A線虫（Caenorhabditis elegans）モデルシステム

この手順の全体的な目標は、アミロイドベータ毒性がニューロン機能と生存に及ぼす影響を評価することです。これは、まず、SE感覚ニューロンにGFPレポーターを用いてアミロイドβペプチドを発現するトランスジェニックCエレガンス線虫を構築することによって達成されます。次に、SEニューロンでアミロイドベータを発現することの行動的影響を、走化性アッセイによって評価します。

第3のステップは、SEニューロンの初代培養物を取得し、培養ニューロンをQ-V-D-O-P-Hなどの薬理学的薬剤で処理して、アミロイドベータの毒性作用を抑制することです。最終的には、行動学的および薬理学的アッセイを通じて、アミロイドβ毒性がSEニューロンの機能と生存に及ぼす影響を示すことができます。この方法は、特定の細胞および分子メカニズムの解明など、神経変性に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。

アミロイドβオリゴマーの根底にある神経毒性作用。手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるZing Dwan博士です 形質転換には、2%アグロス注射パッドが必要です。水に溶かしたホットアロスをガラスのカバースリップに一滴垂らし、2枚目のカバースリップをすばやくドロップに置き、軽くたたきます。

注射ミックスを作るときは、必ず遠心布団を送り、破片やその他の汚染物質のない上部の5マイクロリットルを新しいチューブに移し、注射負荷、注射ミックス、および空のプラスミドを毛細管現象によって注射ピペットに移してください。通常、半分のマイクロリットルは、注射ピペットの開口部を広げるために100匹のワームを注入するのに十分です。ハローカーボン700オイル。開口部の品質は非常に重要です。

これは、チップの形状、そして最も重要なのは、流量によって評価され、流量と、注入圧力に応じてピペットチップに形成される気泡のサイズによって判断されます。次に、700ハロカーボンオイルをインジェクションパッドに一滴垂らし、いくつかのワームをパッドに移します。ワームピックを使用して、ワームがアロスに付着するまでワームをパッドに押し下げます。

ワームは、腹側を揃えて列に向ける必要があります。頭に触れないようにしてください。何度か試みてもワームがパッドに付着しない場合は、新しいパッドを試すか、パッドの厚さまたは濃度を上げてください。

次に、ピペットをワームに挿入します。まず、ステージを動かして、ワームをピペットの下に配置します。ピペットを生殖腺の中央コアの隣に置きます。

その細胞質は多くの生殖細胞核によって共有されているため、注入されたDNAが子孫に受け継がれる可能性が高まります。ピペットはワームとほぼ平行にある必要があります。第三に、皮膚がくぼむまで先端を体に向かって垂直に動かします。

最後に、マニピュレーターを軽くたたいて、先端の挿入を誘導します。次に、DNA溶液を注入します。生殖腺が膨らむまでピペットに圧力をかけます。

次に、流れを止め、ウォームをピペットから引き抜きます。針の流れをテストしてから、次の線虫に進む前に他の生殖腺を注入します。注射後、約10マイクロリットルの回復バッファーをワームに追加し、ウォームが泳ぎ始めるのを待ちます。

泳いだら、等量のMナインバッファーを追加します。ワームが泳ぎを再開したら、溶液がほとんどM nineになるまでM nineを追加し続けます。次に、各ワームを座ったプレートに移します。

GRワームを50ミリリットルのファルコンチューブ内の1ミリリットルのMナインバッファーに集めます。次に、M nineバッファーを使用して、遠心分離と溶液置換を繰り返して、洗浄後にM nineが透明になるまでワームを洗浄します。次に、シラミに10容量の塩基性次亜塩素酸塩溶液を追加します。

ペレット化されたワームは、ワームの約5分の4が壊れるまで室温でワームをインキュベートします(通常は10分かかります)。アリコートを採取して顕微鏡で観察することにより、反応を監視します。等量の滅菌卵バッファーを添加して反応を停止します。

次に、卵と死体を450 Gで5分間遠心分離して収集します。上清をそっと取り除きます。等量の卵バッファーを再び加え、チューブを再び450 Gで5分間遠心分離します。

バッファがクリアされるまで、この手順を繰り返します。次に、卵をM nineバッファーで一晩インキュベートし、翌日、標準的なNGMプレートに播種します。一辺が約半センチメートルの寒天のいくつかの立方体を準備します。

寒天チャンクを目的の誘引剤を含む溶液に2時間浸します。テストスポットとコントロールスポットの位置がマークされた10cmのテストプレートに寒天チャンクを堆積させます。実験ごとにそのようなプレートを5つ準備します。

プレートを翌日摂氏20度で一晩放置することにより、プレートが化学勾配を形成するのを待ちます。実験に先立ち、プレートの各スポットに10マイクロリットルの20ミリモルアジ化ナトリウムを加えます。これは麻酔薬として機能します。

実験を開始するには、プレートの中央に20匹の年齢同期ワームを配置し、次にプレートを摂氏20度のインキュベーターに1時間置きます。1時間後、テストに参加した動物をコントロールスポットにカウントし、CIインデックスを計算します。grワームを溶解し、前述のように卵と死体を洗浄した後、それらを2ミリリットルの滅菌卵緩衝液に再懸濁し、2ミリリットルの滅菌60%スクロースを卵緩衝液に加えます。

次に、卵が完全に再懸濁されるまで、チューブを手またはボルテックスで混合します。再懸濁した卵をGの450倍で15分間遠心分離します。次に、卵で満たされた上清を慎重に収集し、口蓋を捨てて残留ショ糖を取り除き、卵を卵バッファーに再懸濁し、450 Gで5分間遠心分離します。

上澄みをそっと集めて捨て、フードで洗浄プロセスを3回繰り返します。キチナーゼ1ミリリットルあたり1単位を含む滅菌卵緩衝液を使用して、ペレット卵を再懸濁します。.卵を室温で30分間消化させた後、倒立細胞培養顕微鏡で反応のモニタリングを開始します。

卵殻の70〜80%が消化されたら、5ミリリットルの完全L 15培地またはCM 15を加えます。細胞を単離するには、細胞を27ゲージの針に数回流して、細胞が塊を形成しないように解離します。次に、溶液を5ミクロンフィルター付きのシリンジに通します。

解離した細胞懸濁液を450 Gで15分間遠心分離してペレット化します。次に、上清を取り除き、ペレット化した細胞をCM 15に再懸濁します。細胞が解離していることを確認するには、顕微鏡で懸濁液を確認します。

最後に、解離した細胞を、以前にコーティングしたガラスカバースリップにプレートします。ピーナッツレクチンを使用すると、細胞を通常の空気で室温で2週間以上維持できます。記載された形質転換技術を用いて、走化性アッセイを用いてビオチンなどの水溶性誘引物質を検出するニューロンであるa SEニューロンにおいてヒトβ42を発現するようにトランスジェニック線虫を構築した。

7日齢のトランスジェニック線虫を試験しました。コントロールズはビオチンを見つけるのに苦労しませんでした。対照的に、ベータ42を発現する少数の線虫だけが誘引スポットを見つけることができました。

ビオチンの走化性指数は、3〜4日で0.68であったのに対し、対照線虫と実験線虫はそれぞれ0.12でした。また、指数にはわずかながらも検出可能な低下が見られました。生後9日経ってもGFPを発現している4日間の培養A SERニューロン。

しかし、GFP蛍光は消失し、アポトーシスがこの理論を検証すると疑われました。一次A SERニューロンを記載通りに調製し、広域スペクトルのカスパーゼ阻害剤を補充した。予想通り、この治療により蛍光の喪失が止まり、ヒトAベータ42の発現がA SERニューロンのアポトーシスを引き起こすことが確認されました。

このビデオを見た後、エレガントなトランスジェニックワームの構築方法、行動エッセイでそれらを研究する方法、およびアンブローズから一次培養を取得する方法についてよく理解しているはずです。