Name: のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイサッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: 学ぶタンパク質の再溶解とリフォールディングのin vivoモニタリング法。Saccharomyces cerevisiaeを用いて蛍光顕微鏡と酵素アッセイでプロテオスタシス網の役割を解析し、タンパク質品質管理のメカニズム理解を深める。

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この作品は、KAM、我々はまた、FFLを提供するためにトロント大学のジョン·グローバーに感謝JLAに微生物ロバートD.ワトキンス大学院生研究フェローシップのアメリカの社会への国立衛生研究所（NIGMS-074696）からの助成金によってサポートされていましたプラスミド-GFPソース。

1。プラスミドFFL-GFPを含む菌株の構築この研究では、 出芽酵母株 BY4741は（MAT、his3Δ1、leu2Δ0、met15Δ0、ura3Δ0）酵母ノックアウトコレクション（オープンバイオシステムズ/サーモサイエンティフィック）からHsp104の欠失株と一緒に使用されました。欠失は、ウェスタンブロット分析のためにHsp104の特異的抗体を用いて確認した。 FFL-GFPは著者への要求に応じてトロント17の大学と得でグラバー実験から得られたプラスミドLEU2ベースのソースから構築、p426MET25-FFL-GFPから発現された。 FFL-GFPプラスミド融合タンパク質の発現は、MET25メチオニン抑制性プロモーターによって制御される。プラスミドをGietz らから適応されたプロトコルを使用して各菌株に形質転換した。ら 、1995： <ol><li> 25ミリリットルOを遠心<html> 2分間4,400 rpmで50ミリリットルコニカルチューブのF対数期細胞は、蒸留H 2 0（のddH 2 O）を500μlで洗浄し、上清を捨てる。 </li><li> TE / LiAc（トリス塩酸の10mM、pH値= 7.5、1 mMのEDTA、0.1 Mの酢酸リチウム）を250μlで再懸濁した細胞。 20分間混合することなく、30℃でインキュベートする。 </li><li>キャリアーDNAとプラスミドDNA5μlの（0.1-5μgの）を5ml（50μgの）と一緒に新しいチューブにコンピテントセル50μlのを転送します。 PEG / TE / LiAc（TE / LiAcプラス40％のポリエチレングリコールと同じ）、この混合物に300μlのを追加し、℃でさらに30分間30℃でインキュベートした細胞。 </li><li> 6分間、42℃で、この混合物と熱ショック°C、1/10容量（v / v）のDMSOを（36μl）を入れる。 </li><li> 30秒、削除上澄み用6,000 rpmで混合物を遠心分離します。ウラシル（SC-URA）を欠いた合成完全なメディアに無菌のddH 2 0とプレート細胞100μlの細胞を再懸濁します。 </li></ol> 2。 FFL-GFPの誘導前のヒートショックへのタンパク質の大半は新たに末端老化に伴う細胞の不備に起因する時間をかけて集計しているタンパク質を回避するために作られるので、細胞が対数増殖期にある一度NTが &quot;&gt; FFL-GFPが誘導される。 <ol><li> 1日目：30時SC-URA 5ml中インキュベート細胞°C回転O / N </li><li> 2日目：測定OD 600とSC-URA OD 600〜0.2 5ml中の接種新鮮な文化。 </li><li>彼らは対数期OD 600〜0.8〜1.0に達するまで30℃で回転培養する。 </li><li>のddH 2 0500μlの中で3分、デカント上澄みと再懸細胞ペレットのために4,400 rpmで15ミリリットルコニカルチューブで細胞を遠心分離し、マイクロチューブへ転送ソリューション。 </li><li> 6,000 rpmで遠心し、上清を捨てる。 </li><li> SC-URA-MET 5mlに細胞を再懸濁します。細胞は、30℃で1時間℃のため、このメディアに回転培養されるべきである</li><li>遠心細胞とリピートのddH 2 0で洗浄と上清を捨てる。 </li><li> Resuspeタンパク質の発現を阻害し、ステップ3に直ちに進みシクロヘキシミド100μgの/ mlのを含む5ミリリットルSC-URAメディアにおけるNDセル。 </li></ol> 3。酵素FFL-GFP回復アッセイこのアッセイは、集団において活性酵素のレベルを決定するための定量的な手法である。 <ol><li>このアッセイのための準備： <ol class="lroman"><li>各サンプルのOD 600を測定します。 </li><li>サンプルおよび複製プラスチューブ用約1,200μlの、所望の数の数に基づいて、必要に応じて、D-ルシフェリンの必要な量を準備します。 D-ルシフェリンの最終濃度は、細胞を100μlにつき約23μgのです。当初はそれが7.5 mg / mlの原液の濃度で水に溶解し、実験前に455μgの/ SCにおけるmlに希釈した。 図2において、3つの各サンプルのreplicateが使用されているD-ルシフェリン2.4mlの総結果として分析した。 </li><li>フラッシュルミのプログラムプレートリーダーnescenceアッセイ（ &quot;射出と発光フラッシュアッセイ&quot;バイオテックGEN5から適応、他の楽器については、製造元の指示に従ってください） <ol class="lalpha"><li> 30℃に温度を設定</li><li> 、D-ルシフェリンを追加振る、と個別に各ウェルを読むためにプレートリーダーを設定します。 </li><li>発光を読む（エンドポイントの読書、5秒の積分時間、180感度レベル） </li><li> 5分間各読み取り手の間に回復アッセイのために、20分遅らせて、さらに5分を振る。 </li><li>インジェクターからD-ルシフェリン50μlを分注する。 </li></ol></li></ol></li><li>細胞は、タンパク質合成を停止するシクロヘキシミドを含む培地に添加した後、予熱ショック発光を直ちに測定した。 <ol class="lroman"><li>白色96ウェルプレートに複製、所望の数と各サンプルの細胞を100μlを移す。 </li><li>コントロールは水ブランクと空のベクターを含む細胞を含める必要があります。 </li><li> SPEでの読み取りを開始しますcificationsは、上記の。 </li></ol></li><li> FFL-GFPのFFL部分を変性させるために、42℃でガラス培養管の5 mlの培養液をインキュベート°Cで25分間振とう。 </li><li>細胞は、時刻ゼロであるインキュベーターから除去された後に回復アッセイ発光測定値がすぐに開始する。第1の時点および90分毎に30分間、上記と同様のメジャールミネッセンス。 </li><li> OD 600（OD 600によって予熱衝撃値を分割する）に基づいて調整されている予熱ショック発光値にサンプルを正規化します。 </li></ol> 4。蛍光顕微鏡検査法このアッセイは、細胞集団における経時的に凝集体の可溶化を決定するために半定量的方法である。 <ol><li>誘導は、 第2節で説明したように、同じであるプロトコルの1-8ステップ 。 </li><li>同じ時間点（ セクション3、ステップ4）上述したように撮影されていますが、マイク用roscopy 1予熱ショックで細胞mlの各リカバリ時点、と°C培養管で30で回転インキュベートサンプルを収集。 </li><li>可視化： <ol class="lroman"><li> 30秒間6,000 rpmで細胞を1mlを遠心し上清を除去します。 </li><li>のddH 2 O 2μlの中で再懸細胞ペレット</li><li>細胞プラススラ​​イド上の2％低融点アガロース2μlの2μLを混合し、カバースリップを追加します。細胞の単一面を得るために軽くカバースリップの中央に指を押し、カバースリップを移動することが困難になるまで回転させる。 </li><li>細胞を蛍光顕微鏡で100倍のオイル対物を用いて可視化され、GFP蛍光を可視化する細胞およびFITCフィルタを視覚化するために使用DIC。 </li><li>定量のための各時点で各菌株に対して複数の写真を撮る。映像のためのフィールドは、定量的なポスト·実験的解析のために〜15-30細胞が含まれているはずです。 </li><li>凝集体を含む細胞のパーセンテージを計算するために、50を数える-100細胞は、合計して凝集体を含む細胞の数を割る。 </li></ol></li></ol> 5。単一セル顕微鏡この方法は、経時的な単一セル内の個々の凝集物の可溶化をフォローするために使用される。 <ol><li> 第2節では、ステップ1-8で説明したようにFFL-GFPの発現を誘導する。 </li><li>ヒートショックの後、2分間4,400 rpmで15ミリリットルコニカルチューブで遠心細胞。 </li><li>のddH 2 O20μlに再懸濁し、水と500μlの細胞を洗浄</li><li>各株の場合は、SC-URA寒天プレートの5×5 mmのセクションを切り出し、ペトリ皿、ピペットチップと寒天の表面の周りの細胞と広がりμlのピペット4と接触していた面を使用。 〜1分間放置。 </li><li> 〜55ミリメートルのガラスボトムディッシュ番号0にフェイスダウン寒天キューブセクションを配置し、軽く下に押すようにピンセットを使用してください。 </li><li>可視化： <ol class="lroman"><li> 節でI〜IIIを参照してくださいイオン4。 </li><li>文化の密度に応じて、各株について2-4焦点の座標を設定します。 </li><li> （ - 0.5〜1.0μmのスライス厚で/ + 15μm）を90分の期間に5分ごとに適切な範囲を持つZ-スタックで写真を撮るためにカメラを設定します。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

利害の衝突は宣言されていない。

この記事では、モデルタンパク質FFL-GFPは、Hsp104のは、タンパク質の再可溶化および修復に貢献する酵母disaggregaseことを示すために使用されていました。酵素アッセイおよび顕微鏡差動的にリフォールディング効率及び収率を決定するために同一の基質タンパク質のステータスを尋問。酵素回復アッセイの結果は、非効率的なhsp104D変異株で最大の回復ですが、展開のストレスの初期の大きさは変異株（ 図2）の方が大きかっただけでなく、ことを示唆している。分析はまたhsp104D細胞が修復を試みるように見えながら、彼らは早くWT細胞などタンパク質をリフォールディングすることができませんでしたことを示しています。このメソッドは、このタンパク質の修復にHsp104のの本質的な役割を明らかにFFL-GFP活性を高感度かつ定量的な分析を可能にした。 顕微鏡検査の結果、変性FFL酵素の非効率的な修理のための理由が原因tであることを示唆しているoがタンパク質の凝集体の中にトラップ。集団解析はHsp104のを欠く細胞において、細...

ヒトでは、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病を含む神経変性疾患は、タンパク質のミスフォールディングとアグリゲーション10にリンクされている。細胞は6ミスフォールド構造に不活性な細胞タンパク質の運動捕捉を防止する分子シャペロンを使用する。シャペロンは、細胞内の複雑な相互作用ネットワークに参加するが、それは完全にこれらの相互作用の合計は生物のproteostasisに寄与する方法を理解されていない。細胞質タンパク質フォールディングの大部分に関与する主要シャペロンの一つは、70 kDの熱ショックタンパク質（Hsp70の）ファミリ19である。なお、Hsp70は低下する酵母損失が初期の異種発現さFFLを折るし、 インビボ18、7内因性タンパク質、オルニチントランスカルバミラーゼを、リフォールディングしたりすることが示されている。ほぼリアルタイム分解能で折りたたみを分析する能力がCONT方法追加の細胞因子を理解することが容易になるこのHsp70の依存プロセスにribute。また、折り畳み/フォールディング反応はこれらの貢献のタンパク質に完全に依存しないかもしれないので、アッセイは、動態およ​​び効率の大小の変化の両方を検出するのに十分な感度でなければならない。 酵母細胞disaggregase、Hsp104のは、集約されたミスフォールドタンパク質の修復に重要な役割を果たしている。 Hsp104のホモログは、菌類や植物に同定されているが、この家族は後生動物に存在しないと表示されます。そのようなHsp110ファミリーのような他のシャペロンは、哺乳類16の既知のHsp104の一部のアクティビティを実行することが提案されている。 Hsp104のは、AAA +、六量タンパク質複合体である改造タンパク質凝集に酵母で機能する、リフォールディングと修復13に貢献。 Hsp70の酵母、SSA1、そして酵母HSP40、Ydj1とともにHsp104のは、酵母細胞5,8における変性FFLの回復のために必要とされる。小さな熱ショックタンパク質、HSP26も、requiであることが示されているFFL 2 Hsp104の媒介分解のための赤。 FFLは、脱炭酸、ルシフェリン、二酸化炭素（CO 2）、アデノシン一リン酸（AMP）と、光11を放出基板活性部位に基質ルシフェリンを結合し、ATPおよび酸素を必要とするコンフォメーション変化に続いて、二ドメインタンパク質である9,3。市販のFFL基板、D-ルシフェリン、照度計15を用いて検出することができる550から570 nmの光の発光をもたらす。 FFLは展開に応じ迅速に化学薬品や熱治療および集計から変性に絶妙に敏感です。 39-45との間の温度にさらされたとき°C FFLは、可逆的に不活化12折り畳まれる。対照的に、GFPおよびその誘導体は、応力14を展開タンパク質に対して非常に耐性がある。したがって、これら2つのタンパク質の融合は機能Gを標的とすることのできる実験的に不安定な部分として機能することができますFFL人口と単一細胞レベルの両方で、蛍光顕微鏡を用いて可視化することが可能な預金を細胞内FP。自動化された顕微鏡と相まって半自動マルチモードプレートリーダーにおける酵素アッセイのアプリケーションが動態と反応をフォールディングの収量前例のない同時評価を可能にします。また、モデル真核生物サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の容易な分子遺伝学は、正確なタンパク質の品質制御ネットワークの操作と細胞ストレス応答とproteostasisに貢献する新たな選手を識別するための発見ベースのアプローチのための機会の両方を可能にします。 本研究では、FFL-GFPを発現している野生型（WT）とHsp104の欠失株はタンパク質変性熱ショックを受けます。 FFL-GFPのリフォールディングは、回復時間にわたって表明プロテオームの修復のためのプロキシ読み出しとして酵素アッセイおよび顕微鏡の両方を通じて監視されています。 WT細胞と比較したとき、我々は番目を示す電子Hsp104の欠失株は変性FFL 2の再活性化にHsp104のための役割を確立する前の調査結果を支持し、FFL-GFPのリフォールディングで約60％の効率が悪くなります。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Synergy MX マイクロプレートリーダー</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81-ZDC 共焦点倒立顕微鏡</td><td>オリンパス、東京 Lumitrac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 白色 96 ウェルプレート</td><td>USA Scientific SlideBook</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5.0 デジタル顕微鏡ソフトウェア</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. 米国コロラド州デンバー</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</strong</td></tr><tr><td>>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>(LiAc) 酢酸リチウム</td><td>Σ</td><td>L6883</td><td></td></tr><tr><td>PEG(ポリエチレングリコール)</td><td>Fisher</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Malinckrodt</td><td>4948</td><td></td></tr><tr><td>SC</td><td>サンライズ</td><td>1300-030</td><td></td></tr><tr><td>SC-URA</td><td>サンライズ</td><td>1306-030</td><td></td></tr>シ<tr><td>クロヘキシミド</td><td>アクロスオーガニックス357420050</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-ルシフェリン</td><td>シグマ</td><td>L9504</td><td></td></tr><tr><td>低溶融アガロー</td>ス<td>NuSieve</td><td>50082</td><td></td></tr><tr><td>液浸油</td><td>カーギル</td><td>16484</td><td></td></tr></tbody></table>

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（saccharomyces cerevisiae）</em

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

タンパク質の折り畳み/生物発生、リフォールディング/修復、および劣化の複合プロセスとして定義さProteostasisは、有害な結果1を回避するために維持されなければならない微妙な携帯バランスです。このバランスを崩壊させる外部または内部の要因は、タンパク質凝集、毒性および細胞死につながる可能性がある。ヒトでは、このようなハンチントン病、パーキンソン病、およびアルツハイマー病などの神経変性疾患10に関連した症状の主要な要因である。それはproteostasisの維持に関与するタンパク質は、これらの衰弱性疾患の治療法を開発するために識別されることが不可欠である。この記事は、緑色蛍光タンパク質（FFL-GFP）を融合したモデルタンパク質ホタルルシフェラーゼを用いた準リアルタイム分解能で生体内でタンパク質のフォールディングに監視するためのテクニックについて説明します。 FFL部分がストレス誘発mと非常に敏感であるようにFFL-GFPは、ユニークなモデルキメラタンパク質である酵素12を不活性化isfoldingと集約、。ルシフェラーゼ活性は、酵素アッセイを用いてモニターし、GFP部分は、自動顕微鏡を用いて可溶性または集約FFLを可視化する方法を提供する。これらの結合の方法は、リフォールディング、ストレス後の酵素の機能的再活性化の両方を分析するために二つの平行及び技術的に独立したアプローチを採用しています。活性回収を直接良好ようなシャペロンタンパク質などのタンパク質の品質管理因子がこれらの機能を実行するために協力する方法を理解するために分解し、再可溶化の動態と相関させることができる。また、遺伝子欠失又は突然変異がこのプロセスに特定のタンパク質またはタンパク質サブユニットの寄与をテストするために使用することができる。この記事では、このアプローチを検証するために、タンパク質リフォールディングに、システム5リフォールディングHsp40/70/nucleotide交換因子（NEF）と提携して知られているタンパク質disaggregase Hsp104の13の貢献を検討する。

酵母は、効率的リフォールディング熱変性タンパク質にHsp104のdisaggregaseに依存しています。 FFL-GFPの活性は、 図1の発光フラッシュアッセイを用いて、25分間の熱ショック後にモニターした。 図2に示すように、この自動化されたアッセイの結果は、最終的WT細胞における&gt; 80％の回収率につながっ90分かけて段階的に活性の増加が明らかになった。 hsp104Δ株は、同じ時間枠の上にオリジナルの活動の19％を回復した。また、初期の不活化の程度はHsp104のは中FFL-GFPの変性と急速に仲間を保護の役割プレストレスを提供する、またはすることができることを示唆しているシャペロン変異株（WTは26％の活性とhsp104Δで11％）にはるかに高かった熱不活性化ステップは、酵素活性の損失を低減することができる。 人口顕微鏡酵素活性アッセイを裏付け。 hsp104D変異ストラのほぼすべてのセルで維持少なくとも一つFFL-GFPは、熱ショック（ <st...

この資料は、調査するホタルルシフェラーゼ-GFP融合タンパク質の使用を記載<em生体内で&gt;</emで&gt;タンパク質のフォールディング<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em&gt;。モデル熱変性タンパク質のリフォールディング、この試薬を用いて、蛍光顕微鏡およびタンパク質の品質管理にproteostasisネットワークコンポーネントの役割を調査するために酵素アッセイによって同時に監視することができる。

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

本手順の全体的な目的は、蛍光顕微鏡および酵素アッセイを用いて、生体内でのタンパク質の再可溶化およびリフォールディングをほぼリアルタイムでモニタリングすることである。まず、ホタルルシフェラーゼに緑色蛍光タンパク質を融合させたプラスミド（F-F-L-G-F-P）を細胞に形質導入する。次に、F-F-L-G-F-Pタンパク質の発現を誘導し、続いてシクロヘキシミド処理を行ってタンパク質の合成を停止させる。次に、熱変性の前および熱変性後の一定時間におけるルシフェラーゼ活性を測定します。最終ステップとして、細胞を可視化し、F-F-L-G-F-Pタンパク質の溶解性を判定します。最終的に、蛍光顕微鏡観察と酵素アッセイを用いて、複数の菌株におけるモデル展開酵素の再活性化効率を定量化します。エンドポイント解析などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、タンパク質の活性と凝集状態の経時的な相関関係を明らかにできることです。これら2つの現象の関係を特定することで、本手法はタンパク質恒常性分野における重要な疑問、例えば、特定のシャペロンやCOSシャペロンがモデルタンパク質の凝集解消とリフォールディングにどのように寄与しているか、また、細胞内におけるこれら2つの活性が互いにどのように依存しているか、といった問いへの回答に役立ちます。ホタルルシフェラーゼと緑色蛍光タンパク質の融合タンパク質であるF-F-L-G-F-Pは、MET 25 メチオニン抑制性プロモーターの制御下で、このプラスミドから発現します。最適化した酢酸リチウム媒介プロトコルを用いて、プラスミドを2つのcroce visier株、すなわち野生型株と、凝集したミスフォールドタンパク質の修復に重要な役割を果たす酵母の解凝集酵素であるHSP 1 0 4欠損株に形質転換します。本実験の成功は適時な実施にかかっているため、F-F-L-G-F-Pの誘導前に、培地を含む培養チューブ、マイクロ遠心機、チューブ、およびluciferianを準備しておく必要があります。必要となるLuciferの量は、サンプル数と希望する反復回数に基づき、さらにチューブ分として約1, 200 µLを加えた量となります。恒温水槽を42 °Cに予熱します。フラッシュルミネッセンスアッセイ用のプレートリーダーの温度を30 °Cに設定します。プレートリーダーの設定で、Luciferinを添加し、各ウェルを個別にシェイクしてルミネッセンスを測定するようにし、測定モードはエンドポイント測定に設定します。積分時間は5秒、感度レベルは180に設定します。リカバリーアッセイにおける各測定の間は、5分間のシェイク、20分間の待機、その後さらに5分間のシェイクを行うように設定します。injectorにdelucciをロードし、サンプル1つあたり最終濃度が約23 µgとなるよう、Luc

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生物学

ここでは、出芽酵母でのタンパク質複合体を識別するための新しい定量的プロテオミクスの手法を説明します。本研究では、我々は、高い特異性でERタンパク質、Scs2pの結合パートナーを同定するためにタンデム質量分析が続くアフィニティー精製と一緒にSILACメソッドを使用している。...

S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

このプロトコルでは熱ショック後に細胞内タンパク質のリフォールディングを測定する方法が記載されている。このメソッドは、その活性に影響を与えることができる分子シャペロンとその補因子または化合物のようなfoldasesを研究するために使用することができます。ホタルルシフェラーゼ活性は、シャペロンのリフォールディング活性を測定するためのレポーターとして使用されます。...

細胞内のリフォールディングアッセイ

このビデオでは、シクロヘキシミド処理と界面活性剤分画を用いたミスフォールドタンパク質の分解アッセイについて説明しています。この方法は、誤って折り畳まれたタンパク質のダイナミクスを研究し、タンパク質の代謝回転の詳細なメカニズムを明らかにするのに役立ちます。...

ミスフォールディング傾向タンパク質分解アッセイ:シクロヘキシミド処理と界面活性剤分画を用いたミスフォールドタンパク質分解のモニタリング技術

タンパク質の恒常性、ストレス、老化の関係を研究するために、遺伝的に扱いやすい後生動物Caenorhabditis...

Caenorhabditis elegansをモデル系として使用して、多細胞生物におけるタンパク質恒常性を研究する

この記事では、タンパク質分解の遺伝的要件を決定するための酵母増殖ベースのアッセイについて説明します。また、ウェスタンブロッティングに適した酵母タンパク質の迅速な抽出方法を示し、分解要件を生化学的に確認します。これらの技術は、さまざまなタンパク質の分解を監視するために適応させることができます。...

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

私たちは、Saccharomyces cerevisiaeの指向性進化キャンペーンのための突然変異体ライブラリを構築し、スクリーニングするための詳細なプロトコルを提示します。...

指向進化方法で<em&gt;サッカロマイセス・セレビシエ</em&gt;：変異体ライブラリーの作成およびスクリーニング

タンパク質相互作用は、細胞の機能の中心にあります。熱量分光技術は、一般に、それらを特徴付けるために使用されます。ここでは、Shwachman-ダイヤモンド症候群（SBDS）で変異タンパク質と伸長因子様1 GTPアーゼ（EFL1）間の相互作用を研究するためのツールとして蛍光異方性を説明します。...

タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのツールとしての蛍光異方性

本稿では、S.セレビシエ細胞とHEK293T細胞の両方でタンパク質自己集合を定量するFRETベースのフローサイトメトリープロトコルについて説明する。...

フローサイトメトリーによる生体内におけるタンパク質自己集合体の検出と特性特性

ここでは、酵母表面表示基質を酵素修飾アッセイに使用するためのプロトコールを紹介します。このプラットフォームは、代表的な酵素修飾アッセイとして、チロシンホスファターゼSHP-2の基質の1つに対する脱リン酸化活性の分析を使用して実証されました。...

酵母表面表示タンパク質の酵素修飾およびフローサイトメトリー評価

ここでは、80S粒子形成の解析のための精製・塩洗浄真核生物リボソームサブユニットの in vitro 再結合に関する詳細なプロトコルを説明します。この方法は、野生型サ ッカロマイセス・セレビシエ...

in vitro 塩水で洗われたリボソームサブユニットを用いた80Sリボソーム粒子の形成を測定する再結合アッセイ

学ぶタンパク質の再溶解とリフォールディングのin vivoモニタリング法。Saccharomyces cerevisiaeを用いて蛍光顕微鏡と酵素アッセイでプロテオスタシス網の役割を解析し、タンパク質品質管理のメカニズム理解を深める。

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ

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