モルホリノオリゴヌクレオチドの脳室マイクロインジェクションを使用した大人のゼブラフィッシュ脳における遺伝子発現のマイクロマニピュレーション

この手順の全体的な目的は、成体ゼブラフィッシュの脳の脳室にモルフォリノオリゴヌクレオチドをマイクロインジェクションし、放射状グリア細胞における遺伝子の活性をノックダウンすることです。まず、ゼブラフィッシュに麻酔をかけます。次に、バーブ付き歯科用針を用いて、視神経丘の上に重なるように頭蓋骨にスリットを作成します。

その後、切開部位から脳室液にモルフォリノ溶液を注入します。最後に、蛍光顕微鏡下で注入効率と正確性を確認します。最終的に、モルフォリノによる遺伝子ノックダウンを通じて、成体ゼブラフィッシュ脳の放射状グリア細胞における標的遺伝子からのタンパク質産生を、効率的かつ広範囲に抑制した結果を得ることができ、これは組織切片および免疫組織化学染色によって評価可能です。

トランスジェニック手法や電気穿孔法に基づく導入法などの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、CVMIがより短時間で済み、放射状グリア細胞の全集団をより効率的に標的にできる点にある。また、調整が可能であり、多くの遺伝子を同時にノックダウンできる。注入混合物を調製するために、まず500 MicromolarのMorphoストック溶液を作成する。

PBSを用いて10回分の注入用溶液を調製します。希釈済みまたは未希釈のmorpho溶液9 µLと、蛍光追跡染料1 µLを混合して、10 µLの注入混合液を調製してください。これを室温で保存します。ニードルプラーを用いて、以下のパラメータに従ってガラス注入用キャピラリーを調製します。

圧力源の電源を入れ、圧力設定を 50 PSI または 3.5 bars に調整します。マイクロインジェクターの設定を次のように調整します。保持圧力（Hold pressure）を 20 PSI、排出圧力（eject pressure）を 10 PSI、期間値（period value）を 2.5 および 100 milliseconds に設定します。

ゲーティングの範囲。リング照明を点灯させ、顕微鏡ステージの上にリングを配置します。キャピラリーホルダーを顕微鏡の脇の適切な位置に設置します。

ガラスキャピラリーをホルダーに挿入し、注入角度を45度に調整します。精密ピンセットを使用してガラスキャピラリーの先端を折断し、オリフィスからの圧力出力を校正します。針先を魚の飼育水に浸し、連続的な圧力パルスを加えた際に、気泡が一列に形成されれば、圧力またはオリフィスサイズが最適であることを示しています。

ガラスキャピラリーに注入液を充填します。気泡が入らないように圧力をかけ、ガラスキャピラリーの先端と充填された注入液の間にある空気を除去します。0.1%濃度の麻酔薬meab溶液を調製した後、必要な数の魚を魚用水が入った輸送容器に移します。

魚用飼育水200 millilitersにMISPストック溶液5 millilitersを混ぜ合わせ、麻酔剤の作業溶液を調製します。注射に使用するため、ペトリ皿の半分まで麻酔剤を満たします。魚を麻酔剤に入れ、動きが止まるまで静置します。

次に、ネットを用いて麻酔液を入れたペトリ皿に移動させます。切開しやすくするため、ピンセットで魚をそっと固定し、頭をわずかに下向きに傾けます。30ゲージのバーブ針の先端を用い、頭蓋骨に小さな切り込みを入れます。この際、脳組織を損傷させるため、深く刺しすぎないように注意してください。

魚を保持したまま、ガラスキャピラリーの先端を切開部位から約0.5 mm挿入し、脳組織に接触しないように注意しながら頭部方向へ向けます。溶液を注入すると、すぐに拡散します。その後、魚を新鮮な飼育水に移し、回復させます。

約 30 分後、魚を再度麻酔し、蛍光顕微鏡下で液体の広範囲な分布を確認します。これは赤色蛍光に基づいて行います。その後、魚を水槽に戻し、飼育環境に復帰させます。

行動解析への利用や、本ビデオに示した組織標本の作製を行うまで、正確な注入が行われれば、注入液は脳全体に拡散し、脳室表面に近い細胞を効率的に標的とすることができます。しかし、ガラスキャピラリーが脳組織を貫通してしまった注入では、注入部位に濃い蛍光シグナルが現れます。また、注入量が不十分な場合は、弱い蛍光シグナルしか観察されません。

この図は、vivo morphoが脳室表面から数個の細胞径分まで浸透できることを示しており、したがってコントロールMorphoと比較して脳室細胞を効率的に標的にできることを証明しています。PCNAに対するmorphoの注入は、脳室細胞における遺伝子発現を効率的にノックダウンします。これらの免疫蛍光画像において、A-B-R-D-Uパルスチェイス実験後のBRDUおよびQCD免疫染色は、アンチセンスmorphoによるPCNAのノックダウンが新生ニューロンの著しい減少をもたらすことを示しており、CVMIを用いて内因性遺伝子をノックダウンし、その後の機能的影響を導き出せることを示唆しています。

この技術の開発後、神経科学分野の研究者が成魚の魚類脳における再生的神経新生反応に関与する分子メカニズムを探索するための道が開かれました。