に標識されたニューロンの移行様式です。この手法を習得し、適切に実施すれば、30分で完了させることができます。このビデオを視聴することで、第三脳室へのDNA注入方法、および視床下部を効率的に標的とするために、胚、頭部、胎盤の間でどのように針を陽極として配置させるかを十分に理解できるはずです。本手順に続き、免疫組織化学染色やin situハイブリダイゼーションなどの他の手法を行うことで、形質転換されたニューロンの表現型に関するさらなる疑問を明らかにすることができます。

genetic-manipulation-mouse-developing-hypothalamus-through-utero

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

E15マウス胚の子宮内での脳室内注入とエレクトロポレーションで

ここではでマウス網膜神経節細胞（RGCs）で遺伝子発現を操作するための2つのテクニックを紹介...

マウス網膜神経節細胞における遺伝子発現のための子宮内および生体外でのエレクトロポレーションで

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この資料では詳細に子宮内で大脳皮質およびマウスのE14.5における海馬をエレクトロポためのプロトコルについて説明します。また、このこれらの2つの脳領域で樹状突起と棘を研究する貴重な方法であることを示している。...

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子宮外エレクトロポレーションおよびマウスの海馬組織の器官型スライス培養

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胎内ナノ注射(NEPTUNE)によるマウス神経板ターゲティング(胎内7.5日目)

学ぶマウス子宮内電気穿孔法による視床下部への遺伝子導入技術。DNA溶液を第三脳室に注入し電極を配置して遺伝子機能を操作し、発生神経科学の研究に応用できます。

マウスの遺伝子操作は、視床下部を介して開発

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