ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

この手順の全体的な目標は、フィーダーフリー条件で培養されたヒトIPS細胞からヒト心筋細胞を区別することです。これは、まずIPS細胞を超低接着プレートに播種して胚体を形成することによって達成されます。手順の2番目のステップは、形成された胚体をゼラチンでコーティングされた皿に移すことです。

収縮領域が現れたら、実体顕微鏡で手作業で解剖し、フィブロネクチンコーティングされた皿にメッキします。さらなる分化のための最後のステップは、収縮するクラスターの酵素消化によって単一の心筋細胞を得ることです。最終的に、結果は、免疫蛍光顕微鏡法を通じて、典型的な構造マーカーであるIE 心筋トロポニンを発現する細胞様心筋細胞の分化を示すことができます。

この方法は、心臓の発達やヒト心筋細胞のレベルでの疾患における心臓の分化や機能障害を引き起こすメカニズムは何かなど、心血管生物学分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。これは、ヒトの患者やヒトの個体からin vitroで心筋細胞を作製することができるため、非常に興味深い技術です。そして2番目の例では、試験管内で病気を再現できるため、新薬をin vitroで実験してからin vivoで実験することができます。

実験 35mmマトリゲルコーティングプレート上で増殖させたコンフルエントIPS細胞培養から開始します。成長培地を、1ミリグラムのディスを含む1ミリリットルのPBSと交換します。ポーリングガラスピペットを使用して細胞を検査します。

コロニーの中心にあるクレーター様構造や嚢胞性構造など、分化した細胞を持つ領域を取り除きます。また、セルが分離し、平らになり、外側に移動しているように見える領域も削除します。次に、残りの細胞を培養フードの下で摂氏37度でインキュベートし、コロニーの境界が明るくなり、分離し始めるまでインキュベー

これには通常5分から7分かかります。この時点で、ジスパ溶液を取り出し、1ミリリットルのHESMで細胞を洗浄します。その後、洗浄液を廃棄します。

新鮮なミリリットルのHESMで、セルリフターを使用してコロニーを収穫します。コロニーを15ミリリットルのチューブに集めます。次に、細胞をさらにミリリットルのHESMですすぎ、Gの1000倍で4分間スピンダウンします。

その後、細胞をマトリゲルに播種し、培養中に毎日培地を交換します。まず、前のセクションで説明したように、未分化のIPSコロニーを採取します。未分化集団が分離されたら、それらを1ミリリットルのEBM 20に穏やかに懸濁します。

2ミリリットルのピペットを使用して、細胞の塊をあまり壊さないでください。ピペッティングは2回または3回のストロークに制限してください。ストローク間のステレオスコープの下のコロニーのサイズを確認します。

コロニーがすべてほぼ同じサイズの場合、さらに混合する必要はありません。次に、超低接着プレート上に細胞をプレートし、採取した細胞のプレートごとに1つの6ウェルプレートを充填します。1ミリリットルのEBM 20でチューブをすすぎ、すすぎをプレートに分配することを忘れないでください。

インキュベーションの3日目以降、胚体の除去を避けるために顕微鏡を使用して培地を交換します。ピペットをプレートの端に近づけてください。7日目に、胚体を0.1%ゼラチンでコーティングしたプレートに移し、摂氏37度で30分間温めます。

2ミリリットルの培地で各35ミリメートル皿に35〜40個の胚体を追加します。培養中。週に2回定期的に媒体を交換してください。

胚体に拍動領域がないか確認し、ビーズ領域がどこにあるかをマークします。皿の上部に、約10〜20日後にビーズの収縮領域が現れるはずです。自発的な収縮が現れた領域が現れたら、その媒体をEBMに切り替えます 収縮領域が現れたら、プレート上の他の領域を最大1か月間培養および監視し続けます。

全部で。EBMでは、分化プロセスの2つの欠損はいくつかの要因に大きく依存しており、その中で最も重要なのは、心臓の分化を誘導するために使用される特定の細胞株と血清のバッチです。最高の効率を得るためには、心原性の可能性のためのいくつかのラインと血清の様々なバッチをテストします コーティング12から始まります。

PBS中に1平方センチメートルあたり5マイクログラムのフィブロネクチンを含むウェルプレート、ウェルあたり300マイクロリットルは、各ウェルの表面を完全に覆う必要があります。プレートを細胞培養フードで覆わずに乾かします。細胞培養物のビーズ領域を除去するには、プルドガラスピペットとメスを使用します。

次に、1ミリリットルのピペットを使用して、フィブロネクチンコーティングプレートの各ウェルに4〜5個のクランプを移します。すべてのコレクションが作成されたら、細胞が除去された領域をマークするコレクションプレート上のロードされたウェルにEBM 2の1ミリリットルを追加します。次に、培地を交換し、プレートを培養フードに戻します。

実体顕微鏡で小さな鼓動塊が必要な場合は、摘出した領域をピペットに通します。これにより、いくつかの拍動細胞を含む小さなクラスターが生成されます。文化で。

分析の準備が整うまで、週に2回媒体を交換します。まず、4cm四方の2チャンバースライドを、表面を覆うのに十分なPBSで希釈した20マイクログラムのフィブロネクチンでコーティングして準備します。ガラスサポートを使用する場合は、さらに20マイクログラムのラミニンを追加します。

前述のように、ビーズ培養領域を分離します。1ミリリットルのピペットを使用して、500マイクロリットルのコラゲナーゼチューブが入った15ミリリットルのチューブに細胞を移します。細胞を15分間インキュベートし、インキュベーション中にチューブを1回振ってください。

15分後、200マイクロリットルのピペットで細胞を動かし、塊が残っている場合は塊を取り除きます。細胞を新鮮なコラゲナーゼ2に移し、大きな塊が残らなくなったらインキュベーションを繰り返します。3ミリリットルのEBMを2つ追加して消化を終了しますが、それぞれが調製されているほどのソウ酸はありません。

チューブをボンネットの下の加熱ラックに保管し、Gの1000倍で室温で4分間遠心分離します。遠心分離したら、PBS中の0.25%トリプシンEDTAのミリリットルで同じ初期サンプルから細胞画分の懸濁液を作成します。次に、懸濁液を加熱したブロック内で5分間インキュベートし、ソイ酸として4ミリリットルのE BM 2でトリプシンを不活性化します。

次に、顕微鏡下で大きな塊が見えなくなるまで、2.5ミリリットルの注射器で18ゲージの針に細胞を最大7回通過させます。次に、細胞をGの1000倍で4分間遠心分離します。次に、細胞ペレットをE BM 2に再懸濁し、2つのウェルチャンバースライドにプレートします。

細胞は、インキュベーションの2〜3日後に分析の準備が整います。CMSは、いくつかのIPS細胞株から作製しました。これらのラインは、最初にメスフィーダー層で生成され、すぐに定義された培地を使用してマトリゲル上に配置されました。

細胞は、相の明るいエッジと顕著な核を持つヒトESCのような形態を示しました。免疫蛍光分析により、IPS細胞は転写因子T 4を正しく発現し、TRA one 60表面抗原を発現することが示されました。Cyto fluoro metric 分析により、典型的な表面多能性抗原である SS EEA four および TRA one 60 の発現が確認されました。

ゲーティング戦略は左の散布図に示されています。マトリックスゲル上で増殖したIP FS細胞の核型解析も行った。心筋系統への誘導は、IPS細胞がebsに凝集することと、特定の種類の血清の存在下での培養によって引き起こされました。

また、ソルビン酸の収縮領域は、使用する細胞株にもよりますが、全培養物の20〜35%を占めていました。収縮型CMSは、酵素消化によってこれらの領域から単離され、タンパク質発現について分析されました。R-T-P-C-Rは、IPS由来の拍動細胞で発現する心臓特異的イオンチャネルの発現を発見しましたが、非拍動細胞では発現しませんでした。

これらのチャネルには、アルファチャネル、電圧依存性カルシウムチャネルのサブユニット、タイプ5電圧依存性ナトリウムチャネルのアルファサブユニット、KQTのカリウム電位依存チャネル(サブファミリー様)、および両方の形態のミオシンが含まれていました。重鎖免疫蛍光分析により、単一のIPS由来心筋細胞が構造タンパク質であるαサルコメア、アクチン、心筋トロポニンI、および心臓特異的接合部であるconexion 43を発現していることが明らかになりました。結局のところ、この技術は、in vitroでの心筋疾患のモデリングへの道を開き、人体に薬物を注射することなく、人間の環境で薬物を実験することを可能にしました。

このビデオを見れば、IPS細胞を遊離状態で維持する方法や、胚体の凝集に基づく方法によってIPS細胞を心筋細胞に分化する方法についてよく理解できるはずです。