Name: ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: 学ぶフィーダーフリー条件下でヒトiPS細胞から心筋細胞を分化させる方法。エンブリオイドボディ形成と酵素処理を用いて機能的心筋細胞を得るプロトコルを解説。心臓病研究や創薬に応用可能です。

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BSは、ミラノ·ビコッカサマー学生研究トレーニングプログラムの大学によってサポートされていました;研究は健康と教育、大学と研究Fondazioneヒューマニタスのイタリア省イタリアの省資金からGCにサポートされていました、我々は批判的に読むためマイケルVG Latronicoに感謝原稿。

1。ヒトiPS細胞株のフィーダーフリーメンテナンスと継<ol><li>マトリゲル被覆された料理を準備します。雪解け一つ一つ時間氷上で人間ESC修飾マトリックスのバイアルと25ミリリットルDMEM-F12培地中で、それを希釈する。氷の上のすべてを維持し、すべてのプレートとチューブが予め冷却されていることを確認しながら、各35ミリプレート（または他の皿が使用される場合、表面積あたりの当量）、1 mlを加える。アルミホイルでプレートをカバーしています。 </li></ol> 注：マトリゲル在庫濃度はバッチによって異なります。希釈命令はデータシートに示されている。 <ol start="2"><li>晩氷の上のプレートを保持し、次の日に氷から削除します。プレートを使用する前に、1週間冷蔵庫にまで保つことができる。 </li><li> mTESR1完全培地（またはNutristem媒体のバイアルを解凍）し、以下の表に従ってH-ESM（人間ESC媒体）を準備します。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> H-ESM </td><td> FINAL CONC </td><td> 500ミリリットルFOR </td></tr><tr><td>ノックアウト血清交換（KSR） </td><td> 20％ </td><td> 100ミリリットル</td></tr><tr><td>グルタ100X </td><td> 2 mMの</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td> MEM非必須アミノ酸</td><td> 0.1mMの</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td> 100 U / mlの - 0.1 mg / mlの</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td> 2 - メルカプトエタノール</td><td> 0.1mMの</td><td> 900μlの</td></tr><tr><td> B27サプリメント - VitaminAなし</td><td> 1％ </td><td> 10ミリリットル</td></tr><tr><td> N2サプリメント</td><td> 1％ </td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>ノックアウトDMEM </td><td> - </td><td> 370ミリリットル</td></tr></tbody></table> ストック媒体は、それ以上の2週間以上、4℃で保存することができる。完全増殖培地を調製し、塩基性FGFだけ血友病追加されます20 ngの/ mlの最終濃度までe給餌。 </li></ol> 注：H-ESM完全にマウス胚線維芽細胞を条件としては、iPS細胞のためmTESR1またはNutristemの代わりに使用することができる。 <ol start="4"><li>継代の前に30分〜2時間37℃でインキュベーター内でコーティングしたプレートを置きます。 </li><li>細胞は、それらがコンフルエンスに達していない場合でも、約5日ごとに継代されるべきである。コロニーは触れてはいけません。 </li><li>ディスパーゼを1m​​l（1 mg / mlの、PBS中10 mg / mlの在庫からディゾルブ）と成長培地を交換してください。 </li><li>引っ張らガラスパスツールピペットで差別化の領域を削除します。除去すべき分野は、クレーター状または嚢胞構造コロニーの中心にあり、細胞がコロニーから分離し、扁平になり、外側に移行しているように思われている任意の領域が含まれます。 </li><li>植民地の境界線が明るくなって、（通常は5-7分程度）デタッチ始めるまで培養フードの下に37℃でインキュベートする。 DiscarDディスパーゼ。 1ミリリットルH-ESMで洗浄し、廃棄します。 </li><li> 1ミリリットルH-ESMでは、収穫のコロニーへのセルリフター（スクレーパーへらのような）を使用し、15ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに集める。 1ミリリットルH-ESMで洗い流し、チューブに加える。 4分間1,000 rcfでスピンし、上清を除去します。 </li><li> 1ミリリットル予め温めておいた増殖培地（どちらmTESR1またはNutristem）でペレットを再懸濁します。あまりにも塊を解体避ける - 上下6-8X未満ピペット。どのように多くの細胞にメッキさ〜1:5で2プレート用など不必要な細胞（通常は午前1時04分または1：05希釈）、削除する必要があります決定し、600μlのを削除し、その後、1.6ミリリットル新鮮培地を追加します。 </li><li>プレートからマトリゲルを削除します。場所細胞は、プレート上に均一に分散、ドロップでドロップします。これは細胞が中心に向かって移動するようになりますように、過度にチューブを振って避ける。 </li><li> 、1mlの培地とプレート間の格差とチューブを洗ってください。各プレートの最終容量は1.5 -2ミリリットルでなければなりません。 </li><li>継代後の日を除く毎日の媒体を変更します。それはあるが、もう2〜3日以上は、多能性または分化の潜在的影響を与えることなく、最後の通路を経過した場合は培地日常を変更することが理想的な、これは時折回二日の頻度で変更されることがあります。 </li><li>細胞株を凍結する必要がある場合は、2 mlのピ​​ペットと場所1ミリリットル/クライオバイアルを使用して1〜2ミリリットルmFreSR凍結培地に代わりに再懸濁する。 -80 cryoboxに置きバイアル℃、3〜4日での液体窒素への転送。 </li></ol> 注：iPS細胞の顕微解剖マニュアルは実体顕微鏡下で行わなければなりません。彼らは加熱された表面領域に保持されながら、実体顕微鏡と統合で体外受精 （IVF）ワークステーション（KSystemからIVFワークステーションなど ）を無菌条件下で細胞の操作を可能にします。これが利用できない場合、実体顕微鏡は、通常、層流フードの下で移動させることができる。 2。胚様体集約および心臓InductioN <ol><li>以下の表に従ってEBM-20培地を準備します。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> EBM-20 </td><td> FINAL CONC </td><td> 500ミリリットルFOR </td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（原産地南米） </td><td> 20％ </td><td> 100ミリリットル</td></tr><tr><td> MEM非必須アミノ酸</td><td> 0.1mMの</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td> 100U/ml - 0.1 mg / mlの</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>グルタ100X </td><td> 0.1mMの</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td> 2 - メルカプトエタノール</td><td> 50umの</td><td> 450μlの</td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> - </td><td> 385ミリリットル</td></tr></tbody></table> 南アメリカ原産のFBSの使用は分化効率を決定するために重要である：血清の他のタイプの雇用が影響を与える可能性があります分化プロセス。 50μgの/ mlの最終濃度まで、EBM-20完全な追加アスコルビン酸（AA）を調製した。完全増殖培地をして一週間以内に使用し4℃で保存することができます。 </li><li>ハーベストのiPS上記のように植民地を（ステップ1.6から1.9）。 </li><li> 2 mlのピ​​ペットで1ミリリットルEBM-20で軽く懸濁します。あまりにも塊を解体避けるん - ピペット上下に2〜3倍以上のものを、実体顕微鏡下でコロニーのサイズをチェック。 1:1の比率で超低取付板（35mmディッシュ用など 、6ウェルプレートのウェル1を使用）上にプレート。 1ミリリットルEBM-20とチューブを洗浄し、プレートに加える。 </li></ol> 注：コロニーのサイズ分化過程に影響を与え、心臓の誘導の効率及びタイミングを制御する。均一の大きさの凝集がEBの分化の間に観察されたばらつきを低減することが示されている。 <ol start="4"><li> 3日目に、EBM-20は一度再避けるために、顕微鏡を使用して変更のEBS moval。プレートの端に近いピペット、そして培地を除去してください。 </li><li> 7日目、0.1％でコーティングされたプレートにスイッチのEBにゼラチン、以前37に配置℃で30分間。必要に応じて、ゼラチンは、細胞培養フード下で除去し、プレートを残すことができるO / N 35mmディッシュあたり35-40 EBSを追加します。 </li><li>週2回の地域と変化EBM-20を打つためにEBSをチェックします。実体顕微鏡下でそれらの局在を促進するために、暴行の領域は皿カバーの上に置かれている場所をマーク。締約エリアは約10〜20日後に表示されるはずです。 </li><li>自発的な収縮に領域は、表示され（代わりに2％FBSで、EBM-20として用意）EBM-2培地を切り替えて、それらを、セクション3に説明分離。とき</li><li>鼓動と鼓動領域は​​さらなる実験のために必要とされるまで、週二回の媒体を変更するための他のエリアをチェックし続けています。 </li></ol> 注：分化プロセスの効率に大きく依存しているいくつかの要因が、その中で最も重要な特定の細胞系および心臓の分化を誘導するために使用する血清のバッチである。血清心筋電位およびさまざまなバッチの最高効率は、試験細胞株を得ることができる。 3。エリアの分離と文化を破っ<ol><li>コート12ウェルプレート（4 cm 2の面積）または5μgの/ cm 2のフィブロネクチンを有する近隣のプレート（12ウェルプレートで、ウェル当たり300μlの合計）が完全に表面全体を覆うに十分な量を作るためにPBSで希釈した。細胞培養フード内で発見保ち、乾燥させます。プレートを4℃で包んで保存することができます°CO / N. </li><li>必要に応じて、パスツールピペットやメスを引っ張られたガラスを使用して面積を破って外します。 、1mlのピペットでフィブロネクチン被覆プレートに移す。 </li><li> 1ミリリットルEBM-2を追加します。 </li><li>細胞が除去された領域を示し、メディアを変更するためにプレートをオフに渡ります。他の地域は、Bを起動することがありますようにプレートを、1ヶ月用に保持することができる後で食べる。 </li></ol> 注 ：小さい鼓動塊が必要な場合は、実体顕微鏡下で上下に数回植面積ピペット、それは小さい部分に壊れるまで。これは、（映画の3を参照）、いくつかの拍動細胞のクラスターになります。 <ol start="5"><li>分析のための準備ができるまで週二回培地を変更します。 </li></ol>注：このプロトコルから得られた心筋細胞は、胎児のような形態学的および機能的特性を有し、成人の様表現型に向かって成熟さらに、これらの細胞を区別するために、培養時間を増加させることによって得ることができる。 4。シングル打つセルの単離と解析<ol><li>コート2チャンバースライド（4 cm 2の面積）または全体の培養表面を被覆するのに十分なPBSで希釈した5μgの/ cm 2のフィブロネクチンを有する他の適切な担体。ガラス支持体が使用される場合、ラミニンおよびフィブロネクチンでコート（5μgの個/ cm &lt;&gt;各2）（商標）。 </li><li>セクション3からのプレートからパスツールピペット/メスでエリアを破って外します。 </li><li> 500μlのコラゲナーゼII（MgおよびCaを含むPBSで480 U / ml）を含む15ミリリットルチューブに1ミリリットルピペット、転送細胞を用い、37℃で15分°C、インキュベーション中に一度チューブを振ってインキュベートする。 </li><li> 200μlのピペットで上下にピペッティング。任意の塊が残っている場合は、新鮮なコラゲナーゼIIに転送し、ステップ4.3を繰り返します。 </li><li>に大きな塊が残っていないまで、ステップ4.4を繰り返します。 </li><li> 3ミリリットルEBM-2（無AA）とコラゲナーゼを不活化する。他のチューブは準備が整うまで、チューブを加熱ラックにボンネットの下におくことができます。 4分間1,000 rcfで遠心分離します。 </li><li>ペレットを再懸濁し、1 mlの0.25％を5分間37℃でトリプシン/ EDTA（1X PBS中0.5％のストックから希釈）とインキュベートする。同じ初期サンプルから消化の端数を兼ね備えています。 </li><li> 4ミリリットルEBM-2（無AA）とトリプシンを不活性化。もっとトンなし2.5ミリリットル注射器に18G針を通して細胞を渡す藩7倍。 4分間1,000 rcfで遠心分離します。 </li><li>よく、プレート当たり1ミリリットルEBM-2で再懸細胞ペレット。細胞を2〜3日めっき後の機能的および形態学的分析のために使用することができる。 </li></ol>

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</ol>

開示することなく経済的利益はありません。

多能性幹細胞は、低効率とラインの間で高い変動性を持つとはいえ、CMSに自発的に分化する可能性を秘めている。新規の誘導方法の開発は、したがって、プロセスの効率を向上させ、より定義されたプロトコルに向かって焦点を当てている。しかし、これらの新しい分化方法の最も精巧な培養条件、タイミングおよび試薬の濃度を微調整し、高価なサイトカインと成長因子を用いた治療を必要とし、非常に複雑である。また、様々なiPS細胞株の内因性サイトカイン信号レベルの違いは、それはしばしば困難で各細胞系に適したレベルに調整されなければならないサイトカイン濃度を、標準化するレンダー。 得られたiPS由来CMの成熟はまた、疾患のモデリングと創薬アプリケーションのためのiPS細胞の心筋分化をしようとする際に考慮すべき重要な側面を表しています。 differentiatヒトESCとiPS細胞のイオンは、通常、完全に成熟した構造のない胎児の表現型、すなわちとのCMを生じさせる。単層のアプローチが使用される場合に特に当てはまり、その結果として、これらが増幅して、特定の心臓前駆細胞集団を単離...

歴史的には、人間開発や病気を駆動する遺伝的および分子メカニズムの研究は、遺伝子組み換え動物モデルの生成に基づいている。しかし、多数の人間の表現型が正常に主な理由は2種の間に存在する生物学的な違いにより、マウスで複製することに失敗する。一方、ヒト組織へのアクセスが制限される場合があり、しばしば綿密な実験的研究のために得られる十分な材料を許可しない。心臓血管生物学の分野では、これらの両方の制限に苦しんでいる：人間の心の生理機能は、マウスのそれとは大きく異なっており、心臓組織のかなりの量は、事後のみアクセスや心臓手術中です。機能的なヒトCMの差別化のための最適なソースを見つけることは、したがって心臓血管生物学における中心トピックとなっており、多くの努力が、この問題に対処するためになされた。種々の細胞型は、iが提案されているncluding骨格筋芽細胞、局所心臓幹細胞、骨髄単核細胞、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞。ただし、データは4一貫していない、これらの細胞を用いて得られた。 山中とトムソン6,7によるヒト胚性幹細胞の誘導（ESC）最初の5と人工多能性幹（iPS細胞）の細胞の画期的な発見は、後でソリューションを提供するために見えた：これらの細胞は無限に増殖する能力と与えるために可能性を秘めているCMを含めた3つの胚葉全てのセル誘導体に上昇する。 iPS細胞の使用は、さらなる利点があります自家成体細胞から誘導されるが、それらは、それらが由来する個体または患者と同じゲノムを運ぶ。従って、それらは、ヒトの遺伝疾患および開発メカニズムの検討を容易にするin vitroモデルの開発を可能にする。この特徴のおかげで、iPS細胞はまた、Oすることができ免疫拒絶や倫理的な問題8に関連vercome問題。 ESCは、まだ幹細胞生物学の分野で金本位を表す場合でも、これらの理由により、研究者は世界中の現在のiPS細胞技術に対してより動いている。 iPS細胞は現在、先天性心血管疾患9,10など、さまざまな条件を、in vitroでヒトの疾患モデルに採用されています。最近では、iPS細胞の病気のモデリングの適用は単一遺伝子の心臓疾患のために行われている（ つまり、QT延長症候群、カテコールアミン多形性心室頻拍）と心臓の欠陥が複雑な表現型（ すなわち Leopardとティモシー症候群、拡張型心筋症）の一部であるの病態。これらのレポートは、CMSに分化されている患者固有のiPS細胞は、 生体内での疾患と同様の表現型および機能特性を表示することを確認した。 しかし、心臓系譜へのiPS細胞の誘導の効果を改善するために多くの課題が残っている。胚様体と呼ばれる凝集体形成を介したヒトESCからCMの自発的な世代は（EBS）成功17実証されています。この発見以来、他の多くの方法が提案されている。多くのグループが大幅に分化プロトコルの効率性を高めており、化学的に定義されており、動物製品を含まない培地試薬（ママリーを参照して、C. らに向かって移動している。、すべての既存のメソッド3の包括的な見直しのために循環研究 （2012） ）。 それにもかかわらず、EB集約に基づいて古典的な方法は、まだほとんどの一般的な機能の研究を行い、病気のメカニズムを調査するために使用さを表しています。提案プロトコルは、心臓分化プロセスを増強することが示されている血清およびアスコルビン酸の存在下でのEBにiPS細胞の集約と文化とPOに基づいていますsitivelyこれらの細胞18,19の成熟に影響を与える。この記事では、具体的にこの方法論を通過しますと、患者固有のiPS由来のCMを生成するためのフィーダーフリーのiPS細胞株を使用する方法を示します。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Media and Reagents</strong</td></tr><tr><td>>Human ESC認定マトリックス</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>354277</td><td>5mlボトルを4°Cで解凍します。氷上のC O / N、氷上の予冷クライオチューブに分注し、データシートの希釈手順に従って-20°Cで保存します。C.</td></tr><tr><td>フィブロネクチン、ヒト血漿由来、0.1% 溶液</td><td>Sigma</td><td>F0896-2MG</td><td>使用濃度: 5 &mu;g/cm2</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020-1MG</td><td>使用濃度: 5 &mu;g/cm2</td></tr><tr><td>PBS(MgおよびCaなし)、10X</td><td>Lonza</td><td>BE17-515F</td><td></td></tr><tr><td>PBS(MgおよびCaを含む)、10X</td><td>Bio Sera</td><td>XC-S2067/500</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II、中性プロテアーゼ、グレードII</td><td>ロシュ</td><td>4942078001</td><td>ストック:-20°CでDMEM-F12中の10 mg/mL;C、作業溶液:PBS(Mg/Caなし)</td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA、0.5%</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ2型</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td>に希釈して 480 U/mL (例1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum交換(KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>4°Cで解凍します。C、アリコート、-20°Cで保存。C</td></tr><tr><td>F&#8211;タルウシ血清(原産地:南アメリカ)</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td>バッチは、心原性の可能性について試験する必要があります。4°Cで解凍します。C、56°Cで熱不活性化。C 30 分間、分量して -20 °C で保存します。C</td></tr><tr><td>ペンストレップ、ペニシリン-ストレプトマイシン、100X</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX、100X</td><td>Life Technologies</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA、100X</td><td>Invitrogen</td><td>11140-135</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement、100X</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement、50X</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプト&#8211;タノール</td><td>Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン、豚皮由来</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td>水に1%でストックし、-20°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td>サプリメント5Xを基本培地と組み合わせ、アリコートし、-20°Cで保存します。完全な培地を4°Cに保たないでください。C 1週間以上</td></tr><tr><td>Nutristem hESC XF</td><td>Stemgent from Biological Industries</td><td>05-100-1A</td><td>4°Cで解凍。C O/N、アリコートと-20°Cで保管。使用までC。アリコートは4°Cに保つことができます。Cは1週間以内です。</td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5853</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma</td><td>A4544-25G</td><td>水に10mg/mlのストック液を調製します。アリコートを-20°Cで保管します。暗闇の中でC。最終濃度(500X)<でEBMに添加 colspan</td></tr>="4">Plasticware35 mm 培養皿 ベクトン・ディキンソン 353001 セルスクレーパー コーニング・インコーポレイテッド 3008 12ウェルプレート ベクトン・ディキンソン 353043 パーマノックス 2ウェルチャンバースライド サーモフィッシャーサイエンティフィック 177437 <tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス製 2 ウェル チャンバー スライド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート、超低接着面</td><td>コーニング社</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>18G ニードル</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>ガラス製パスツールピペット、230 mm</td><td>VWR インターナショナル</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>2.5 ml シリンジ</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>300188</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipments</td></tr><tr><td>IVFワークステーション</td><td>KSystem、ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニコンSMZ1500実体顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

心臓の開発を推進したイベントを調査するために、ヒトにおける心筋疾患につながる分子メカニズムを決定するためには、機能的なヒト心筋細胞（CMS）を生成する第不可欠である。薬剤の発見および毒性試験におけるこれらの細胞の使用は、ヒト由来の細胞に対する予備臨床的に検証する心臓障害の治療のための新しい薬理学的分子を可能にする、非常に有益であろう。 CMの発生源のうち、誘導多能性幹（iPS細胞）細胞は、それらが容易にアクセス可能な、患者の組織から直接導出することができるように、最も有望間であり、ボディ1の全ての細胞型を生じさせるための固有の能力を有する。いくつかの方法は、古典的な胚様体（EB）集約アプローチから化学的に定義されたプロトコル2,3に至るまでのCMにiPS細胞を区別するために提案されている。この記事では、EBをベースのプロトコルを提案し、表示する方法このメトキシdは効率的にフィーダーフリーiPS細胞からの機能CM-様細胞を生成するために使用することができる。

我々の研究では、いくつかのiPS細胞株からのCMを生成した。これらのラインは、最初にMEFフィーダー層上で生成されたが、すぐに定義された媒体（またはいずれかmTESR1 Nutristem）を用いて、マトリゲル上に置いた。種々のアッセイは、形態学的特性、多能性細胞の典型的なマーカーの発現（OCT-4、SSEA4およびTRA1-60）、およびそれらのゲノム安定性（ 図1）の維持を確認するために使用した。 心臓系統への誘導は、血清およびAA（ 図2Aおよび2B）、特定の種類の存在下でのEBと文化にiPS細胞の集合体によって引き起こされました。締約領域が（ 図2Cおよびムービー1）を使用した細胞株に応じて、全体の20から35パーセントを占めました。締約酵素消化（ 動画2）することによって、これらの地域から分離されたCMは、典型的な心筋細胞の構造タンパク質（心筋トロポニン、＆ALPHを表明...

多能性幹細胞は、胚又は人工多能性幹細胞（iPS細胞）のいずれかで、心筋細胞を含むヒト分化細胞の貴重な情報源を構成する。ここでは、胚様体ベースのプロトコルを介して機能的なヒト心筋細胞を得るためにそれらを使用する方法を示す、iPS細胞の心筋誘導に焦点を当てます。

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

この手順の全体的な目的は、フィーダーフリー条件下で培養されたヒトiPS細胞からヒト心筋細胞を分化させることです。まず、iPS細胞を超低接着プレートに播種して胚様体を形成させます。次に、形成された胚様体をゼラチンコートしたディッシュに移します。拍動領域が現れたら、実体顕微鏡下で手動で切り出し、フィブロネクチンでコーティングしたディッシュに播種します。さらに分化を進めるための最終ステップとして、拍動クラスターを酵素消化し、単一の心筋細胞を得ます。最終的に、免疫蛍光顕微鏡観察により、心筋トロポニンなどの典型的な構造マーカーを発現する心筋様細胞への分化を確認できます。この手法は、ヒト心筋細胞レベルでの心臓発生や疾患における心分化および機能不全を駆動するメカニズムは何かという、心血管生物学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本手法は、ヒトの患者や個人からin vitroで心筋細胞を生成できるため、非常に有用な技術です。さらに、試験管内で疾患を再現できるため、in vivoでの試験に進む前に、in vitroで新しい薬剤の検討を行うことが可能になります。実験は、35 mmのMatrigelコートプレートで培養したコンフルエントなiPS細胞培養物を用いて開始します。増殖培地を、1 mgのdissを含む1 mLのPBSに交換します。ポリガラスピペットを用いて細胞を確認します。コロニーの中心にあるクレーター状または嚢胞状の構造などの、分化した細胞が存在する領域を除去します。また、細胞が分離し、扁平化して外側へ遊走しているように見える領域もすべて除去します。その後、コロニーの辺縁部が明るくなり、剥離し始めるまで、残った細胞を培養フード内で37 °Cでインキュベートします。通常、これには5分から7分かかります。この時点でdispa溶液を除去し、1 mLのHESMで細胞を洗浄します。その後、洗浄液を廃棄してください。新鮮なHESM 1 mLを用いて、セルリフターでコロニーを回収します。回収したコロニーを15 mLチューブに移します。次に、さらに1 mLのHESMで細胞を洗浄し、1000 ×gで4分間遠心分離して沈殿させます。次に、細胞をマトリゲル上に播種し、培養期間中は毎日培地を交換します。まず、前節に記載した方法で未分化iPSコロニーを回収します。未分化集団を単離した後、1 mLのEBM 20に緩やかに再懸濁します。2 mLピペットを使用し、細胞塊を壊しすぎないように注意してください。ピペッティングは2〜3回に留めます。ピペッティングの合間に、実体顕微鏡でコロニーのサイズを確認してください。コロニーがすべてほぼ同じ大きさになったら、それ以上の混合は不要です。次に、回収した細胞1プレートにつき6ウェルプレート1枚を使用し、超低接着プレートに細胞を播種します。チューブを1 mLのEBM 20で洗浄し、その洗浄液をプレートに分注することを忘れないでください。培養3日後、胚体が除去されないよう顕微鏡を用いて培地を交換します。ピペットはプレートの端に近づけて保持してください。7日目に、37 °Cで30分間温めた0.1% Gelatinでコーティングしたプレートに胚体を移動させます。2 mLの培地が入った各35 mmディッシュに、胚体を35〜40個ずつ加えます。培養中は、定期的に週2回培地を交換してください。胚体を確認して拍動部位を探し、拍動部位がどこにあるかをマークします。ディッシュカバーの上部では、約10日から20日後に拍動・収縮部位が現れるはずです。自発的な収縮が見られる部位が現れたら、培地をEBM twoに交換します。収縮部位の出現後も、プレート上の他の部位を最大1か月まで培養し、モニタリングを続けてください。合計で。EBMにおいて、分化プロセスの不備はいくつかの要因に強く依存しており、その中で最も重要なのは、心筋分化を誘導するために使用される特定の細胞株と血清のバッチです。最高の効率を得るには、心筋分化能について複数の細胞株とさまざまなバッチの血清をテストしてください。まず、12ウェルプレートのコーティングから開始します。PBSに溶解した5 µg/cm²のフィブロネクチンを1ウェルあたり300 µLずつ分注し、各ウェルの表面を完全に覆ってください。プレートをカバーせずに、細胞培養フード内で乾燥させます。細胞培養のビーズ領域を除去するには、引き伸ばしガラスピペットとメスを使用してください。次に、1 mLピペットを用いて、フィブロネクチンコートプレートの各ウェルに4〜5個のクランプを移します。すべての回収が完了したら、回収プレートの細胞をロードしたウェルに1 mLのEBM 2を加え、細胞を除去した箇所に印を付けます。その後、培地を交換し、プレートを培養フードに戻します。実体顕微鏡下でより小さな拍動細胞塊が必要な場合は、摘出部位をピペットで吸引・吐出してください。これにより、少数の拍動細胞を含む小さなクラスターが形成されます。培養下で。解析の準備が整うまで、週に2回培地を交換してください。まず、表面を覆うのに十分な量のPBSで希釈した20 µgのフィブロネクチンでコーティングし、4 cm四方の2チャンバースライドを4枚準備します。ガラスサポートを使用する場合は、さらに20 µgのラミニンを加えてください。既述の手順に従ってビーズ培養領域を分離します。1 mL ピペットを用いて、細胞を 500 µL のコラゲナーゼを含む 15 mL チューブに移します。細胞を 15 分間インキュベートし、インキュベーション中に一度チューブを振盪します。15分後、凝集塊が残っている場合は、200 µL ピペットを用いて細胞を移動させ、凝集塊を除去します。大きな凝集塊がなくなったことを確認し、細胞を新しいコラゲナーゼ2に転移させ、インキュベーションを繰り返します。調製済みのアスコルビン酸を含まない EBM2 を 3 mL 加えて、消化を終了します。チューブをフード内の加熱ラックで保存し、室温で1000 ×gにて4分間遠心分離します。遠心分離後、同一の初期サンプルから得られた細胞画分を1 mLの0.25% trypsin EDTA in PBSで懸濁します。その後、懸濁液を加熱ブロックで5分間インキュベートし、ascorbic acidを含まない4 mLのEBM-2でtrypsinを不活化します。次に、顕微鏡下で大きな凝集塊が見えなくなるまで、2.5 milliliter シリンジに取り付けた18ゲージの針を用いて細胞を最大7回パスします。その後、細胞を1000 times Gで4分間遠心分離します。続いて、細胞ペレットをE BM twoに再懸濁し、2ウェルチャンバースライドに播種します。細胞は2〜3日間の培養後に解析可能な状態になります。CMSは、いくつかのiPS細胞株から作製されました。これらの細胞株は、当初はmethフィーダー層上で作製され、その後、定義培地を用いて直ちにMatrigel上に播種されました。細胞は、位相差顕微鏡下で明るいエッジと明瞭な核を持つ、ヒトESC様形態を示しました。免疫蛍光分析により、iPS細胞が転写因子T-fourを正しく発現し、表面抗原TRA-1-60を発現していることが示されました。サイトフローメトリー分析により、代表的な多能性表面抗原であるSSEA-4およびTRA-1-60の発現が確認されました。ゲーティング戦略を左の散布図に示します。また、マトリックスゲル上で培養したIP FS細胞の核型分析も行いました。心筋系への誘導は、IPS細胞をEB（胚様体）へと凝集させ、特定の種類の血清存在下で培養することで開始しました。また、ソルビン酸による収縮領域は、使用した細胞株によって異なりますが、全培養面積の20%から35%を占めていました。これらの領域から酵素消化によって収縮するCMSを単離し、タンパク質発現を解析しました。RT-PCRの結果、iPS細胞由来の拍動細胞では心臓特異的なイオンチャネルの発現が認められましたが、非拍動細胞では認められませんでした。これらのチャネルには、電位依存性カルシウムチャネルのサブユニットであるα1、5型電位依存性ナトリウムチャネルのαサブユニット、KQT様サブファミリーのカリウム電位依存性チャネル、および2つの形態のミオシンが含まれていました。重鎖免疫蛍光分析により、単一のiPS細胞由来心筋細胞が、構造タンパク質であるαサルコメアアクチン、心筋トロポニンI、および心筋特異的接合タンパク質であるコネクシン43を発現していることが明らかになりました。結局のところ、この技術は体外での心筋疾患モデリングへの道を切り開き、人体に薬剤を投与することなく、ヒトの環境下で薬物実験を行うことを可能にしました。このビデオを視聴することで、無血清条件下でのiPS細胞の維持方法、および胚体形成法を用いた心筋細胞への分化誘導方法について十分に理解することができます。

generation-human-cardiomyocytes-differentiation-protocol-from-feeder

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

私たちは、人間の心臓前駆細胞の大量供給と心血管修復のための機能的な心筋細胞の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接cardioblastsの誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

物品を効率よく選択的に集団の均質性および同一性を評価するための基準マーカーのフローサイトメトリー分析を行っWnt経路を変調することにより、心筋細胞へのヒト多能性幹細胞を分化するための詳細な方法論を記載している。...

フローサイトメトリーによる高効率心筋細胞へのヒト多能性幹細胞の分化と特性

ここでは、低分子調節心分化とグルコース欠乏媒介心筋細胞精製を組み合わせたヒト心筋細胞誘導のための堅牢なプロトコルについて説明し、心血管疾患のモデリングと薬物スクリーニングの目的で精製された心筋細胞の生産を可能にします。...

小分子変調分化とその後のグルコース飢餓を用いたヒト人工多能性幹細胞からの高度に精製された心筋細胞の導出

多能性幹細胞から心筋細胞をin vitroで生成することで、基礎科学と臨床応用のための大量の心臓組織へのアクセスが可能になります。...

BMPアンタゴニストGrem2を使用した多能性幹細胞から心房心筋細胞の分化

ここでは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)のための堅牢で高速かつスケーラブルな心筋細胞分化プロトコルを紹介します。この大規模な方法を使用して得られた心筋細胞は、ヒト心血管疾患のモデリング、ハイスループット薬物スクリーニング、および潜在的に臨床応用において効果的に使用するのに十分な細胞数を提供できます。...

再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

我々は、心筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞およびパッチ媒介性サイトカインの送達と細胞注射を組み合わせることにより、移植細胞の生着を改善する配送方法に、ヒト人工多能性幹細胞を分化するための3つの新規かつより効率的なプロトコルを提示します。...

多能性幹細胞は、心筋の修復のための心臓細胞を派生します

ヒト多能性幹細胞（hPSC-CM）に由来する心筋細胞の電気生理学的特徴付けは、心臓疾患のモデル化および薬物応答の決定に重要である。このプロトコールは、多電極アレイ上のhPSC-CMを分離してプレートし、それらの電場電位を測定し、QTおよびRR間隔を分析するための方法を提供するのに必要な情報を提供する。...

多電極アレイ（MEA）を用いたヒト多能性幹細胞由来心筋細胞（hPSC-CM）の電気生理学的解析

ここでは、機能、契約、心筋細胞のような細胞を生成するために若いヒト間葉系幹細胞源の心臓微分の潜在性を効率的に活用する方法を提案するの in vitro...

体外ヒト間葉系幹細胞の心筋細胞のような細胞への分化

ここで我々 アクチビン A のレンチ ウイルスを介した Id1...

最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞およびひと多能性幹細胞からのような心室心筋細胞の生成

本稿では、マルチウェルMEAプレート上で培養されたヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)ネットワークの開発のためのプロトコルのセットを含み、作用電位測定のために細胞膜を可逆的に電気ポレートする。ハイスループットの記録は、同じセルサイトから何日も繰り返し取得されます。...

再発作用ポテンシャル記録のためのマルチウェルマイクロ電極アレイ上のヒトiPSC由来心筋細胞ネットワーク

ここでは、患者末梢血単核細胞からヒト心筋細胞を強固に生成・拡張するプロトコルを提示する。...

患者末梢血単核細胞からのヒト心筋細胞の発生と拡大

学ぶフィーダーフリー条件下でヒトiPS細胞から心筋細胞を分化させる方法。エンブリオイドボディ形成と酵素処理を用いて機能的心筋細胞を得るプロトコルを解説。心臓病研究や創薬に応用可能です。

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

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