Name: A線虫（Caenorhabditis elegans）モデルシステム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学ぶアミロイドβ毒性の神経機能への影響をCaenorhabditis elegansモデルで評価する方法。化学走性アッセイと薬理学的アッセイを用いて神経変性のメカニズム解明に貢献します。

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<p class="jove_content"&gt;私たちは、原稿の重要な読書のための博士双劉に感謝します。 PCL12コンストラクトは、ギフト用のフォーム博士クリストファーD.リンクだった。この作品は、2つの国立科学財団の助成金（0842708および1026958）とFSにAHA助成（09GRNT2250529）によってサポートされていました。</p

1。トランスジェニックワームの構築<ol><li>変換。 <ol><li>インジェクションパッドを準備します。ガラスカバースリップ上に、水に溶解し、ホット、2％アガロースのドロップを置きます。素早く降下に第二カバースリップを置き、軽くそれをタップします。アガロースが固化した後、離れてカバースリップをスライドさせて、80℃の真空オーブン中でカバースリップパッドを焼く°CO / N. </li><li>ピペットを引き出します。私たちは、1/0.5 mmのフィラメントとOD / IDホウケイ酸毛細血管を引っ張ってサターP-97プーラーを使用しています。ピペットは、後の段階で開いた壊れているクローズドチップで偽造されています。 </li><li>注射ミックスを調製する。 150 ng /μLの最終濃度に興味のあるDNA（コンストラクトあたり20 ngの/μl）を加えて、空のプラスミドDNAを含む注射液を作る。任意の汚染物質を除去するために注射液を遠心分離。汚染物質は、変換効率を低下させるため、この手順は重要です。 Bに新しいチューブにトップ5μLを（破片やその他の汚染物質が底に集める）を転送注射で使用する電子。 </li><li>毛細管現象によって注入ミックスをロードします。ピペットの底部は、注射混合物に浸漬される。典型的には0.5μlの100ワームを注入するのに十分である。 </li><li>インジェクションピペットをロードします。マイクロマニピュレータのホルダーにピペットを挿入し、アガロースパッド上の破片に対してスライドガラスまたは代わりに取り付けられたカバースリップの端にその先端を擦ってオープンそれを破る。これは大きすぎるヒントダメージワームとして重要なステップであり、小さすぎるのヒントは簡単に目詰まりしています。壊れた先端部の品質は、流量による最も重要な形状とすることにより判断することができる。流量は、噴射圧力に応答してハロカーボン700の油滴中に浸漬オープン先端から流入する気泡の大きさによって評価することができる。 </li><li>インジェクションパッドにワームを転送します。インジェクションパッド上700ハロカーボン油の滴を置き、油に（初心者のための1または2）いくつかのワームを転送します。まで、パッド上にワームを押し下げるために選ぶワームを使用して、yはアガロースに準拠しています。ワームは、同じ方向を向いて腹の辺を持つ行に配向する必要があります。ワームの頭に触れないようにしてください。ワームがパッドに付着しなかったいくつかの試みの後の場合は、新鮮なパッドと交換またはアガロースの厚さ、および/または濃度を高める。 </li><li>ワームにピペットを挿入します。ステージを移動することにより、ピペットの下にワームを位置付ける。その細胞は、多くの生殖細胞核によって共有されているため、生殖腺の中核でピペットを置きます。これは多くの子孫に注入するDNAを提供する可能性が高くなります。ピペットは、ワーム（〜15°-25°の角度）とほぼ平行である必要があります。皮膚が押されるまで、垂直にワームのボディ下にピペットの先端を押してください。その後、そっと先端の挿入を誘導するためにマニピュレータをタップします。最良の結果を得るには、両方の生殖腺を注入。 </li><li> DNA溶液を注入する。性腺うねりまでピペットに圧力を適用します。流れを停止し、ピペットからワームを引く。流れのための針をテストしてから移動次のワームを繰り返し注入ステップへ。 </li><li>ワームを回復：ワームでリカバリバッファのドロップ（〜10μl）を追加し、ワームは水泳始めるまでインキュベートする。ワームは水泳を再開し、溶液がほとんどM9になるまで数回繰り返すまではM9の等量を追加し、待つ。個別シードプレートにワームを転送します。 </li></ol></li><li>統合。 <ol><li>新鮮なプレートに40の健康な、よく飼育、L4ワームを置き</li><li> 40分間4,000ラドとγ線で照射。新鮮、OP50シードプレート（4ワーム/プレート）で照射ワーム（P0）を転送します。ワームは、代わりに300 J / m 2でUVの線量で照射することができる。 </li><li>各プレートから個々のプレート10〜20 F1の形質転換体は、ラベル対応P0を原点とプレートを転送します。 </li><li>別のプレートに各F1 2-4 F2形質転換日シングル。形質転換マーカーの100％の伝送のためのF3子孫をチェックしてください。通常、照射ワームウィルからの子孫の1〜3％lは統合イベントを持っている。 </li><li>三つ以上の独立した形質転換株の株式を作る。 </li></ol></li></ol> 2。行動アッセイ<ol><li>年齢同期。 <ol><li>標準の10センチNGMプレート+ OP50 E.でワームを育てる妊娠成人の大規模な人口まで大腸菌 （3-5日）に達した。 </li><li> 1ミリリットルM9バッファーに懸濁して50ミリリットルファルコンチューブにワームを収集します。 </li><li> 3分間450 xgで5ミリリットルM9バッファと遠心を追加します。上清を捨てます。 3〜4倍を繰り返します。 </li><li>最後の遠心分離の終わりに、上清を除去し、ペレット化したワームへの基本的な次亜塩素酸塩溶液（0.5 M NaOHを、新たに混合し、1％次亜塩素酸）の10ボリュームを追加します。 〜10分間室温でインキュベートする。溶解反応は、カバースリップ上で溶解反応の低下を確定し、顕微鏡下でワームを調べることによってモニターすることができる。ワームの約80％が破壊されたときに反応を停止する必要があります。 </li><li>アドインによる溶解反応を停止させる無菌卵バッファgが同じボリューム。 </li><li> 5分間450×gで遠心分離することにより卵（と死体）を収集。 </li><li>無菌卵バッファ2〜3倍で卵を洗ってください。 </li><li> M9バッファとシードそれら標準NGMプレート上に卵O / Nをインキュベートする。 </li></ol></li><li>走化性アッセイ。 <ol><li>寒天大体0.5x0.5x0.5センチのいくつかの部分を準備します。私たちは、10センチプレートに寒天を堆積し、我々はそこから寒天チャンクをカット。 </li><li> 2時間のために必要な誘引を（飽和、ほぼ飽和濃度で）を含む溶液で寒天チャンクを浸す。典型的な誘引は、リジン（0.5M）、ビオチン（0.2 M）である。 </li><li>試験スポットの位置と制御点が（ 図1A）とマークされていた10センチ試験プレートに寒天チャンクを堆積させる。平衡とグラデーションO / N（ 図1B）の形成を可能にする。単一の実験のために5プレートを準備します。 </li><li>事前の実験では、20mMのNaN 3を（ANEST10μlのを追加各スポットへhetic）。 </li><li>プレートの中央に20歳同期ワームを置きます。 20℃のインキュベーター内でプレートを置き</li><li> 1時間後、テスト/制御スポットに動物を数え、次のように走化性指数（CI）を計算： <img alt="式（1）" fo:content-width=".863in" fo:src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1.jpg" />ここで、N、N テストとN Cntを。、動物の総数を示し、テストスポットとコントロールスポットの動物数の動物の数。 </li></ol></li></ol> 3。プライマリ胚細胞培養<ol><li>年齢同期に記載されているようにワームを溶解する。 </li><li> 5分間450×gで滅菌卵バッファと遠心分離機の同じ体積を添加して溶解反応を停止させる。優しくペレット化卵を失わないように注意しながら上清を捨てる。 2-3Xまたは上清が透明になるまで繰り返します。 </li><li>ペレット化した卵（と死体を再懸濁し2）mlの滅菌卵バッファに、卵·バッファ内の無菌の60％ショ糖2 mlを加える。卵は完全に手やボルテックスによって（彼らは遠心下塊を形成する傾向があるように）再懸濁されるまで、このソリューションを混ぜる。 </li><li> 15分間450×gで遠心分離します。 </li><li>慎重に滅菌チューブに上清を（卵を含む）を譲渡する。死体と溶解の副産物他が含まれているペレットを捨てます。 </li><li>卵バッファに卵を再懸濁し、5分間450×gで遠心分離することによって残留蔗糖を削除します。優しく上清を回収し、廃棄する。 3倍を繰り返します。 </li><li>層流フードの下で卵の殻を消化​​するために、室温で1 U / mlのキチナーゼを含む無菌卵バッファにペレットに卵を懸濁します。 30分後、反応を（反転された細胞培養顕微鏡）を監視し始める。キチナーゼの各バッチは、わずかに異なる活性を有する。典型的に消化物を1時間で完了する。 </li><li>大体70〜80％の卵の殻は、キチナーゼアドCM-15（L-15細胞培養MEDによって消化されている場合イウム）は、10％ウシ胎児血清、50 U / mlのペニシリン、および50μgの/ mlのストレプトマイシンを含有する。 27ゲージで注射器を用いて細胞を解離。無傷の胚を除去するためにフィルター5.0μmで、細胞や幼虫の塊と細胞懸濁液をろ過する。 </li><li>ペレット15分間450×gで遠心分離によって解離細胞懸濁液。上清を除去し、CM-15細胞培養培地でペレットを再懸濁します。 </li><li>ガラスカバー上のプレート解離細胞が水に溶解したピーナッツレクチン（0.1 mg / ml）でと以前にコーティングされたスリップ注：細胞が区別するために、基板に準拠する必要があります。 </li><li>細胞を2週間以上、空気中でRT（16-20℃）に維持することができる。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ここでは、Cを使用amylopathiesの細胞および分子の側面を研究するために、複合的なアプローチを説明しますエレガンス 。このアプローチの利点は次のとおり。1）低コストの線虫を室温で、細菌を接種し、通常のペトリ皿に保持される。 2）強力な遺伝学。トランスジェニック動物は、数ヶ月で得られたプロモーター配列の広い配列は、特定のニューロンにおける所望の遺伝子の発現を駆動することが可能であることができる。 3）シンプル、十分に特徴付けられ、神経系。C.虫が著しく単純な神経系（302ニューロン）を持っています。このシンプルさが細胞系譜、各ニューロンの特定の機能/役割とそのシナプス結合を含むワームの神経系の広範な特性評価を与えています。 C.の限界エレガンスは、このような免疫組織化学や神経を絶縁厚い皮（キューティクル）などの標準的な生化学的手法の適用を妨げる細胞の小さなサイズを含めるronsは、外部環境を形成します。したがって、薬理学的ア ​​プローチは、Cで限られた有効性のものであってもよいエレガンス。</em...

アミロイドベータ（Aβ）βおよびγセクレターゼ1によるアミロイド前駆体タンパク質（APP）の連続的切断後に形成される36-43アミノ酸のペプチドである。 γセクレターゼは、AβペプチドのC末端を処理し、その変数の長さ5を担当する。 Aβの最も一般的な形態は、Aβ40とAβ42、より一般的なAD 5などの病態に関連している後者である。アミロイド線維6を形成するために集約すること、高濃度Aβフォームβシートで。線維預金は、ニューロンを取り巻く老人斑の主成分である。両方斑および拡散性、非プラークAβオリゴマーは、Aβの基礎となる病原形を構成すると考えられている。 神経amylopathiesの実験室での研究は、時間とともにこれらの条件が進歩という事実によって複雑になる。したがって、それはimportanですがマウス、短い寿命に遺伝的に扱いやすい動物モデル相補的開発するT。これらのモデルはamylopathies通常は細胞および分子とそのシンプルさのおかげでの特定の側面を解明するために使用することができ、問題の本質をキャプチャするために役立ちます。ワーム線虫（Caenorhabditis elegans）の滝がこのカテゴリです。それは短い寿命を持っている、〜20日と加えて、遺伝子発現、タンパク質輸送、神経接続、シナプス形成、細胞シグナリング、および死の調節など、基本的な細胞プロセスは、哺乳類7に似ています。ワームのユニークな特徴は、強力な遺伝学と独立して血管損傷の神経損傷を勉強できるように血管系の欠如が含まれています。一方、脳の欠如は、Cの使用を制限する神経変性の多くの側面を研究する虫 。また、病変の解剖学的分布の再現性と識別は、この生物において行うことができない。その他の制限管理ポイントは、遺伝子発現プロファイルおよび複雑な挙動とメモリ機能障害の違い両方を評価する難しさが挙げられる。ここでは、Cを生成する方法を説明amylopathiesのエレガンスモデル 。

<table><tbody><tr><td colspan="4">1.NGM塩化</td></tr><tr><td>ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>3 g</td></tr><tr><td>細菌寒天</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td>17 g</td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>AMRESCO</td><td>J636</td><td>2.5 g</td></tr><tr><td>蒸留水</td><td></td><td></td><td>975 ml</td></tr><tr><td colspan="4">オートクレーブ滅菌し、次の項目を追加してよく混合</td></tr>します <tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>1 ml 1 M ストック</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>1 ml 1 M</td></tr><tr><td>ストック コレステロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3045</td><td>1 ml 5 mg/ml ストック 1 ml (エタノール中)</td></tr><tr><td>リン酸カリウム緩衝液</td><td></td><td></td><td>25 ml 1M ストック</td></tr> <tr><td colspan="4">2.リン酸カリウム緩衝液</強力></td></tr>リン酸<tr><td>カリウム一塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>108.3 g</td></tr><tr><td>リン酸カリウム二塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>35.6 g</td></tr><tr><td>蒸留水</td><td></td><td></td><td>1 L</td></tr><tr><td colspan="4">オートクレーブ滅菌<</td></tr><tr>td colspan="4">3.M9 バッファー</強></td></tr><tr><td>リン酸カリウム 一塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>3 g</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td>6 g</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>5 g</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td> 1 <td>ml 1 M ストック</td></tr><tr><td>蒸留水</td><td></td><td></td><td>1 L</td></tr> に<tr><td colspan="4">オートクレーブ滅菌済み</td></tr><tr><td colspan="4">4.卵バッファー (pH 7.3, 340 mOsm)</td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>118 mM</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>48 mM</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4880</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>蒸留水</td><td></td><td></td><td>は1 L</td></tr><tr><td colspan="4">オートクレーブで滅菌<</td></tr><tr>td colspan="4">5。CM-15</strong</td></tr><tr><td>>L-15培養培地</td><td>Gibco</td><td>11415</td><td>450 ml</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>ペニシリン</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>50 units/ml</td></tr><tr><td>ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>50 g/ml</td></tr><tr><td colspan="4">スクロースで 340 mOsm に調整し、滅菌フィルターをオートクレーブ滅菌ボトルに入れて 4 °C で保存します。C</td></tr><tr><td colspan="4">6.その他の試薬</td></tr><tr><td>Halocarbon 700オイル</td><td>ハロカーボン製品</td><td>9002-83-9</td><td></td></tr><tr><td>5 &mu;m Acrodiscシリンジ</td><td>フィルターPALL株式会社</td><td>4199</td><td></td></tr><tr><td>キチナーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6137-5UN</td><td></td></tr><tr><td>レクチン(ピーナッツ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0881-10MG</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S320</td><td></td></tr><tr><td>リジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>次亜塩素酸ナトリウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>425044</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr></tbody></table>

a<em&gt;線虫（caenorhabditis elegans）</emamylopathyの研究のための&gt;モデルシステム

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathyは時間とともに組織におけるアミロイドβ（Aβ）の異常合成と蓄積を説明する用語です。 Aβは、アルツハイマー病（AD）の特徴であり、レヴィー小体認知症、封入体筋炎および脳アミロイド血管症1-4に見出される。 Amylopathiesは徐々に時間を使って開発。このような理由から短い寿命を持つ単純な生物は、これらの条件の分子の側面を解明するのに役立つ可能性があります。ここでは、ワームの線虫（Caenorhabditis elegans）を用いたAβ媒介神経変性を研究するための実験プロトコルを記述します。したがって、私たちは大人雌雄同体の生殖器合胞体にコードするDNA人間Aβ42を注入することにより、トランスジェニックワームを構築する。形質転換線は突然変異誘発によって誘発される積分によって安定化される。線虫は、それらの卵を採取し、播種によって同期化時代である。 Aβ42を表現するニューロンの機能が（適当な行動アッセイで試験される走化性アッセイ秒）。胚から得られた一次ニューロン培養は、行動データを補完し、抗アポトーシス性化合物の神経保護効果を試験するために使用される。

我々のプロトコルでは、我々は神経機能8に人間Aβ42オリゴマーの影響を研究。フラグメントをコードするヒトAβ42および火災ベクトルpPD50.52の人工シグナルペプチドコード配列は、末端にSmaIで1制限エンドヌクレアーゼ部位を導入したプライマーを用いて構築PCL12 9から増幅した。断片をSmaIで一意1部位10との間pPD95.75火災ベクトルで2,481 bpのFLP-6プロモーター配列を含有する構築物に挿入した。プロトコール1に記載された形質転換技術を用いて、我々は、ASEニューロン（FDX（ses25）株）8Aβ42を発現するトランスジェニックワームを構築した。肯定的な形質転換体をマークするために我々は、特にASE権（ASER）ニューロン11にGFPの発現を駆動するP GCY-5 :: GFPレポーターを使用していました。乾いたアガロースが彼らの水を吸収するのでワームはパッドに固執する。したがって...

私たちは、ワームでamylopathiesの側面を研究するための方法を説明<em&gt; C.エレガンス</em&gt;。我々は人間のAβを発現しているワームを構築する方法を示し<sub&gt; 42</sub&gt;ニューロンにおいて、どのように行動アッセイにおけるそれらの機能をテストします。私たちは、さらに薬理試験のために使用することができ、一次ニューロン培養を取得する方法を示しています。

A<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</emAmylopathyの研究のための&gt;モデルシステム

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

この手順の全体的な目的は、アミロイドβの毒性がニューロンの機能および生存に及ぼす影響を評価することです。まず、SE感覚ニューロンにおいてGFPレポーターとともにアミロイドβペプチドを発現するトランスジェニックC. elegansを構築します。次に、SEニューロンでアミロイドβを発現させたことによる行動上の影響を、化学走性アッセイによって評価します。第3のステップは、SEニューロンの一次培養細胞を得て、その後、アミロイドβの毒性作用を抑制するためにQ-V-D-O-P-Hなどの薬理学的薬剤で培養ニューロンを処理することです。最終的に、行動解析および薬理学的アッセイを通じて、アミロイドβの毒性がSEニューロンの機能と生存に及ぼす影響を示すことができます。この手法は、特定の細胞および分子メカニズムの解明など、神経変性に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。アミロイドβオリゴマーの根底にある神経毒性効果について。手順の実演は、私の研究室のポストドクターであるDr.Zing Dwanが行います。作製には、2%アガロース注入パッドが必要です。水に溶解した熱アガロースを1滴ガラスカバースリップ上に落とし、すぐに2枚目のカバースリップをその滴の上に置いて軽く叩きます。注入ミックスを作成する際は、必ず遠心分離を行い、デブリやその他の不純物のない上層5 µLを新しいチューブに移して注入ロードとして使用してください。注入ミックスおよび空のプラスミドを、毛細管現象によって注入用ピペットに吸い上げます。通常、100匹の線虫に注入するには0.5 µLで十分です。注入用ピペットの開口部を広げるには、Halo carbon 700 oilを塗布したガラススライド上のカバーガラスの端で、ピペットの先端をこすってください。開口部の質の良さが極めて重要です。それはチップの形状、そして最も重要な点として、注入圧力に応じてピペットチップに形成される気泡の流れと大きさによって評価される流量によって判断されます。次に、700 hallow carbon oilを1滴注入パッドに滴下し、数匹の虫をパッドに移動させます。ワームピックを用いて、虫がアロスに付着するまでパッドに押し付けます。線虫は腹側を揃えて列に並べてください。頭部に触れないように注意してください。数回試しても線虫がパッドに付着しない場合は、新しいパッドを使用するか、パッドのアガロースの厚みまたは濃度を上げてください。次に、ピペットを虫に挿入します。まず、ステージを移動させて虫をピペットの下に配置します。次に、ピペットを生殖腺の中央核の隣に配置します。細胞質が多くの生殖細胞核によって共有されているため、注入されたDNAが子孫に伝わる可能性が高まります。ピペットは線虫とほぼ平行に配置してください。次に、皮膚が陥没するまで、チップを体に向かって垂直

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

トランスジェニックを用いてアッセイするβ-アミロイドの毒性 C.エレガンスモデル

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この記事では、7点スコアリングシステムを使用して 、C.エレガンスにおけるドーパミン作動性ニューロンデンドライト形態の変化を一貫して定量化する方法を紹介します。このシステムは、神経変性疾患の遺伝的、化学的、および年齢ベースのモデルを利用したドーパミン作動性神経変性アッセイの分析を目的としています。...

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ポリグルタミン媒介性神経毒性に対する生理活性化合物を発見するためのモデルシステムとしてのCaenorhabditis elegans

線虫（Caenorhabditis elegans）における抗精神病薬（APDの）の影響をテストするためのアプローチが実証されています。アッセイを開発および生存に咽頭のポンピング速度に対する薬物の効果を試験するために記載されている。これらの方法は、APDの以外の薬剤クラスと薬理遺伝学的実験に適用可能である。...

抗精神病薬の作用のメカニズムを研究するための方法<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

学ぶアミロイドβ毒性の神経機能への影響をCaenorhabditis elegansモデルで評価する方法。化学走性アッセイと薬理学的アッセイを用いて神経変性のメカニズム解明に貢献します。

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