ラット中枢神経系および末梢リンパ節の組織切片での免疫組織化学的解析

この手順の全体的な目標は、ラット組織内の特定のタンパク質を標的とすることです。これは、最初に組織を単離、固定、およびパラフィン包埋することにより達成され、次に組織の切片化およびスライドへのマウントが続きます。2番目のステップは、パラフィン包埋組織切片を脱パラフィンして再水和し、次に内因性ペルオキシダーゼをブロックすることです。

次に、抗原賦活化によってエピトープが明らかになります。その後、抗体を導入する前に、非特異的結合を減らすためにブロッキングを行います。最後のステップは、一次抗体と二次抗体による免疫標識によって特異的エピトープを検出し、標識された二次抗体からシグナルを発現させることです。

最終的に、シグナルは光学顕微鏡を使用して視覚化され、組織切片のタンパク質局在パターンが示されます。この方法は、ラットの中枢神経系および末梢リンパ節におけるタンパク質の局在と発現パターンに関する洞察を提供するだけでなく、他の臓器や種にも適用できます。手順を実演するために技術者になります。

彼女の名前はカタリン・ベネデクで、カロリンスカ研究所の微生物学腫瘍および細胞生物学センターの中核施設から来ました。組織調製を開始するには、解剖した脳、脊髄、および末梢リンパ節組織を4%パラホルムアルデヒドに浸し、摂氏4度に24時間置きます。組織が固定された後、組織をPBSに移し、さらに処理されるまで摂氏4度で保管します。

組織の処理を開始するには、かみそりの刃を使用して組織を約5ミリメートルのサイズに切断します。次に、真空浸潤プロセッサーで組織硬化プロセスを開始します。標準的な手順は、上昇する濃度のエタノールに浸漬し、次にキシロール、最後にパラフィンに浸すことに基づいています。

次に、ティッシュを型に入れます。サンプルの周囲に液体パラフィンを流し込んでパラフィンブロックを形成し、室温で保存します。組織を切片化する前に、パラフィンブロックをコールドプレートまたは冷蔵庫で一晩冷却します。

パラフィンブロックが冷却された後、ナイフを横切って前後に移動できるそりミクロトームの固定ホルダーにブロックを置きます。次に、ブロックとミクロトームナイフを、ナイフの形状と切断速度と技術に応じて最適な角度に調整します。パラフィンブロックから厚さ5ミクロンの断面を3つ切り取ります。

次に、切断した部分を水容器に移し、水から部分を市販のプレコート接着スライドガラスに取り付けます。次に、取り付けられた部分をペーパータオルに慎重に押し付けて、残留水と潜在的な気泡を取り除きます。取り付けられたスライドを摂氏50〜60度に設定されたストーブで数時間乾かします。

スライドが乾いたら、スライドをキシロールに2回、それぞれ15〜20分間浸します。次に、各スライドを99%のエタノールですすいでください。内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするには、0.25%の過酸化水素を含むメタノール溶液で切片を30分間インキュベー

次に、水分含有量の増加を含むエタノール溶液ですすいで、組織切片の再水和を続けます。蒸留水で最後の再水和ステップを実行します。カバースリップが取り付けられるまで、セクションを湿らせてください。

抗原を回収するには、家庭用スチーマーとEDTAバッファーでスライドをpH 8.5で60分間加熱します。その後、スライドを室温で約1時間冷却します。スライドが冷めたら、トリスバッファー生理食塩水(TBS)で各スライドを3〜5回すすぎます。

次に、10%のウシ胎児血清と90%の洗浄バッファーを含むブロッキング溶液で、組織切片を室温で30分間インキュベートし、非特異的なバックグラウンド反応をブロックします。組織切片をブロックした後、ブロッキング溶液中の一次抗体を必要量希釈し、この一次抗体溶液中のスライドを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、スライドをT-B-Sバッファーで3〜5回すすぎます。

次に、ブロッキング溶液で希釈した二次抗体とスライドを室温で1時間インキュベートします。その後、再度スライドをT-B-Sバッファーで3〜5回すすぎます。次に、スライドをアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体とインキュベートし、ブロッキング溶液で1〜100に希釈し、室温で1時間インキュベー

1時間のインキュベーションが完了したら、スライドをT-B-Sバッファーで3〜5回すすぎます。テキストプロトコルに記載されているようにファストブルー溶液を調製した後、皿を軽く振って得られた混合物をろ過します。ガラスキュベットのスライドに溶液を注ぎます。

摂氏37度でインキュベーションを開始し、15〜30分ごとに光学顕微鏡で発育過程を観察します。インキュベーションが完了したら、スライドをT-B-Sバッファーで3〜5回すすぎ、続いてスライドをP-B-Sバッファーに移します。D-A-B過酸化水素現像液を作るには、まずD-A-Bストック溶液1ミリリットルを49ミリリットルのP-B-Sに希釈します。

16.5マイクロリットルの過酸化水素を加え、次に溶液をろ過します。溶液をスライドに注ぎ、特定のシグナルを隠す可能性のある高いバックグラウンドを避けるために、光学顕微鏡下で現像プロセスを制御してください。次に、スライドをPBSで3〜5回すすぎ、最後に蒸留水または水道水で洗います。

水封入剤を使用して、カバースリップを水から直接スライドに取り付けます。カバースリップとスライドの間に気泡を作らないようにしてください。切片を埋込した後、スライドを摂氏4度で一晩インキュベートし、埋込培地を完全に乾燥させます。

乾燥させたスライドは室温で保存してください。免疫後7日目にラットから単離された末梢リンパ節組織切片を二重染色したところ、cd8陽性tリンパ球はケモカインC-C-L11を分泌しないことが明らかになった。あるいは、C-C-L 11は、活性化マクロファージのリソソームタンパク質のマーカーであるE-D 11と共局在することがわかりました。

ラットの脊髄のI-H-C二重染色では、ニューロンのペリカリア、樹状突起、および軸索におけるC-C-Lの11の産生が同定されましたが、I-B-A陽性マクロファージおよび脳に常在するミクログリア細胞では同定されませんでした。また、E-D-1陽性マクロファージおよび脳内ミクログリア細胞の大部分もC-C-L11陽性ではないことがわかった。このビデオを見た後、組織切片で直接タンパク質の特異的で信頼性の高い免疫組織化学的ターゲティングを行う方法を十分に理解しているはずです。