構造と機能研究のための脂質膜へのKvチャネルの再構築

この手順の全体的な目的は、膜タンパク質に対する脂質の影響を機能的および構造的に研究するための手法について詳細に説明することです。まず、電位依存性カリウムチャネルを発現および精製し、次にイオンチャネルの再構成を行います。

次に、イオンチャネルの機能研究のために、脂質二重層におけるイオンチャネルからの電気記録を行います。最終ステップは、構造決定のための膜中のイオンチャネルの結晶化です。最終的に、生化学的アッセイ、電気生理学的手法、および電子結晶学的研究を用いて、イオンチャネルの電圧センサーの動きに対する脂質の影響を調査します。

一般的に、この手法に初めて取り組む方は、タンパク質の再構成と生体記録における多くの技術的な詳細に苦労されることでしょう。この映像によるプロセスが、全手順を完遂し成功させるためのお役に立てれば幸いです。全手順のデモンストレーションは、私の研究室のDr.Hui Jimが行います。

脂質の調製に先立ち、14 mLの使い捨てガラス試験管、ねじ蓋付きガラス管、およびクロロホルムを満たした250 µLのガラスシリンジを用意します。次に、10 mLのクロロホルムを試験管に移します。POPEおよびPOPGリポソームを調製するには、クロロホルムに溶解した3.75 mgのPOPEと1.25 mgのPOPGをねじ蓋付きガラス管に移します。

クロロホルムが見えなくなったところで、アルゴンガスの連続気流下で脂質を乾燥させます。その後、室温の真空状態でさらに1時間乾燥させます。次に、乾燥させた脂質のボルテックスチューブに、440 µLの低塩緩衝液または水を加えます。

脂質を水和させるためのチューブです。脂質懸濁液は白濁して濁った状態になります。その後、ベシクル溶液が半透明になるまで、氷冷バス中で脂質懸濁液をソニケーションします。

次に、最終的な脂質懸濁液中の KCl 濃度が 300 mM、DM 濃度が 10 mM となるように、3 M KCl 50 µL と 0.5 M DM 10 µL を混合物に加えます。溶液をローテーターを用いて室温で 2 時間インキュベートし、脂質・界面活性剤混合ミセルを形成させます。インキュベーション後、界面活性剤によって小さな ELLA 小胞が融合するため、懸濁液はわずかに濁った状態になります。タンパク質濃度が 2 mg/mL 以上に濃縮されている場合は、記載された成分と脂質・界面活性剤混合物を加え、最終容量を 1 mL とします。

次に、ガラスチューブに入れたタンパク質・脂質・界面活性剤の混合物をローテーターでさらに2時間インキュベートします。界面活性剤で可溶化したDTaPまたはDOGSを含むKVAPの調製は、P-O-P-E-P-O-P-G小胞の脂質調製と同様です。ただし、水和した脂質を小さな単層小胞にするための超音波処理は、P-O-P-E-P-O-P-G脂質の場合よりも時間がかかります。DOGS小胞はゆっくりと互いに融合して小さな油滴を形成し、DTaPまたはDOGSを完全に可溶化させる場合があります。

超音波処理したベシクルを10 millimolarのDMおよび40 millimolarのbeta ogと混合します。この脂質・界面活性剤混合液を室温で一晩インキュベートします。このとき、混合液は十分に透明であり、微粒子や液滴が含まれていない必要があります。次に、KVAPタンパク質を、界面活性剤で可溶化したDTaPまたはDOGSと、タンパク質対脂質比が1:10以下となるように混合します。

タンパク質、界面活性剤、および脂質の混合液を、室温で2〜3時間、連続的にオービタル回転させながらインキュベートします。DMやBeta ogなどのCMCが比較的高い界面活性剤が緩徐に除去されることを実証するため、まず、混合液1 mLにつき2 Lの透析バッファーを準備します。

次に、適切な長さの透析チューブを切り出し、DI水で洗浄してチューブに漏れがないことを確認します。続いて、タンパク質・脂質・界面活性剤の混合液を透析チューブに注入します。溶液の上にほとんど隙間がない状態で、チューブの両端をクランプで固定します。

充填済みのチューブをダイアリシス緩衝液を満たしたスターラープレート上に置き、チューブが溶液中でゆっくりと回転するようにします。ダイアリシス緩衝液は8時間ごとに1回交換してください。次に、CMCの低い界面活性剤を除去するためのポリスチレンビーズを準備するため、まず乾燥ビーズ0.5 gを量り取ります。

その後、それらを50 mLのCorningチューブに入れ、20 mLのメタノールを加え、バスソニケーターで溶液を超音波処理します。気泡を取り除くため5分間ソニケーションを行い、その後、5,000 rpmで5分間スピンダウンしてビーズを沈殿させます。次いで、メタノールを完全にデカンテーションし、エタノールおよびMilli-Q水で洗浄を繰り返します。洗浄後のビーズは20%エタノール中で4°Cで保存し、使用前に界面活性剤を含まないバッファーに置換します。処理するタンパク質・脂質・界面活性剤混合物中の界面活性剤量を推定し、界面活性剤を除去するために必要なビーズ量を算出します。

余分な水を取り除いた状態で湿ったビーズを計量し、タンパク質混合液に直接加え、ビーズが十分に作用するまで少なくとも15〜20分間待機します。1 mLの溶液中から8.7 mgのDDMを除去する場合、Bio-Beads SM-2などのポリスチレンビーズを合計87 mg用意し、これを5等分します。タンパク質・脂質・界面活性剤の混合液を各分画と混ぜ合わせ、室温で一定速度のエンドオーバーエンド回転を用いて20〜30分間混合します。

ビーズを遠心分離し、上清を次のビーズ分画へと移し、最後までこれを繰り返します。このステップでは、まずクロロホルムを用いて、ガラス試験管、テフロン加工のスクリューキャップ付きアンバーバイアル、およびガラス製シリンジ一式を洗浄します。その後、アルゴンガス気流下でアンバーバイアルを乾燥させます。

次に、0.75 milligramsのPOPEと0.25 milligramsのPOPGをクロロフォームに溶解させてアンバーバイアルに移し、アルゴンガスを用いてクロロフォームを蒸発させます。その後、0.2 millilitersのペンタンをバイアルに加えて乾燥した脂質を溶解させ、完全に乾燥させて残留クロロフォームを除去します。次いで、50 microlitersのデカンをバイアルに加えて、乾燥した脂質を溶解させます。

次に、脂質溶液が穴に入らないように注意しながら、バイレイヤーカップの円筒面にある丸い穴の周囲に脂質を塗布します。デカネールが完全に蒸発し、脂質二重層中のKVAPチャネルの電気記録が行えるようになるまで、1〜2分間待ちます。カップを記録室に挿入し、ソルトブリッジを設置して、電極を記録カップの両側に接続します。

シスト溶液を電極孔に、CYS溶液およびtrans溶液をチャンバーの内側および外側のカップに添加します。次に、カップの両側間の電位オフセットを2 mV未満に調整し、キャップの孔に脂質を塗布します。膜が薄くなり、相対的に安定するまで待ちます。

膜が安定し次第、P2ピペットチップの先端を穴の直上に配置し、小胞を含むチャネル液を0.5〜1 µL注入します。小胞は穴を通り、カップの底へと落下します。

バイレイヤー中のKVAPチャネルをテストします。速い不活性化と活性化からの緩やかな回復があるため、保持電位-80 mVから80 mVの短パルスを印加します。2つのパルスの間には、PEPG膜中のチャネルの場合、約120秒の長い間隔を設けます。電流値が適切になったら、低濃度側の溶液にイオン塩を追加し、膜の両側の溶液におけるイオン濃度を平衡化させます。

こちらは、結晶最適化の途中で得られた、ネガティブ染色した2D結晶の画像です。糖分によって結晶同士が凝集することがあるため、結晶は6% ammonium moate (pH 6.4) および 0.5% triose で染色されました。ここにある黒い正方形の枠は、回折スポットを伴う回折パターンを生じさせる領域を示しています。

約20 Åの分解能において、前述のものと同様の試料から得られた2D結晶のクライオ電子顕微鏡（cryo EM）画像がここに示されています。試料に3% TLOsを混合し、直接プランジング法により凍結させ、50,000倍の倍率でクライオ電子顕微鏡を用いて観察しました。結晶パッキングに局所的な欠陥があることが明確に見て取れます。

さらに最適化した結晶の別のクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）画像です。試料は0.75%タンニンと10% tree hellosに包埋され、倍率50,000倍で撮影されました。密なパッキングに見られる直線は、この種の結晶においてチャネルが高度に整列していることを示唆しており、2本の黒い矢印は正方形ベクトルを示しています。

このビデオを視聴することで、脂質とタンパク質の適切な取り扱い方法について十分に理解し、膜における脂質とタンパク質の相互作用の研究をより効率的に進めることができるようになることを願っています。