赤外線神経刺激のメカニズムを調査するための全細胞パッチクランプ

次の実験の全体的な目標は、in vitroで聴覚ニューロンに対する赤外線レーザー照射の影響を研究するためのモデルシステムを作成することです。これは、パッチクランプ、全細胞構成の培養聴覚ニューロンによって達成され、それらの電気的特性を探求します。その後、ニューロンをレーザー照射にさらすと、ばく露した細胞内で電気的応答が引き起こされ、パッチクランプセットアップで測定できます。

その後、照明パラメータと環境変数を変化させて、レーザー誘起電気応答への影響を観察することができます。レーザー光にさらされた聴覚ニューロンは、後で分析するために、各レーザーパルスに応答して再現性のある電気的活動を示します。この方法は、らせん神経節ニューロンの赤外線刺激の根底にあるメカニズムに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。

この方法は、特に螺旋神経節細胞の赤外線刺激に関する洞察を提供することができますが、他の細胞タイプや脂質二重膜などの簡略化されたモデルに拡張して、関与する物理的プロセスをさらに解明することもできます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、光伝送光ファイバの正確な位置決めを確保するために重要であり、結果として生じる放射輝度露光が重要なパラメータであるため、2〜6メガオームの抵抗を持つ記録マイクロピペットを準備しています。それらは、CO2レーザープーラーで借りたケイ酸塩ガラスから引き出すことができます。

ファイバー結合レーザーを準備します。さまざまな光ファイバーが機能します。FCPCコネクタを備えたパッチコード構成のファイバーを半分に切断すると、一方の端にコネクタがあり、もう一方の端に露出したファイバーを備えた2つのファイバーリンクが生成されます。

これらはおさげ髪です。片方のピグテールのクマの先端を、ファイバージャケットを取り外し、エタノールで洗浄し、顕微鏡下で適切な工具で切断して準備します。先端が繊維軸に対して垂直であり、平らに見えることを確認します。

必要に応じて、適切なスルーコネクタを使用して、ファイバーピグテールのもう一方の端を刺激レーザーの出力に接続します。この時点で、常にファイバーからの出力レーザー出力を測定するようにしてください。これは、さらにチップを操作した後でも行ってください。

次に、ファイバーをチャックに挿入し、チャックを適切なマイクロポジショナーに固定します。次に、カバースリップで光ファイバーが作る角度を決定します。配置の写真を撮り、画像J.Nowを使用して角度を計算します J.次に、レーザーをパッチクランプデータ収集システムに同期させる接続を固定します。

パッチクランプデータ収集システムからのデジタル出力は、外部機能発生器を介してレーザーに接続されるべきであり、データ収集システムとは無関係にレーザーパルスパラメータを指定することが可能であり、レーザーをトリガーするために使用される信号は、レーザーパルスのタイミングと長さが電気生理学的信号と同時に記録できることを確保するために、データ収集システムの入力に再び接続する必要があります。 灌流システムの流量を毎分1〜2ミリリットルに設定します。溶液を急速に加熱するためのインラインヒーターと、吸引によって使用済み溶液を除去する蠕動ポンプを備えた重力供給システムが機能します。まぁ。培養細胞を入れたカバースリップを高倍率の水浸対物レンズと位相コントラストを用いて正立顕微鏡の記録室にセットし、らせん状神経節ニューロンを同定します。

典型的ならせん状神経節ニューロンは、直径約15ミクロンの明るい丸みを帯びた位相で、目立つ核を持っています。適切なニューロンが見つかったら、低倍率の対物レンズに切り替えて、ターゲットニューロンを見つけます。次に、マイクロポジショナーを使用して、先端が水平面と垂直面の両方でターゲットニューロンに近づくまで光ファイバーを動かします。

高倍率対物レンズに切り替えて、光ファイバーの先端をニューロンの隣の意図した位置に配置します。繊維の垂直位置を調整するときは、繊維の下端をカバーリップに乗せることが重要です。ファイバーの位置の不確かさを最小限に抑えるために、顕微鏡画像の視覚的な手がかりから接触点を特定できます。

ファイバーが所定の位置に配置されたら、マイクロピペットの位置決めに影響を与えないように、ファイバーを縦軸に沿って既知の量だけ移動させます。マイクロピペットには細胞内溶液を充填し、アンプのヘッドステージにしっかりと固定する必要があります。マイクロ電極ホルダーの側面に取り付けられたチューブを使用して、マイクロピペットの目詰まりを防ぐために少量の正圧を加えます。

マイクロマニピュレータを使用して、マイクロピペットをターゲットニューロンのすぐ上の位置に移動し、ギガオームシールの作成を進めます。電流に近似した指数曲線から決定された膜容量の系列抵抗と入力抵抗を記録します。シールテストパルス中。

アンプのCP高速制御とCP低速制御を調整することにより、容量過渡を最小限に抑えます。次に、アンプを全セルモードに切り替え、SEALテスト中にフラット電流が観察されるまで、静電容量と抵抗補償を変更します。次に、約70%の補正、70%の予測で直列抵抗補償を適用し、静電容量と抵抗補償制御を調整して、フラットなテストシール応答を維持します。

次に、アンプを電流クランプモードに切り替えます。電流注入がない場合の静止膜電位に注意してください。次に、膜電位を目的のレベルに安定させるために、保持電流を設定します。

ピペットの静電容量を中和し、ブリッジのバランスを調整して電圧降下のバランスを取ります。脱分極電流で刺激することにより、ニューロンの発火特性を確認します。この時点で、CCDカメラと組み合わせたイメージングソフトウェアを使用して、光ファイバーをニューロンの隣の位置に戻します。最初にニューロンの平面に焦点を合わせ、次に光ファイバーの上端に焦点を合わせた画像をキャプチャします。

画像を解析して、ターゲットニューロンの中心に対する光ファイバーの上端の位置であるデルタ値を決定します。光ファイバーの位置を正確に知ることは非常に重要です。これは、標的細胞に供給される単位、面積、または放射輝度曝露あたりのエネルギーが赤外線神経刺激の重要なパラメータであり、これは細胞に対するファイバーの位置によって大きく影響を受ける可能性があるためです。

このレーザーは、光パワーはレーザーへの直接入力を介してコンピュータによって制御され、各記録の前に手動で指定することができます。パルス長と繰り返し速度は、前述のように関数発生器を介して制御でき、パッチクランプチャネルとレーザートリガーチャネルの両方からデータが0.25〜5ミリ秒で1/2〜15ミリ秒のレーザーパルスで記録されていることを確認してください。ミリジュールは通常、測定可能な電気的応答をもたらします。最初。

レーザーパルスの繰り返し周波数を1ヘルツ以下に設定すると、望ましくない影響を最小限に抑えることができる場合があります。すべてのレーザーパラメータが設定されたら。データ収集を続行します。

螺旋状神経節ニューロンは、電圧クランプと電流クランプの両方で再現性のある波形でレーザー照明に応答します 2.5ミリ秒の0.8ミリジュールレーザーパルスに応答する記録構成。典型的なセルは、さまざまな保持電位で正味の内向き電流を生成します。電流クランプ記録は、これらのレーザーパルスの過程で安定した膜脱分極を示し、その後、パルス後の静止膜電位に向かって約指数関数的に減少します。

場合によっては、レーザーパルスの後に小さな追加の膜脱分極もあります。過度のエネルギーで照らしたり、温度の大幅な上昇にさらされたりすると、細胞の電気的特性の悪化や細胞死の瞬間的な損傷が観察される可能性があります。この手順に従うことにより、溶液温度や化学的要因などのさまざまな環境パラメータを変更して、レーザー誘起電気活動に対するこれらの影響をテストできます。

レーザーでの作業は危険であり、標準的な安全対策を講じる必要があることを忘れないでください。これには、レーザー安全ゴーグルの使用、警告サインの使用、ビームが意図せずに反射率の高い表面と交差しないようにすることが含まれます。