の生産アフリカツメガエルトロピカ卵抽出

我々は、未受精卵の集合を記述する

次の実験の全体的な目標は、未受精のxenopus tropicカルス卵子から細胞質抽出物を作成し、in vitroで多くの細胞プロセスを再現するために使用できることです。これは、最初にホルモンを注射して、エナポストトロピカルスを誘発して未受精卵を産むことによって達成されます。次に、卵を回収し、洗浄し、遠心分離により粉砕し、卵の細胞質を単離します。

次に、抽出物を使用して微小管、関連タンパク質、およびRNAを精製し、mRNAのゲノムワイドビューを取得します。微小管関連RNAのハイスループットシーケンシングに基づいて、数百のmRNAが筋球微小管に特異的に会合することを示す局在化結果が得られました。Opus Lavis卵抽出物のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、zap tropicが、転写された配列の包括的な同定および発現タンパク質の包括的な同定を可能にする配列ゲノムを有することであり、これは現在、zap lavisでは可能ではない抽出物を単離するためのX熱帯卵を生成することである。

まず、2 濃度のヒト絨毛性ゴナドトロピンまたは HCG を調製します。まず、10, 000 ユニットの凍結乾燥 HCG 粉末を 10 ミリリットルの滅菌脱イオン水に懸濁し、最終濃度を 1 ミリリットルあたり 1000 ユニットにします。次に、1ミリリットルの希釈溶液を9ミリリットルの水と混ぜ合わせて、最終濃度を1ミリリットルあたり100単位にします。

1日目の午後2時から3時頃に摂氏4度で両方の溶液を保管し、HCGのミリリットルあたり0.2ミリリットルの100ミリリットルでクロアカの近くの背側リンパ嚢にそれらを注入することにより、産卵用の4〜6匹のカエルを準備しますその後の注射中に存在するカエルの廃棄物の量を最小限に抑えます。2日目の午後2時から午後3時までカエルを断食させ、翌日同じカエルに2回目の同じ注射を投与します。ここに示されているように、午前7時から午前10時の間に注入を繰り返して、カエルを産卵用にセットアップし、6クォートのプラスチックバケツに新鮮なタンクの水を入れます。

カエルを加え、摂氏25度の暗闇に置きます。産卵は4時間以内に開始し、7時間以内に完了する必要があります。その間に、テキストプロトコルに従って緩衝液と薬剤を調製します。

次に、ファイヤーポリッシュガラスパスティアピペットを作るには、5インチと3/4インチのガラスピペットの端をスナップして広い開口部を作り、炎にさらします。先端をなめらかに。ビーカーの壁をコーティングするために0.2%ゼラチン溶液を渦巻かせて、卵を保存するための500ミリリットルのガラスビーカーを準備します。

次に、未使用のゼラチン溶液を廃棄します。産卵が完了したら、プラスチックのバケツから卵を集め、必要に応じて、各カエルを一度そっと絞って、残っている卵を隔離します。タンクの水を使用して卵を一度洗い、卵を濡らしておくのに十分なタンク水でゼラチンでコーティングされたガラスくちばしに移します。

抽出物をゆっくりと調製するには、ビーカーの壁に約300ミリリットルの1 XMMRを加えて、卵への物理的な動揺を最小限に抑え、卵を落ち着かせます。上清をデカントして破片を取り除き、MMR洗浄を繰り返します。次にさらに2回、卵をできるだけ多くのMMRからデカントし、125ミリリットルの新しく調製したデイ溶液を約5分間連続して渦

数分後、溶解するゼリーコートが見えます。この時点で、液体をデカントし、残りの125ミリリットルの新鮮なデゼリー溶液を追加します。繰り返しになりますが、卵が非常にしっかりと詰め込まれ、すべての卵が野菜の棒を皿の底に向けて向けるまで、溶液を絶えず渦巻きます。

今の de ゼリーの卵は機械的な操作に敏感です。できるだけ多くの液体をすばやくデカントし、X XB洗浄液を1つ慎重に追加して渦巻き、Xが活性化されたビーカーの底に落ち着くようにします。細胞増殖抑制因子またはCSF停止を免れたXトロピカリスの卵は、ひもで結ばれたように見えます。

ふくらんでいる白と疑似劈開を受けたものとして、表面に残る傾向があります。プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、これらを皮膚やカエルの廃棄物と一緒に取り除き、洗浄を繰り返す前にできるだけ多くの溶液をデカントします。さらに2回、次に卵をCSF XBで2回洗い、デカントしてからCSF xbに懸濁します。

さらに、ゼラチン処理された火で磨かれた過去のピペットを使用します。Xを空気にさらさないように注意しながら、CSF XBプラスを使用して卵を超遠心チューブに移します。ウォータークッションが入った15ミリリットルのガラス製遠心チューブ内にチューブを入れ、臨床用遠心分離機で卵を200Gで1分間回転させます。

速度を800GSに上げて30秒間回転します。吸引器を使用して、卵からできるだけ多くのバッファーを取り除きます。彼らは上がほぼ乾いているはずです。

その後、卵子をHB 6ローターを装備したsova RC 6遠心分離機に移し、17, 000 GSおよび20°Cで15分間回転させます。1ミリリットルの注射器に18ゲージの針が取り付けられています。色素層と脂質層の間の黄色の細胞質層を取り除きます。

次に、チューブの側面に穴を開け、シリンジバレルをゆっくりと引っ張って細胞質抽出層を収集し、色素顆粒をできるだけ避けます。新しい超遠心チューブに移します。ウォータークッション付きのガラス製遠心チューブに入れ、摂氏20度で17, 000GSで20分間回転させます。

抽出を2回目に繰り返した後、細胞質を1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに移し、健康なカエルのコロニーからのカエルあたり通常300〜500マイクロリットルの抽出物である容量を推定します。次に、細胞Dとレプチン、PEP、スタチン、スタチン、キオススタチンまたはLPCを追加します。それぞれ1〜1000の最終濃度を追加します。

1ミリリットルのピペットチップを使用してよく混合し、気泡を避けて最大限の活動を維持します。抽出物を保存し、室温で100〜200マイクロリットルのアクア抽出物に実験的操作を行います。最終濃度10マイクロモルのタキソールを添加し、室温で30分間インキュベー

対照反応のために、等量の抽出物を微小管不安定化薬で処理し、コナゾールを含まず、分析のために未処理の抽出物100マイクロリットルを予約し、薬物処理抽出物を10容量のBRB 80と30%グリセロールで希釈し、次にB rrb 80と60%グリセロールの10ミリリットルのクッションを含む14ミリリットルの丸底ポリプロピレンチューブを組み立てます。次に、ワイドボアピペットチップを使用して、BRB 80と60%グリセロールクッションの上に薬物処理抽出反応を穏やかに重ね、チューブアダプターを使用して17,000GSおよび20°Cで10分間遠心分離します。沈殿していない抽出物を含む上清を吸引し、タキソール処理サンプルの界面を脱イオン水で2回洗浄します。

残りのクッションボリュームをゆっくりと吸引します。微小管、微小管関連タンパク質、微小管関連RNAを含むゲル状ペレットを乱さないように注意してください。コルチゾール処理されていないサンプルには、目に見える物質は含まれていません。

ペレットを1ミリリットルのトリアゾールに懸濁し、最大100マイクロリットルの未処理抽出物を1ミリリットルのトリオールに直接再懸濁することができるRNAを単離するための製造元の指示に従います。最後に、この図では、RNAシーケンシングに適したトランスクリプトームライブラリを調製するための市販のキットを使用します。タキソールで処理したX熱帯抽出物から精製された微小管のクマシゲル分析により、αベータチューブリン沈殿物がタキソール依存的に存在し、これらの調製物で回収された主要なタンパク質種を表していることが確認されました。

タキソールペレットには低レベルの追加のタンパク質も存在しますが、微小管解重合薬noolで処理された製剤には存在しず、ここで見られるように、タキソール画分のタンパク質が微小管関連タンパク質であることを示しています。X tropic 抽出物の RNA 組成の分析は、RRNA と TRNA の両方が CSF 抽出物とタキソール ペレットを含む微小管に存在することを示しており、以前の調査結果と一致しています。この翻訳は、X lavis卵抽出物の微小管と紡錘体で発生します。

ここに示すゲル突起の線トレースは、タキソールペレットを含む微小管、特に28 S-R-R-N-Aより上に移動する領域において、mRNAシグナルが著しく低いことを明らかにし、mRNAのサブセットがx熱帯の微小管と共沈殿することを示していますこの手順に従う。細胞周期解析などの他の方法を実行して、限局性mRNAが筋紡錘体アセンブリにどのように影響するかなどの追加の質問に答えることができます。