ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

この手順の全体的な目的は、フィーダーフリー条件下で培養されたヒトiPS細胞からヒト心筋細胞を分化させることです。まず、iPS細胞を超低接着プレートに播種して胚様体を形成させます。次に、形成された胚様体をゼラチンコートしたディッシュに移します。

拍動領域が現れたら、実体顕微鏡下で手動で切り出し、フィブロネクチンでコーティングしたディッシュに播種します。さらに分化を進めるための最終ステップとして、拍動クラスターを酵素消化し、単一の心筋細胞を得ます。最終的に、免疫蛍光顕微鏡観察により、心筋トロポニンなどの典型的な構造マーカーを発現する心筋様細胞への分化を確認できます。

この手法は、ヒト心筋細胞レベルでの心臓発生や疾患における心分化および機能不全を駆動するメカニズムは何かという、心血管生物学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本手法は、ヒトの患者や個人からin vitroで心筋細胞を生成できるため、非常に有用な技術です。さらに、試験管内で疾患を再現できるため、in vivoでの試験に進む前に、in vitroで新しい薬剤の検討を行うことが可能になります。

実験は、35 mmのMatrigelコートプレートで培養したコンフルエントなiPS細胞培養物を用いて開始します。増殖培地を、1 mgのdissを含む1 mLのPBSに交換します。ポリガラスピペットを用いて細胞を確認します。

コロニーの中心にあるクレーター状または嚢胞状の構造などの、分化した細胞が存在する領域を除去します。また、細胞が分離し、扁平化して外側へ遊走しているように見える領域もすべて除去します。その後、コロニーの辺縁部が明るくなり、剥離し始めるまで、残った細胞を培養フード内で37 °Cでインキュベートします。

通常、これには5分から7分かかります。この時点でdispa溶液を除去し、1 mLのHESMで細胞を洗浄します。その後、洗浄液を廃棄してください。

新鮮なHESM 1 mLを用いて、セルリフターでコロニーを回収します。回収したコロニーを15 mLチューブに移します。次に、さらに1 mLのHESMで細胞を洗浄し、1000 ×gで4分間遠心分離して沈殿させます。

次に、細胞をマトリゲル上に播種し、培養期間中は毎日培地を交換します。まず、前節に記載した方法で未分化iPSコロニーを回収します。未分化集団を単離した後、1 mLのEBM 20に緩やかに再懸濁します。

2 mLピペットを使用し、細胞塊を壊しすぎないように注意してください。ピペッティングは2〜3回に留めます。ピペッティングの合間に、実体顕微鏡でコロニーのサイズを確認してください。

コロニーがすべてほぼ同じ大きさになったら、それ以上の混合は不要です。次に、回収した細胞1プレートにつき6ウェルプレート1枚を使用し、超低接着プレートに細胞を播種します。チューブを1 mLのEBM 20で洗浄し、その洗浄液をプレートに分注することを忘れないでください。

培養3日後、胚体が除去されないよう顕微鏡を用いて培地を交換します。ピペットはプレートの端に近づけて保持してください。7日目に、37 °Cで30分間温めた0.1% Gelatinでコーティングしたプレートに胚体を移動させます。

2 mLの培地が入った各35 mmディッシュに、胚体を35〜40個ずつ加えます。培養中は、定期的に週2回培地を交換してください。

胚体を確認して拍動部位を探し、拍動部位がどこにあるかをマークします。ディッシュカバーの上部では、約10日から20日後に拍動・収縮部位が現れるはずです。自発的な収縮が見られる部位が現れたら、培地をEBM twoに交換します。収縮部位の出現後も、プレート上の他の部位を最大1か月まで培養し、モニタリングを続けてください。

合計で。EBMにおいて、分化プロセスの不備はいくつかの要因に強く依存しており、その中で最も重要なのは、心筋分化を誘導するために使用される特定の細胞株と血清のバッチです。最高の効率を得るには、心筋分化能について複数の細胞株とさまざまなバッチの血清をテストしてください。まず、12ウェルプレートのコーティングから開始します。

PBSに溶解した5 µg/cm²のフィブロネクチンを1ウェルあたり300 µLずつ分注し、各ウェルの表面を完全に覆ってください。プレートをカバーせずに、細胞培養フード内で乾燥させます。細胞培養のビーズ領域を除去するには、引き伸ばしガラスピペットとメスを使用してください。

次に、1 mLピペットを用いて、フィブロネクチンコートプレートの各ウェルに4〜5個のクランプを移します。すべての回収が完了したら、回収プレートの細胞をロードしたウェルに1 mLのEBM 2を加え、細胞を除去した箇所に印を付けます。その後、培地を交換し、プレートを培養フードに戻します。

実体顕微鏡下でより小さな拍動細胞塊が必要な場合は、摘出部位をピペットで吸引・吐出してください。これにより、少数の拍動細胞を含む小さなクラスターが形成されます。培養下で。

解析の準備が整うまで、週に2回培地を交換してください。まず、表面を覆うのに十分な量のPBSで希釈した20 µgのフィブロネクチンでコーティングし、4 cm四方の2チャンバースライドを4枚準備します。ガラスサポートを使用する場合は、さらに20 µgのラミニンを加えてください。

既述の手順に従ってビーズ培養領域を分離します。1 mL ピペットを用いて、細胞を 500 µL のコラゲナーゼを含む 15 mL チューブに移します。細胞を 15 分間インキュベートし、インキュベーション中に一度チューブを振盪します。

15分後、凝集塊が残っている場合は、200 µL ピペットを用いて細胞を移動させ、凝集塊を除去します。大きな凝集塊がなくなったことを確認し、細胞を新しいコラゲナーゼ2に転移させ、インキュベーションを繰り返します。調製済みのアスコルビン酸を含まない EBM2 を 3 mL 加えて、消化を終了します。

チューブをフード内の加熱ラックで保存し、室温で1000 ×gにて4分間遠心分離します。遠心分離後、同一の初期サンプルから得られた細胞画分を1 mLの0.25% trypsin EDTA in PBSで懸濁します。その後、懸濁液を加熱ブロックで5分間インキュベートし、ascorbic acidを含まない4 mLのEBM-2でtrypsinを不活化します。

次に、顕微鏡下で大きな凝集塊が見えなくなるまで、2.5 milliliter シリンジに取り付けた18ゲージの針を用いて細胞を最大7回パスします。その後、細胞を1000 times Gで4分間遠心分離します。続いて、細胞ペレットをE BM twoに再懸濁し、2ウェルチャンバースライドに播種します。

細胞は2〜3日間の培養後に解析可能な状態になります。CMSは、いくつかのiPS細胞株から作製されました。これらの細胞株は、当初はmethフィーダー層上で作製され、その後、定義培地を用いて直ちにMatrigel上に播種されました。

細胞は、位相差顕微鏡下で明るいエッジと明瞭な核を持つ、ヒトESC様形態を示しました。免疫蛍光分析により、iPS細胞が転写因子T-fourを正しく発現し、表面抗原TRA-1-60を発現していることが示されました。サイトフローメトリー分析により、代表的な多能性表面抗原であるSSEA-4およびTRA-1-60の発現が確認されました。

ゲーティング戦略を左の散布図に示します。また、マトリックスゲル上で培養したIP FS細胞の核型分析も行いました。心筋系への誘導は、IPS細胞をEB（胚様体）へと凝集させ、特定の種類の血清存在下で培養することで開始しました。

また、ソルビン酸による収縮領域は、使用した細胞株によって異なりますが、全培養面積の20%から35%を占めていました。これらの領域から酵素消化によって収縮するCMSを単離し、タンパク質発現を解析しました。RT-PCRの結果、iPS細胞由来の拍動細胞では心臓特異的なイオンチャネルの発現が認められましたが、非拍動細胞では認められませんでした。

これらのチャネルには、電位依存性カルシウムチャネルのサブユニットであるα1、5型電位依存性ナトリウムチャネルのαサブユニット、KQT様サブファミリーのカリウム電位依存性チャネル、および2つの形態のミオシンが含まれていました。重鎖免疫蛍光分析により、単一のiPS細胞由来心筋細胞が、構造タンパク質であるαサルコメアアクチン、心筋トロポニンI、および心筋特異的接合タンパク質であるコネクシン43を発現していることが明らかになりました。結局のところ、この技術は体外での心筋疾患モデリングへの道を切り開き、人体に薬剤を投与することなく、ヒトの環境下で薬物実験を行うことを可能にしました。

このビデオを視聴することで、無血清条件下でのiPS細胞の維持方法、および胚体形成法を用いた心筋細胞への分化誘導方法について十分に理解することができます。