Name: ラット中枢神経系および末梢リンパ節の組織切片での免疫組織化学的解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学ぼう、ラットの中枢神経系および末梢リンパ節の組織切片における二重免疫組織化学染色法。パラホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋、アンチゲンリトリーバルを含む詳細なプロトコルにより、タンパク質の局在パターンを可視化します。

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彼らの指導とサポートに対して、ハンス・ラスマンとヤン・バウアーに感謝します。また、優れた技術支援を提供してくださったKatalin Benedek氏と、批評的および言語的な評価を提供してくださったCaroline Westerlund氏にも感謝します。
この研究は、バイオジェン・アイデック、ウェナー・グレン財団、スウェーデン研究評議会、スウェーデン神経障害者協会、スウェーデン脳財団、EU 6THフレームワークEURATools (LSHG-CT-2005-019015)、ニューロプロミス (LSHM-CT-2005-018637) からの助成金によって支援されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に関与していませんでした。

倫理的なステートメント 本研究は、N15 / 10とによって承認されたN65 / 10、、倫理的な許可N338 / 09下の実験動物のためのスウェーデン国家委員会と欧州共同体理事会指令（609分の86 / EEC）のガイドラインに従って行われます北ストックホルムの動物倫理委員会。 1.組織標本<ol><li> 灌流＆固定 <ol><li>左心室を介しtranscardial灌流を行うためにイソフルランで動物を麻酔。 0.1 M PBS（PFA）中の4％パラホルムアルデヒドに続く血液成分を除去するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて血管系のリンスを開始します。 </li><li> PFAに浸漬することにより、解剖脳、脊髄及び末梢LN組織を固定します。 4℃で24時間後、さらに処理するまで4℃でPBSにPFAから組織や店舗を転送します。あるいは、商業PBSに、250ミリリットルS＆で9グラムのNaClを溶解＃246; rensenバッファと750ミリリットルを脱イオン水（のdH 2 O）を追加します。 0.2 Mソレンセン緩衝液（pH7.4）を調製することは2.5 L の dH 2 O中に13.8グラムのNaH 2 PO 4×1H 2 Oおよび71.2グラムのNa 2 HPOのx 2H 4 2 Oに溶解します</li></ol></li><li> 脱水＆埋め込みます <ol><li>カミソリの刃を使用して、約5ミリメートルの厚さの部分に組織を切断します。 </li><li>キシレン、最後にパラフィン（ 表1）、続いて組織テックVIP真空浸潤プロセッサ（エタノールの上昇濃度に浸漬に基づく標準的な手順を使用して、組織の硬化処理（脱水）を開始します。 </li><li>金型内に組織を置き、「パラフィンブロック」を形成するために、試料周辺の流動パラフィン中に注ぎます。長期保存は、室温（RT）が必要です。しかし、セクショニングの前に、 例えば 、ブロックを冷却するために4℃で（O / N）で一晩推奨されます。</li></ol></li></ol> 2.セクショニング<ol><li>ナイフを横切って前後に移動することができる、スレッジミクロトームの固定ホルダーにパラフィンブロックを配置します。ブロックとミクロトームナイフ（すなわち、ナイフの幾何学的形状に依存するだけでなく、切削速度および技術上の）間の最適な角度を調整します。 </li><li>パラフィンブロックから5μm厚断面 - 3をカット。 </li><li>水容器の中にだけ切断した断面を転送し、スライドガラス上に水から、その後、それをマウントします。 </li><li>残留水および潜在的な気泡を除去するためにペーパータオルに対して慎重に取り付けられた部分を押してください。商業的にプレコーティングされた接着剤ガラススライドをお勧めしますが。 </li><li> 60°C - ドライは50にストーブに時間のカップルのためのスライドをマウントしました。 </li></ol> 3.脱パラフィン（再水和＆内因性ペルオキシダーゼブロッキング） <ol><li>スライドを浸し2倍キシレン（あるいはキシレン代替品へXEM-200）、毎回15から20」。 </li><li> 99％エタノールですすいでください。 </li><li>内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするために、0.25％過酸化水素を含むメタノール溶液に30 &#39;のためのセクションをインキュベートします。 </li><li>蒸留水で終わる、増加水分含量（99％、70％エタノールを使用して再水和を継続します。 </li><li>この点からカバーの装着までのセクションでは、湿った保たする必要がスリップ。 </li></ol> 4.抗原回復<ol><li> （EDTA緩衝原液は、1.21グラムトリスおよび50ミリリットルのdH 2 Oに溶解した0.37グラムのEDTAが含まれている60のための抗原回復溶液（この場合はEDTA pH8.5の緩衝液）」のスライドを沸騰するための蒸し器を使用してください。作業を準備します47.5ミリリットルのdH 2 O中での溶液希薄2.5ミリリットルのEDTA原液）。 </li><li>約室温でのスライドをクールダウン。 1時間してから3すすぎ - トリスで5倍は0.05 Mトリス及び0.15MのNaClからなる（TBSは、代わりにPBSを使用）緩衝生理食塩水; pHを7.5に調整のwi第HClです。あるいは、商業TBSを使用します。 </li></ol> 5.非特異的結合部位をブロックします<ol><li>非特異的なバックグラウンド反応を回避するために、10％ウシ胎児血清（FCS）、90％DAKO緩衝液を含有するブロッキング溶液中で30 &#39;室温で切片をインキュベートします。 </li></ol> 6.ダブル免疫標識：プライマリ腹筋との同時インキュベーション<ol><li>ブロッキング溶液中で一次抗体の必要量を希釈し、O / Nで4℃でインキュベートします。 （; 1 ED1：1,000）α-CD68またはα-IBA1（Aif1、1：1,000）、またはα-CD8α（オックス-8; 1：200）：;二重免疫染色のためにα-エオタキシン（300 1 CCL11）を組み合わせ。 </li><li> （代替的に10倍希釈したDAKOバッファを使用）TBSバッファーで3〜5倍のスライドを洗浄します。 </li><li>ブロッキング溶液中で、室温で1時間インキュベートする：二次抗体の必要量（200ビオチン化抗ヤギおよびAP結合抗マウス、両方1）を希釈します。 </li><li> （私たちをTBS緩衝液で5倍 - スライド3をすすぎEは、代替的に10倍）は、DAKO緩衝液に希釈しました。 </li><li> RTでの1時間ブロッキング溶液で希釈したアビジン - 西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（HRP）でスライドをインキュベートします。 </li><li> TBS緩衝液で5倍（あるいは10倍希釈DAKOバッファを使用） - スライド3をすすいでください。 </li></ol> 7.可視化<ol><li> 結合したAP標識二次抗体の可視化 <ol><li> 1リットルのdH 2 O 12.1グラムのトリスを溶解し、0.1M Tris-HCl緩衝液を調製し、HClを用いによってpHを調整します。 1 Mレバミゾール溶液を調製するために同一のTris-HCl緩衝液を使用します。 dH 2 O中で新鮮に4％のNaNO 2溶液を準備</li><li>ファーストブルー（FB）基板（1標準的なガラスキュベットに必要なボリュームが）ガラス管に312.5μlのDMF中の6.25mgのナフトール-AS-MXリン酸を溶解し、予め温め50mlに攪拌の50ミリリットル（37を取得するには°C）のTris-HCl緩衝液。 312.5μlの2 Nに12.5 mgのFB RR塩を溶解するためにHClが以前prepaの312.5μlを添加します赤の4％のNaNO 2溶液と予め温めトリス-HCl緩衝液の同じ50 mlの中に混合物を攪拌します。黄色の液体が透明になるまで軽く振ると、最終的に先に調製した1 Mレバミゾール溶液を77μlを添加します。ろ液を混合して得られたガラスキュベットに入れスライド上に注ぎます。 </li><li> 37℃でのインキュベーションを開始し、約光学顕微鏡下でのプロセスを開発して制御します。すべての15から30分。ファジー回した場合は、新鮮な混合物とFB液を交換してください。 </li><li> PBSバッファに続いてTBSバッファーと転送と5倍 - スライド3を洗い流します。 </li></ol></li><li> 結合したビオチン化二次抗体の可視化 <ol><li> DABは、/ H 2 O 2 49ミリリットルのPBSで1ミリリットルDABストック溶液（1mlのPBSあたり25ミリグラムのDAB）を希釈することにより、現像液を準備します。注ぐ前のセクションに16.5μlのH 2 O 2、ろ液を追加します。 </li><li>眉を沈殿させるに色素原DABの変換n個の顔料は即時にすることができます。 （でも数秒より長いインキュベーションが高いバックグラウンドを上げ、特定の信号をマスクすることができる）、光学顕微鏡下で現像処理を制御します。 </li><li>褐色顔料の沈殿物の強度は、あるいは5 &#39;の2％硫酸銅と、0.9％のNaClからなる溶液中でインキュベートすることによって向上させることができます。 </li><li>スライド3をすすぎ- PBSで5倍、最終的にのdH 2 Oで、代わりに水道水を使用しています。 </li><li>カバーは、水性GelTolマウンティング培地を使用することにより、水から直接スリップしてスライドをマウントします。気泡を作成しないでください。 </li><li> 例えば、O / N、4℃で、封入剤の完全な乾燥を可能にします。ストアは、RT上でスライドを乾燥させました。 </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1。 </td><td> ％エタノール</td><td> 20 &#39; </td><td> 40°C </td></tr><tr><td> 2。 </td><td> ％エタノール</td><td> 60＆＃39; </td><td> 40°C </td></tr><tr><td> 3。 </td><td> ％エタノール</td><td> 90 &#39; </td><td> 40°C </td></tr><tr><td> 4。 </td><td> ％エタノール</td><td> 60 &#39; </td><td> 40°C </td></tr><tr><td> 5。 </td><td> ％エタノール</td><td> 90 &#39; </td><td> 40°C </td></tr><tr><td> 6。 </td><td> ％エタノール</td><td> 60 &#39; </td><td> 40°C </td></tr><tr><td> 7。 </td><td> ％エタノール</td><td> 90 &#39; </td><td> 40°C </td></tr><tr><td> 8。 </td><td> ％エタノール</td><td> 120 &#39; </td><td> 40°C </td></tr><tr><td> 9。 </td><td>キシロール</td><td> 30 &#39; </td><td> 40°C </td></tr><tr><td> 10。 </td><td>キシロール</td><td> 60 &#39; </td><td> 40°C </td></tr><tr><td> 11。 </td><td>パラフィン</td><td> 60 &#39; </td><td> 60°C </td></tr><tr><td> 12。 </td><td>パラフィン</td><td> 60 &#39; </td><td> 60°C </td></tr><tr><td> 13。 </td><td>パラフィン</td><td> 60 &#39; </td><td> 60°C </td></tr><tr><td> 14。 </td><td>パラフィン</td><td> 120 &#39; </td><td> 60°C </td></tr></tbody></table> 組織-Tek社のVIP真空浸透プロセッサによって 表1 組織処理。

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<li>Van Hecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+Immunohistochemical+Staining+Today%3A+Choices+to+Make%2C+Challenges+to+Take%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take.</a> Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

標準的なIHC手順は、多くの場合、一般的に豊富な経験だけでなく、「試行錯誤」アプローチを意味し、最適な結果を得るために、具体的な調整を必要とします。組織標本からターゲットの可視化まで、プロトコルのほぼ各ステップを個別に最終的な結果を改善するために修飾を設計するために行ってもよいです。ここで紹介する二重染色プロトコルは、特に神経炎症の影響を受け、ホルマリン固定、パラフィン包埋したラットCNSおよびLN組織切片における私たちの目的の標的タンパク質間の相互関係を評価するための調整ターゲットとIHCベースのタンパク質を例示しています。このように、IHCの技術を学ぶためのチュートリアルとしてだけでなく、より高度な試験のためのインスピレーションの源として使用することができます。しかし、提示され、ここよりも、および/または他の組織中の他のタンパク質を標的とするため、このプロトコルの単なる再生は次善の結果を生成する可能性があることに留意すべきです。 CCL11は、コンジェニックラット系統10のCNSにおけるそれぞれのmRNAレベルのアップレギュレーションを示し...

高度なハイスループットの使用にもかかわらずmethylome、トランスクリプトームまたはプロテオームさえレベルで実行解析、免疫染色は、組織試料、細胞培養物又は細胞塗抹標本に直接タンパク質検出のための黄金の標準のままです。局在/分布パターンを明らかにすることによって、免疫組織化学（IHC）は、相対比と標的タンパク質の地形的相互関係を評価し、さらにそれらの生物学的活性を示すことができます。したがって、IHCは広く、診断、治療の評価のために、 例えば 、臨床研究のためなど病気のメカニズム、動物モデルにおける機能と表現型の変化の研究を利用しています基本的に組織学、病理学、生化学および免疫を備え、IHCが大幅に蛍光標識した抗体は感染組織1に肺炎球菌抗原を同定するために初めて使用された1941年以来進めてきました。 VIHCによる細胞製品およびコンポーネントのisualizationは、その特定の抗原（Ag）からに対する抗体（ABS）の結合に基づいています。フルオロフォアタグ付けされた抗体を使用するほかに、免疫反応はまた、ペルオキシダーゼ2,3またはアルカリホスファターゼ4のような酵素を使用して可視化することができます。放射性標識は、オートラジオグラフィーによって可視化しながら、さらに、金コロイドタグ抗体5は 、光と電子顕微鏡の両方により特異的な抗原-抗体相互作用を検出するために使用されます。 Agを抗体の免疫反応は、直接的および間接的な方法によって検出することができます。それは直接標識一次Absの6を使用していますように直接的な方法は、より速く、より簡単な本質的です。しかし、感度の大幅な不足のためには、間接的な方法は、直接のものに好適です。二段階の間接検出手順は、最初のように、非標識一次腹筋を必要とし、第二層7として、主要な腹筋に対して向けられた二腹筋標識。信号増幅は、さらに二次抗体に結合する酵素 - 結合された第三抗体（三段間接法）を含むことによって達成することができます。一般的に使用される間接的な検出方法は、アビジン - ビオチンペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ（PAP）です。あるいは、アルカリホスファターゼantialkalineホスファターゼ（APAAP）複合体ではなく、PAP法を用いることができます。特に、アルカリホスファターゼ（AP）メソッドは、免疫ペルオキシダーゼ法4よりもさらに敏感であるように思われます。アビジン - ビオチン複合体（ABC）法は、標識アビジン - ビオチン複合体（LAB）のいずれかとの組み合わせで、ビオチン化二次抗体を使用し、またはストレプトアビジン - ビオチン複合体（SLAB）標識しました。検出感度はさらにペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ8で標識したアビジンを含むことによって増大させることができます。使用中の他の検出方法は、ポリマー標識、チラミン増幅および免疫ローリングサークル9です。特に、別の検出方法は、同じ組織内の複数のAgの検出のために組み合わせることができここに提示1978年4。同時二重免疫染色で初めて報告されたサンプルは、それぞれ、ペルオキシダーゼ結合し、AP結合二次抗体を用いて、ホルマリン固定、パラフィン包埋されたラットCNSおよびLN組織切片で行いました。信号は、それぞれ、3,3&#39;- diaminobencidine（DAB）色素原とファーストブルー（FB）APAAP複合体を用いて可視化しました。

<table><tbody><tr><td colspan="4">試薬</strong</td></tr><tr><td>>イソフルラン（イソフルラン）:1-Chlor-2,2,2-トリフルオロエチル（ジフルオロメチルエーテル〉 2-Chlor-2-（ジフルオロメトキシ)-1,1,1-トリフルオレタン％ ）C3H2ClF5O)</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td>眼照射.おそらく生殖能力に影響を与え、子宮内の赤ちゃんにダメージを与えます。適切に装備された麻酔環境でのみ投与してください。.</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>メルク</td><td>1.0604</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、錠剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(OH(CH2O)nH(n = 8-100))、1x PBS</td><td>Apl pharma</td><td>34 24 28</td>の4%<td>健康被害。腐食 性。燃えやすい。急性毒性。</td></tr><tr><td>エタノール &#8805;99.5%、絶対(CH<サブ>3</サブ>CH<サブ>2</サブ>OH)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>459844-1L</td><td>可燃性。</td></tr><tr><td>キシレン(キシレン、組織学的グレード;C<サブ>6</サブ>H<サブ>4</サブ>(CH<サブ>3</サブ>)<サブ>2</サブ></td>シ<td>グマ・アルドリッチ</td><td>534056</td><td>フラマブル。急性毒性。</td></tr><tr><td>Histo-Comp Paraffin Wax</td><td>Tissue-Tek</td><td>V0-5-1001</td><td></td></tr><tr><td>接着顕微鏡スライド</td><td>Starfrost</td><td>MIC-1040-W</td><td></td></tr><tr><td>キシロール代替品 XEM-200 </td><td>Vogel GmbH</td><td>ND-HS-200</td><td>呼吸器感作。発癌性。</td></tr><tr><td>-CD8 (Ox-8) マウス抗ラット、一次抗体</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA48G</td><td></td></tr><tr><td>&-Iba1 (AIF1) マウス抗ラット、一次抗体</td><td>Millipore</td><td>MABN92</td><td></td></tr><tr><td>&-CD68 (ED1) マウス抗ラット、一次抗体</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA341R</td><td></td></tr><tr><td>&α;-eotaxin C-19 (CCL11) ヤギ抗ラット、一次抗体</td><td>Santa Cruz BT</td><td>SC-6181</td><td></td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ (AP) 標識二次抗体</td><td>デンマーク ダコパッツ</td><td>D0314</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化二次抗体</td><td>アマシャム バイオテック</td><td>RPN1025</td><td></td></tr><tr><td>アビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体 (HRP) </td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>A3151</td><td></td></tr><tr><td>ナフトール AS-MX リン酸 (C19H18NO5P)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4875-1G</td><td>急性毒性。</td></tr><tr><td>ファストブルーRRソルト、アゾイックジアゾ No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FBS25</td><td></td></tr><tr><td>塩酸レバミゾール (C11H13ClN2S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31742</td><td>急性毒性。</td></tr><tr><td>3,3'-ジアミノベンジジン四塩酸塩(DAB発色剤)</td><td>DAKO</td><td>S3000</td><td>非常に可燃性です。毒性。</td></tr><tr><td>硫酸銅(CuSO4)</td><td>Merck</td><td>1.02791</td><td>急性毒性。環境ハザード。</td></tr><tr><td>GelTol 水性実装媒体</td><td>サーモエレクトロンコーポレーション</td><td>230100</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素、30% (H2O2)</td><td>Merck</td><td>107210</td><td>急性毒性。</td></tr><tr><td>メタノール(CH3OH)</td><td>Fluka</td><td>65543</td><td>急性毒性。呼吸器感作。発癌性。可燃 性。</td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、TRIS塩基(C4H11NO3)</td><td>AppliChem</td><td>A1379</td><td>皮膚および眼の刺激。</td></tr><tr><td>トリス緩衝生理食塩水(TBS)、錠剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5030</td><td></td></tr><tr><td>リン酸水素ナトリウム二水和物 (Na2HPO4 x 2H2O)</td> <td>メルク</td><td>1.0658</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素ナトリウム一水和物 (NaH2PO4 x 1H2O) </td><td>メルク</td><td>1.06346</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清 (FCS) </td><td>Cambrex BioScience</td><td>DE-14-802F</td><td></td></tr><tr><td>DAKO cytomation wash buffer 10x </td><td>DAKO</td><td>S3006</td><td>2-8 °Cで保存する必要があります。Cは細菌の増殖を抑制します。泡立ちを避けてください。</td></tr><tr><td>N、N-ジメチルホルムアミド;DMF (C3H7NO)</td><td>Fluka</td><td>40250</td><td>可燃性。急性毒性。</td></tr><tr><td>グラスカバースリップ24 x 36 mm </td><td>Menzel-GL&#228;ser</td><td>BB024036A1</td><td></td></tr><tr><td>塩酸、濃度 (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721</td><td>腐食性、刺激性、透過剤。肺感作剤(酸性ミストとして)。毒性。</td></tr><tr><td>塩酸溶液容積測定、2 M HCl (2 N)</td><td>Fluka</td><td>71826</td><td>腐食性、刺激性、透過剤。肺感作剤(酸性ミストとして)。毒性。</td></tr><tr><td>亜硝酸ナトリウム、ReagentPlus、&#8805;99.0% (NaNO2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2252</td><td>酸化剤。毒性。環境に危険です。</td></tr><tr><td>エチレンニチリロテトラ酢酸二ナトリウム塩二水和物(EDTA;C10H14N2Na2O8 x 2H2O)</td><td>Merck</td><td>1.08454</td><td>経口暴露は、生殖および発達への影響を引き起こす可能性があります。</td></tr><tr><td colspan="4"> Equipment</td></tr><tr><td>Tissue-TekV.I.P 真空浸透プロセッサ</td><td>Sakura</td><td>5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz</td><td></td></tr><tr><td>Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome </td><td>ハッカー機器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>家庭用食品スチーマー </td><td>Braun</td><td>MultiGourmet FS 20</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡 </td><td>Leica Polyvar 2</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ラット中枢神経系および末梢リンパ節の組織切片での免疫組織化学的解析

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

免疫組織化学（IHC）は、高度に、特定の信頼性と魅力的なタンパク質の可視化を提供します。 IHCベースの多色標識の正しい性能および解釈は、中枢神経系（CNS）のような高脂肪含有量を有​​する組織中の標的タンパク質との間の相互関係を評価するために利用される場合は特に、困難です。 我々のプロトコルは、特にラットCNSおよび神経炎症によって影響末梢リンパ節（LN）の両方の構造および可溶性タンパク質の検出のために調整し、標準的な免疫標識技術の改良を表します。それにもかかわらず、さらなる改変の有無にかかわらず、我々のプロトコルはそうであってもここで紹介する以外の臓器や種で、他の関連するタンパク質標的の検出のために使用することができます。

二重免疫染色（共染色）は、ホルマリン固定、パラフィン包埋されたラットCNSおよびLN切片で行いました。 3-5ミクロン厚の組織切片は、スレッジミクロトームを用いて切断し、プレコーティングされた接着剤のガラススライド上にマウントされ、その後、以前10,11,12に記載のように処理しました。簡潔には、組織の再水和および内因性のペルオキシダーゼの不活性化を脱パラフィン後、切片を、非特異的結合部位を除去するブロッキング工程に続いて、抗原回復処理を行いました。 ⅱ）CCL11 / ED1及びiii）CCL11 / CD8、ⅰ）CCL11 /伊庭-1：同時染色は、以下の組み合わせで行いました。各同時染色のために使用される主要なABSが彼らの同時インキュベーションを有効にして2つの異なる種（それぞれ、ヤギ、マウス、）、で育ちました。イバ-1、ED1およびCD8ながらCCL11は、褐色のペルオキシダーゼ反応生成物によって可視化した、青AP信号により可視化しました。 <p class="jove_content" fo:kここで提示EEP-together.w...

ここでは、ホルマリン固定、パラフィン包埋ラット中枢神経系(CNS)および末梢リンパ節(LN)組織切片における二重免疫染色のための最適化された詳細なプロトコールを紹介します。

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

この手順の全体的な目的は、ラット組織中の特定のタンパク質を標的とすることです。まず、組織の単離、固定、およびパラフィン包埋を行い、続いて組織の切片作成とスライドへの貼付を行います。次のステップでは、パラフィン包埋された組織切片の脱パラフィンおよび親水化を行い、その後、内因性ペルオキシダーゼをブロッキングします。次に、抗原賦活化によってエピトープを露出させます。続いて、抗体を導入する前に、非特異的結合を減少させるためのブロッキングを行います。最終ステップとして、一次抗体および二次抗体を用いた免疫標識によって特定のエピトープを検出し、標識された二次抗体からの信号を発色させます。最終的に、光学的顕微鏡を用いてシグナルを可視化し、組織切片におけるタンパク質の局在パターンを示します。この手法は、ラットの中枢神経系および末梢リンパ節におけるタンパク質の局在と発現パターンの知見を得るのに有用ですが、他の臓器や種にも適用可能です。なお、手順のデモンストレーションは技術者が行います。演者は、カロリンスカ研究所の微生物学・腫瘍学・細胞生物学センターのコアファシリティに所属するKatalin Benedekです。組織調製の開始として、摘出した脳、脊髄、および末梢リンパ節組織を4%パラホルムアルデヒドに浸し、4 °Cで24時間置きます。組織の固定後、組織をPBSに移し、次の処理まで4 °Cで保存します。組織の処理を開始するために、カミソリを使用して組織を約5mmサイズの断片に切断します。次に、真空浸透処理装置を用いて組織の硬化処理を行います。標準的な手順では、段階的に濃度を上げたエタノールに浸漬し、続いてキシロル、最後にパラフィンに浸漬させます。次に、組織をモールドに入れます。サンプルの周囲に液体パラフィンを注いでパラフィンブロックを作成し、室温で保存します。組織を薄切する前に、コールドプレートまたは冷蔵庫でパラフィンブロックを一晩冷却してください。パラフィンブロックを冷却した後、ナイフに対して前後方向に移動可能なスレッジミクロトームの固定ホルダーにブロックをセットします。次に、ナイフの形状、切断速度、および切断技術に応じて、ブロックとミクロトームナイフを最適な角度に調整します。パラフィンブロックから厚さ 5 µm の横断切片を3枚作成します。次に、切り出した切片を水容器に移し、水の中から市販のプレコート接着ガラススライドに切片を載せます。続いて、載せた切片をペーパータオルで慎重に押し、残留した水や気泡を取り除きます。載せたスライドを50から60 °Cに設定したオーブンで2時間ほど乾燥させます。スライドが乾燥したら、キシロルに2回、それぞれ15〜20分間浸します。次に、各スライドを99%エタノールで洗浄します。内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするため、0.25%過酸化水素を含むメタノール溶液中で切片を30分間インキュベートします。次に、水含有量を増やしたエタノール溶液で洗浄し、組織切片の親水化を続けます。最終的な親水化ステップは蒸留水で行ってください。カバーガラスを封入するまで、切片が乾燥しないように注意してください。抗原を回収するために、家庭用スチーマーを用い、pH 8.5のEDTAバッファーでスライドを60分間加熱します。その後、室温で約1時間かけてスライドを冷却します。スライドが冷めたら、各スライドをTris緩衝生理食塩水（T-B-S）で3〜5回すすぎます。次に、非特異的な背景反応を阻止するため、10%胎牛血清と90%洗浄緩衝液を含むブロッキング液中で、組織切片を室温で30分間インキュベートします。組織切片のブロッキング後、必要量の一次抗体をブロッキング液で希釈し、この一次抗体溶液中でスライドを4°Cで一晩インキュベートします。翌日、スライドをT-B-S緩衝液で3〜5回すすぎます。次に、ブロッキング液で希釈した二次抗体とともに、室温で1時間スライドをインキュベートします。その後、再びT-B-S緩衝液でスライドを3〜5回洗浄します。続いて、ブロッキング液で1:100に希釈したアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼ複合体とともに、室温で1時間スライドをインキュベートします。1時間のインキュベーションが完了したら、スライドをT-B-S緩衝液で3〜5回すすぎます。テキストプロトコルに従ってファストブルー溶液を調製した後、ディッシュを軽く振り、得られた混合液をろ過します。この溶液をガラスキュベットに入ったスライドに注ぎます。37°Cでインキュベーションを開始し、15〜30分ごとに光学顕微鏡で発色過程を観察します。インキュベーションが完了したら、スライドをT-B-Sバッファーで3〜5回洗浄し、その後、スライドをP-B-Sバッファーに移します。D-A-B過酸化水素発色液を調製するには、まず1 mLのD-A-Bストック溶液を49 mLのP-B-Sで希釈します。過酸化水素を16.5 µL加え、溶液をろ過します。溶液をスライドに注ぎ、特異的なシグナルを遮る高背景（バックグラウンド）を避けるため、光学顕微鏡下で発色過程を制御してください。その後、スライドをPBSで3〜5回すすぎ、最後に蒸留水または水道水で洗浄します。水性封入剤を用い、水から直接カバーガラスを被せてスライドを封入します。カバーガラスとスライドの間に気泡が入らないように注意してください。切片の封入後、封入剤を完全に乾燥させるため、スライドを4 °Cで一晩インキュベートします。乾燥させたスライドは室温で保存してください。免疫後7日目にラットから採取した末梢リンパ節組織切片の二重染色の結果、CD8陽性Tリンパ球はケモカインCCL11を分泌していないことが明らかになりました。一方で、CCL11は活性化マクロファージにおけるリソソームタンパク質のマーカーであるED1と共局在していることが分かりました。ラット脊髄のIHC二重染色により、CCL11が神経細胞体、樹状突起、および軸索で産生されていることが特定されましたが、IBA1陽性マクロファージおよび脳 resident microglia細胞では認められませんでした。さらに、ED1陽性マクロファージおよび脳 resident microglia細胞の大部分も、CCL11陽性ではないことが判明しました。このビデオを視聴することで、組織切片中のタンパク質を標的とした、特異的かつ信頼性の高い免疫組織化学的染色の手法について十分に理解できるはずです。

immunohistochemical-analysis-rat-central-nervous-system-peripheral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオは、マウス脳切片のMeynert領域の基底核におけるコリン作動性線維の免疫組織化学的染色を示しています。切片をブロックし、一次対コリンアセチルトランスフェラーゼで処理し、続いてビオチン化二次抗体で治療します。アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体が添加され、これが二次抗体に結合し、続いて発色基質が添加されます。その後、切片を脱水してマウントし、顕微鏡で視覚化します。...

マウス脳のMeyner基底核における神経線維の免疫組織化学的染色

出典:Evilsizor, M. N., et al., Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons.J. Vis.

ミクログリアおよびニューロンのためのラット冠状組織凍結切片の免疫組織化学的染色

この入門レベルのプロトコルは、ミクログリアとニューロン要素のマーカーを例に、げっ歯類の脳の免疫組織化学的染色を完了するために必要な試薬、機器、および技術を説明しています。...

ミクログリアとニューロンのための例染色：凍結切片ラット脳組織の免疫組織化学のためのプライマー

ここでは、接着性腫瘍細胞をリンパ節(LN)凍結片に定量化できる簡単で安価な方法について説明する。LN付着性腫瘍細胞は、光顕微鏡によって容易に同定され、蛍光ベースの方法で確認され、LNパレンチマに対する腫瘍細胞結合親和性を明らかにする接着指数を与える。...

リンパ節凍結部における腫瘍細胞接着の定量

主要な骨盤神経節には、骨盤器官を内面的に活性化する副交感神経および交感神経が含まれている。ここでは解剖方法を説明し、これらの神経節および関連する神経の同定のための回路図を提供する。これらの方法は、これらの神経節のインビボでの実験的操作またはさらなる研究のための除去事後分析に適用することができる。...

男性および女性ラットにおける骨神経神経と関連神経の解剖

本稿は、マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発するプロトコルを提示する。中枢神経系(CNS)における浸潤リンパ球の単離および特徴付けの方法も提示され、リンパ球がCNS自己免疫疾患の発症にどのように関与しているかを示す。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系におけるリンパ球浸潤のフロー細胞量分析

この論文では、脳、脊髄、髄膜など、中枢神経系内の常在免疫細胞および末梢由来の免疫細胞を調べるための2つの最適化されたプロトコルを紹介します。これらの各プロトコルは、定常状態および炎症状態下でこれらのコンパートメントを占める細胞の機能と組成を確認するのに役立ちます。...

免疫細胞の下流分析のための中枢神経系組織および関連する髄膜の単離

ここでは、経胸管リンパ球を採取し、ラット・ペイアーのパッチ中の腸管リンパ球の移動をタイムラプス写真を用いて3時間観察するための正確な方法について述べた。この技術は、炎症性条件下でリンパ球の動態がどのように影響を受けるかを明らかにすることができる。...

ラット・ペイアーのパッチにおけるリンパ球ダイナミクスの顕微鏡観察

フリーフローティング技術により、研究者は固定組織切片で免疫組織化学を含む組織学的ベースの染色を行い、生物学的構造、細胞タイプ、タンパク質の発現と局在を視覚化できます。これは効率的で信頼性の高い組織化学的手法であり、脳、心臓、肝臓などの多数の組織の調査に役立ちます。...

自由浮遊組織切片を用いた組織学的染色

マウス中枢神経系の組織学的分析のための便利な重力供給灌流法が提示される。リン酸化α-シヌクレインの免疫蛍光検出は、パーキンソン病のマウスモデルにおいて実証されている。この研究はまた、経心経灌流、解剖、組織凍結/埋め込み、および凍結切片化ステップを包括的に記述している。...

マウス中枢神経系の組織学的解析のための重力供給経心筋灌流法

このプロトコルはアレルギー性鼻炎のラットモデルを評価するための多色免疫蛍光法の技術を記述する。...

多色免疫測定法 による アレルギー性鼻炎ラットの鼻粘膜組織切片における免疫蛍光標識

学ぼう、ラットの中枢神経系および末梢リンパ節の組織切片における二重免疫組織化学染色法。パラホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋、アンチゲンリトリーバルを含む詳細なプロトコルにより、タンパク質の局在パターンを可視化します。

ラット中枢神経系および末梢リンパ節の組織切片での免疫組織化学的解析

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