Name: 赤外線神経刺激のメカニズムを調査するための全細胞パッチクランプ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学ぶ全細胞パッチクランプ法を用いた赤外線レーザー刺激が聴覚ニューロンに与える電気応答のメカニズム。この手法は神経生理学と聴覚系研究の発展に貢献します。

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1。らせん神経節ニューロンの文化<ol><li>オートクレーブ内の小さな丸い（ 例えば直径10mm）カバーガラスと湾曲鉗子を滅菌。滅菌ピンセットを用いて、滅菌4リング35ミリメートルペトリ皿または4ウェルプレートの各ウェルに滅菌カバースリップを転送します。最大48時間までのためのインキュベーター（37℃）でカバースリップと場所の上面にポリ-L-オルニチン（500μgの/ ml）とマウスラミニン（0.01 mg / ml）で150μlのを適用します。カバースリップは井戸の底から離れて浮いていないことを確認してください。 </li><li> 47.5ミリリットル神経細胞用基礎、0.5ミリリットルN 2サプリメント、1ミリリットルB27サプリメント、0.5ミリリットルのL-グルタミン、および0.5 mlのペニシリン-ストレプトマイシン：各神経培養用の50ミリリットル滅菌神経細胞用基礎培地（NBM）を準備。注：サプリメントが凍結することができ、-20℃で保存し、必要な日に培地に添加。 </li><li> 、前述の20,21として産後4-7日のラットの仔から私たちをらせん神経節ニューロンを解離（0.025％トリプシンおよび0.001％DNアーゼI）酵素的および機械的なテクニックの両方をING。 Whitlon ら 22とビエラら 23を参照してください。 らせん神経節ニューロンの文化の詳細な手順については、またはパーカーら 24蝸牛軸分離のデモンストレーションのために。 </li><li>カバースリップから残っpoly-L-ornithine/laminin液を吸引し、NBMと簡潔に洗う。 </li><li>インキュベーター（37℃、10％CO 2）にカバースリップと場所に解離らせん神経節ニューロンの懸濁液150-200μLを加える。注意：最大20カバーガラスには、8仔ラットの平均リターから調製することができる。 </li><li>メッキニューロン4時間後には、細胞の破片を除去し、150から200μlを温め新鮮NBMと交換するための解決策を吸引。注：メディアは脱水症状を避けるために、毎日の補充が必要な場合があります。 </li><li>電気生理学的記録のために必要になるまでインキュベーターにカバースリップを返します。注：解離スパイラル神経節ニューロン培養物を4時間解離した後、二日後までのための電気生理学的実験のために使用することができる。 in vitroでの時間は、結果の分析時に考慮されるべきである。毎年24〜48時間をNBM補充。 </li></ol> 2。パッチクランプ記録のための準備<ol><li>溶液を調製<ol><li>細胞内（マイクロピペット）ソリューション：115 mMのK-グルコン酸、7のKCl、10mMのHEPES、0.05 mMのEGTA、2mMのの Na 2 ATP、2mMのMgATP、0.5mMのの Na 2 GTP（KOHでpH 7.3に調整し、295に合わせて調整ショ糖とミリオスモル/ kg）を。無菌フィルター（0.2ミクロン）を通してソリューションをパスし、記録の日まで-20℃で保存されるように200μlのアリコートに分ける。 </li><li>外（風呂）ソリューション：137のNaCl、5 mMの塩化カリウム、2mMのCaCl 2を、1のMgCl 2、10mMのHEPES、10 mMグルコース（NaOHでpH7.4に調整し、ショ糖と300から310ミリオスモル/ kgの調整） 。この溶液は、記録日に行われる。 </li></ol></li><li> MΩ2-6の抵抗で記録マイクロピペットを準備します。とホウケイ酸ガラス（1.0ミリメートル外径、0.58ミリメートル、内径、75ミリメートル長さ）、我々は、CO 2レーザープラー（サターインスツルメンツP-2000）を使用します。 </li><li>レーザーを準備します。このプロトコルは、オプトテックP / Lからそのような1870 nmの赤外線神経刺激としてファイバ結合レーザを使用するためのものです我々の実験では、光配信に使用される光ファイバの両端（AFWテクノロジーズMM1-FC2-200/220-5-Cで0.22の開口数で220分の200μmのコア/クラッド径シリカ繊維およびFC-PCコネクタです-0.22）。パッチコードは、2つのファイバピグテール（ すなわち一端にコネクタ接続や他で切断）を生成するために半分にカットされた。 Thompson らにより詳細に検討されたレーザ誘起温度変化のファイバーコア径と開口数の影響図25 <ol><li>劈開標準的な技術を用いた光伝送ファイバの先端と結果の先端が光学顕微鏡（ すなわち先端が繊維軸に垂直で、ビジュアル検査時にフラットに表示されます）で観察することにより、高品質であることを確認してください。コネクタ（ 例えばソーラボADAFC2）を通じて適切なを使用して刺激レーザーのファイバー結合出力に光配信ファイバーを接続します。 </li><li>適切な楽器（LM-3検出ヘッドと例えばコヒーレントFieldMateの）を使用して、光送達繊維の切断された先端から出力レーザパワーを測定します。これは、レーザパワーの光送達ファイバが切断されたり、かなりの調整が（ 例えば 、1研究室から別の輸送）レーザーに対して行われるたびにチェックすることをお勧めします。 </li><li>ファイバーチャックまたは同等のデバイスと貼る適切なマイクロポジショナーにチャックに光配信ファイバーを挿入します。正確には光ファイバがカバースリップとなす角度θを決定できることが重要である。このANGLeは実験装置の写真を撮影し、角度を得るために、画像処理ソフトウェア（ 例えば、ImageJの）を用いて測定することができる。特に顕微鏡 - 角度θ（または可能な角度の範囲）は、主に実験装置の空間的な限界によって制約されます。我々の実験ではθの典型的な値は、（正立顕微鏡に基づいて）36°の周り、しかし最適な角度（倒立顕微鏡を用いたものなど ）別のセットアップのために大きく異なる場合があります。 </li><li>レーザおよび図2に示すように、パッチクランプデータ取得システム（ 例えば Digidata 1440A、Molecular Devices社）との間の接続を行う。パッチクランプデータ収集システムからのデジタル出力は、それが可能なデータ収集システムの独立したレーザパルスパラメータを指定すること、外部ファンクション·ジェネレータを介してレーザに接続されるべきである。あるいは、この出力は、直接接続することができレーザドライバ（パルス長とデータ収集ソフトウェアによって設定される繰り返し率を必要とする）。いずれの場合も、レーザをトリガするために使用される信号は、レーザパルスのタイミング及び長さを電気生理学的信号を同時に記録することができることを保証するためにデータ収集システムの入力に接続する必要があります。 </li></ol></li></ol> 3。 INSの調査のためのパッチクランプ記録<ol><li>細胞外溶液で灌流システムの適切な容器を充填1〜2 ml /分の速度で浴の灌流を提供するために、流量を調整。我々は解決策の急速加熱、吸引によって使用済み溶液を除去するための蠕動ポンプを有効にするには、インラインヒーターで重力供給システム（アスピレーターボトル、ピンチバルブ、およびPE管）を使用します。 </li><li>正立顕微鏡の記録室（風呂）に培養細胞を用いたカバースリップを置きます。高倍率の水浸対物レンズ（Eを使用するg。40X）と位相差（ 例えば微分干渉コントラストやDodtグラデーションコントラスト）、視覚文化の中でらせん神経節ニューロンを見つけます。 図1aに示すように、典型的ならせん神経節ニューロンは、位相明るいラウンドと著名な核を持つ直径約15μmである。 </li><li>ニューロンが配置されると、低倍率の対物レンズ（ 例えば 10倍）に切り替えて、視野内のターゲットニューロンを見つけます。 </li><li>次の手順を実行し（または同等）を使用して、所定の位置に光送達光ファイバを移動： <ol><li>先端が水平方向と垂直面の両方でターゲットニューロンに近くなるまで、出力ファイバを移動するマイクロポジショナーを使用します。ファイバーチップの垂直位置は、対物レンズを上下に移動（フォーカス走査）によって確認することができる。 </li><li>高倍率の対物レンズに戻り、Tの隣の意図された位置での光ファイバの先端を位置付ける彼ニューロン（ 図2挿入図参照）。繊維の垂直位置を調整するときに、それが繊維の下端は、繊維の位置の不確実性を最小化するために、カバースリップ（ すなわち、ちょうど触れる）上に載っていることが重要である。水平面内で最適なアライメントは繊維がカバースリップおよび繊維半径rとなす角度θに依存します。ターゲットニューロンの中心が繊維軸に沿って位置するようにファイバを位置決めするために、繊維の上縁と標的細胞との間の水平距離がなければならない Δ ターゲット = R（cosecθ - 2罪θ）、 どこに負の値は、光ファイバ張り出しセルことを示すことになる。ファイバを整列するとき、繊維の上端からニューロンの中心との間のΔ ターゲットの距離は約目視検査によって達成することができる。しかしΔ ターゲットはするように設計されて唯一の大まかなガイドラインとしての役割を果たす。繊維の上端とニューロンの中心間の実際の距離ΔはΔ ターゲット （ 図1のように）から測定可能とは異なるような繊維を配置することの中心から両方の半径方向変位（ すなわちの効果への洞察を提供することができますターゲットニューロンに対する相対光のビーム）と軸方向変位（繊維軸に沿って、すなわち ）。典型的なマルチモードファイバのビームプロファイルを良くトップハット分布26、局所的に吸収されるエネルギー（温度）の低下によって近似されるため、 すなわち、 -例えば、Δ設定≈0は、セルの近傍の局所温度を上昇させることが期待されるビームの中心からずれによる、セルに近いファイバ端面を移動させるから吸収されたエネルギーの増加に比べて最小である。 注意は、正確かつ反復可能POなどの繊維を配置するために取られるべきであるが視覚的な手がかり、ターゲットニューロン（ 例えば Δ）に対してファイバー位置の正確な測定を使用してssibleは、所定の距離離れてそれを配置するよりも重要である。プロトコールのステップ3.8.2で説明したようにΔは、画像解析によって（±3μmの推定最大不確実性）を決定することができる。いくつかの実験5,8においては、白色光源は、所望の細胞を標的とするために、ファイバを介して接続されている。このアプローチは、標的領域からの散乱光の強度は、これらの浅い角度（θ）で相対的に低かったように、正立顕微鏡の設定で効果がないことが判明した。 </li><li>繊維が所定の位置になったら、マイクロピペットの簡単なポジショニングを可能にするために既知の量でそれを外に移動。繊維は、その後ニューラル記録が達成される元の位置に戻すことができる。 </li></ol></li><li>細胞内液でマイクロピペットを記入し、しっかりと頭の上に、所定の位置に収まるアンプの田下（ 例えば Multiclamp 700B、Molecular Devices社）。微小電極ホルダーの側に取り付けられたチューブを使用して、マイクロピペットの詰まりを防止するために、正圧の少量を適用する。 </li><li>マイクロマニピュレータを使用して、単にターゲットニューロン上の位置にマイクロピペットを移動します。 </li><li>全細胞記録のためのプロトコル： <ol><li> 10ミリ秒、アンプの電圧クランプモードで+10 mVの方形波パルス（ 例えばシールテスト）を適用し、0 nAのにベースライン信号のマイクロピペット電位（ピペットオフセット）を調整します。シールテストは、微小電極の抵抗値が所望の範囲（ - MΩ6 例 2）内にあるかどうかを決定するために使用されるべきである。 </li><li>抵抗を監視しながら、静かにターゲットニューロンの表面にマイクロピペットを配置するマイクロマニピュレータの微調整を使用しています。マイクロピペットのニューロンに接触しているときに、抵抗（MΩ〜0.5〜1による）増加する。私mmediately抵抗増加に続いて、正の流体圧力を取り除き、小さな負圧を適用する。一度抵抗が10に合格しています- 20MΩ、保持レベル（-60 mVの周りなど ）に膜電位固定してください。 </li><li>電極抵抗は、効果的なシールが（ &#39;ギガシール&#39;と呼ばれる）は、細胞膜とマイクロピペットとの間に形成されていることを示す、1GΩを超えるまで増加し続けなければならない。この時点で、マイクロピペットからすべての流体圧力を取り除く。 </li><li>ギガシールが形成された後、短い電流パルス（25〜100マイクロ秒、+1 V）を使用するか、または破壊細胞膜に負の流体圧の簡単なパルスを、全セル構成を実現する。 </li><li>膜容量、直列抵抗とシールテストパルス中の電流に取り付けられた指数曲線から決定された入力抵抗を記録する。その後、スイッチポートと、アンプのCpFastとCpSlowコントロールを調整することにより、静電容量のトランジェントを最小化hは全細胞モードにアンプ、フラット現在までの容量や抵抗を補償は、シール試験中に観測される。フラット試験シール応答を維持するために容量や抵抗制御を調整する。直列抵抗補償（70％〜70％予測補正）を適用する。 </li><li>アンプに電流クランプモードに切り替えます。静止膜電位（電流注入がない場合）に注意してください。希望のレベル（ 例えば -60 mVの）で膜電位を安定させる保持電流を設定します。ピペット容量を中和し、電圧降下のバランスをとるために、ブリッジバランスを調整する。 </li><li> （; 300ミリ秒持続+10 pAのステップで10から200 Pa）の現在の脱分極で刺激することによって、ニューロンの発火特性を確認してください。 </li></ol></li><li><ol><li>ニューロンの隣の位置に光ファイババックを移動します。 CCDカメラに結合されたイメージングソフトウェアを使用して、ターゲット神経に対する繊維の位置の画像をキャプチャnは、最初にニューロンの面に焦点を当て、その後、光ファイバの上端にある（ 図1を参照）。 </li><li>得られた画像のその後の分析（ 例えば、 図1bおよび図1c）によってそれを正確Δ（目標ニューロンの中心に光ファイバ相対の上縁の位置）を決定することができる。一度Δが知られている、そのようなファイバ端面からターゲットニューロン（繊維軸に沿って）z及びビームδrの中心からのニューロンの半径方向変位との距離などのパラメータは、単純な三角法関係を用いて計算することができる。 Z = R罪2θ+ΔCOSθ δ はr =（（R COS2θ - Δ罪θ）2 +ΔY2）1/2、 ΔYがファイバ軸と上方から見たニューロンの中心との間の距離である（ 例えば、それ自体eは図1）。 これらの位置パラメータの正確な知識が刺激プロセス25の間で可能な違いを解決するために必要になることがありますように分析は、細胞から細胞へのアカウントの位置のばらつきを考慮すべきである。 </li></ol></li></ol> 4。 INS実験<ol><li>電流クランプまたは電圧クランプ構成のいずれかで電気生理学的データを記録しながら、必要なパラメータ（ 例えば電力、パルス長、繰り返し率など）で刺激レーザーを実行します。我々のレーザで、光パワーは、レーザドライバへの直接入力を介して制御され、各記録前に手動で指定されている。パルス長及び繰り返し率は、外部信号発生器またはデータ収集ソフト（ステップ2.3.4を参照）のいずれかによって制御することができる。データはパッチクランプチャンネルとレーザートリガチャンネルの両方から記録されていることを確認します。 </li></ol>及ぶ長さのレーザーパルス周りに500マイクロ秒〜15ミリ秒、パルス当たり約0.25から5 mJののエネルギーから、一般的に測定可能な電気的な応答が得られます。それは、このパラメータの影響を最小限にするため、1ヘルツ以下となるようにレーザパルスの繰り返し率を設定すると、最初の実験のために有用であり得る。記録された信号の変化を示す典型的な結果は、次の節に示されている。

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<li>Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+temperature+jump+by+infrared+diode+laser+irradiation+for+patch-clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies.</a> Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).</li>
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著者らは、開示することは何もありません。

本論文で概説プロトコルを使用すると、それは抽出して文化らせん神経節ニューロンと全細胞パッチクランプ実験を行うことにより、レーザー誘発電気的活動を調査することが可能である。 インビトロで使用される場合、パッチクランプ法は、 インビボでは達成できない実験パラメータの制御のレベルを提供する。このような波長、パルスエネルギー、パルス長、パルス形状、及びパルス反復配列としてのレーザ刺激パラメータは、再現可能な設定で研究することができる。加えて、神経細胞が維持されている環境（ 例えば、溶液温度、化学的因子）は系統的ことで膜特性、したがって赤外線神経刺激のメカニズムを研究すること、変えることができる。電気および光刺激モダリティ間の相互作用はまた、制御された方法で調査することができる。これらの基本的な研究は、フロリダ州を導入することにより、さらに高度なことができますそのようなイオンの濃度又は熱ショックタンパク質の発現などの追加のパラメータを監視するuorescentプローブ。これらの種々のパラメータの明確な理解は、現象の完全な理解を達成するだけでなく、プロセスの最適化を介して、より効率的な刺激を達成...

神経生理学や医療バイオニクスの分野では、神経組織の電気応答の制御可能な刺激を可能な技術に大きく依存しています。電気刺激は、神経興奮で金本位まま神経応答、および組織1を取り巻くへの電流の広がりに起因する刺激の特異性の欠如を記録するとき、そのような刺激アーチファクトの存在など多くの欠点に悩まされる。 最後の二十年は、光学的に媒介刺激技術の開発2を見てきました。これらの技術のいくつかは、どちらも、いずれかの特定の分子を添加する（ 例えば、ケージ分子）3または遺伝子操作（ 例えば、光遺伝学）4のいくつかのフォームを、標的組織の変更を必要とする研究の設定の外側に適用することが容易である。特に興味深いのは、そのため赤外線神経刺激（INS）、wherebですyは神経組織、パルス赤外レ​​ーザ光により励起される。 INSは、神経組織2の高度に特異的な、非接触刺激を可能にすることで、電気刺激の欠点の多くを克服する可能性を秘めている。 INSが正常にin vivoでのさまざまな設定で実証されているがしかし、励起の正確なメカニズムは不明である。 最近の出版物は5-7 INSのメカニズムを解明に向けた進展を示している。水によるレーザ光の吸収による急速加熱が重要な役割を果たすと思われる。しかし、これを超えてコンセンサスがまだ到達しなければならない。シャピロら 7は、急速加熱が、細胞膜およびその後の脱分極の静電容量の変化をもたらす、細胞膜に隣接する荷電粒子の分布の摂動を引き起こすことにより、非常に一般的なメカニズムを提案する。また、アルバートら 5はそのLASE ​​を主張rを誘発加熱イオンが細胞膜を通過させ、温度感受性イオンチャネル（一過性受容体電位バニロイドチャネル）の特定のクラスを活性化する。この段階では、これらのメカニズムはまだ同定されている更なる要素があるかどうかを実際に組み合わせる、またはどのように不明である。 出版物の少数の（参考文献5,7-9） インビトロで INSを調査してきたが、この分野で公開され、作業の大部分は（ 例えば、参照1,6,10-18） インビボで行われている。聴覚ニューロンの赤外線刺激は人工内耳10,14-18の潜在的なアプリケーションに起因し、特に関心のある領域、となっています。 in vivoでの実験では様々な設定での技術、 試験管内試験ではによって与えられる制御の増加レベルメカのより詳細な理解につながることが期待されての有効性を検証することが重要である一方INSの責任anism。このレポートには、これらも聴覚系から既存データの大本体に連結しながら基本的なメカニズムを研究するために使用することができるように、パッチクランプ調査培養らせん神経節ニューロンの調製を記載する。 パッチクランプ法は、単一細胞における電気的活動を記録する手段を提供し、個々の基礎となる電流19の寄与を研究し、電気生理学的現象の調査のための優れたツールである。この技術は、例えば培養された螺旋神経節ニューロンの一次ニューロンのin vitroにおける安定調製に適用される場合には、深さが神経活性が制御され、操作されるメカニズムを研究する機会を提供する。 パッチクランプを通してらせん神経節ニューロンの電気的特性に及ぼすレーザー刺激の効果を調査するため、この作業のアウトライン法で指定されたプロトコルレコーディング。アプローチは、標準的な顕微鏡の構成を変更することなく安全な操作だけでなく、より簡単かつ再現性の配向を可能にする、ファイバ結合レーザではなく、自由空間レーザに基づいている。これらのプロトコルに基づいて、それがより明確にINSのメカニズムまたは機構を決定するために実験の広い範囲を行うことが可能であるべきである。

<table><tr><tbody><td colspan="4">細胞培養材料および機器</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップLomb</td><td>Scientific</td><td>CSC 10 1 GP</td><td></td></tr><tr><td>4リング細胞培養皿 </td><td>VWRインターナショナル</td><td>82050-542</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-オルニチン溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>湾曲鉗子</td><td>WPI</td><td>14101</td><td>Dumont #5 ピンセット (45°C; 角度先端)</td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td>ThermoScientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Table 1.細胞培養材料および機器.</td></tr><tr><td colspan="4">Neurobasal media</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>N-2 supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 serum-free supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>細胞内溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコン酸カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>LabServ</td><td>BSPPL738.500</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">細胞外液</強> </td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>310166</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>383147</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>LabServ</td><td>BSPSL740.500</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">表 2.細胞培養およびパッチクランプ用溶液. a) 神経基礎培地。b)細胞内溶液。c)細胞外溶液。</td></tr><tr><td>正立顕微鏡</td><td>ツァイ</td><td>ス AxioExaminerD1</td><td>ドッドコントラスト搭載 </td></tr><tr><td>水浸対物レンズ</td><td>ツァイス</td><td>W プラン-アポクロマート 40x/0.75</td><td></td></tr><tr><td>プラットフォームとX-Yステージ </td><td>ThorLabs</td><td>バーレー ジブラルタル</td><td></td></tr><tr><td>記録室</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>RC-26G</td><td></td></tr><tr><td>防振台</td><td>TMC</td><td>Micro-g 63-532</td><td></td></tr><tr><td>CCDカメラ</td><td>診断機器</td><td>RT1200</td><td></td></tr><tr><td>カメラソフトウェア</td><td>診断機器</td><td>SPOT 基本</td><td></td></tr><tr><td>インラインソリューションヒーター</td><td>ワーナー</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>温度調節器</td><td>ワーナー</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>パッチクランプアンプ</td><td>モレキュラーデバイス</td><td>マルチクランプ 700B</td><td></td></tr><tr><td>パッチクランプデータ取り込みシステム</td><td>モレキュラーデバイス</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-325</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットガラス</td><td>Sutter Instruments</td><td>GBF100-58-15</td><td>フィラメント付きホウケイ酸ガラス</td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Recording Software</td><td>AxoGraph</td><td></td><td>Lab pack and電気生理学ツール</td></tr><tr><td>アスピレーターボトル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS12201L</td><td>1 L Pyrex アスピレーターボトル、チューブ用アウトレット付き</td></tr><tr><td>PE チューブ</td><td>ハーバード</td><td>PolyE #340</td><td></td></tr><tr><td>マスターフレックス 蠕動ポンプ</td><td>コールパーマー</td><td>HV-07554-85</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">表 3.パッチクランプ装置.</td></tr><tr><td>1,870 nm レーザーダイオード</td><td>オプトテック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200/220 &MU;m径マルチモード光ファイバーパッチコード(FC / PC)</td><td>AFW</td><td>テクノロジーMM1-FC2-200 / 220-5-C-0.22</td><td>光伝送光ファイバー、シリカコアおよびクラッディング、0.22 NA</td></tr><tr><td>光ファイバースルーコネクタ(FC / PC)</td><td>Thorlabs</td><td>ADAFC2</td><td></td></tr><tr><td>光ファイバークリー</td><td>バーEREM</td><td>FO1</td><td></td></tr>光ファイバー<tr><td>ストリッピングツール(0.25-0.6 mm)</td><td>シーメン</td><td></td>ス <td>光ファイバージャケットの取り外し用</td></tr><tr><td>光ファイバーストリッピングツール(0.6-1.0 mm)</td><td>シーメン</td><td></td>ス <td>パッチコードの外側コーティングを除去するため</td></tr><tr><td>信号発生器</td><td></td><td></td><td>必要なパルス形状を出力でき、外部からトリガーされる可能性のある任意の信号発生器</td></tr><tr><td>光ファイバーポジショナー</td><td></td><td></td><td>カスタムメイドのポジショナー。パッチクランプ実験に使用される標準的なマイクロポジショナーで代用できます</td></tr><tr><td>光ファイバーチャック</td><td>ニューポート</td><td>FPH-DJ</td><td></td></tr><tr><td>レーザーパワーメーターと検出器ヘッド</td><td>Coherent</td><td>FieldMate (パワーメーター) LM-3 (検出器ヘッド)</td><td></td><</tr><tr>td colspan="4">Table 4.レーザー機器.</強力></td></tr></tbody></table>

赤外線神経刺激のメカニズムを調査するための全細胞パッチクランプ

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

なお、パルス、赤外レーザ光が標的組織の更なる変形例の独立した神経組織の電気応答を誘発するために使用することができる近年では実証されている。赤外線神経刺激は、聴覚神経の神経細胞の刺激に示される特定の関心と、in vivoで末梢および感覚神経組織の様々報告されている。 INSは、これらの設定で動作するように示されているがしかし、赤外光は、神経興奮を引き起こすする機構（または機構）は、現在よく理解されていない。ここで紹介するプロトコルは、初代培養ニューロンにおける聴覚赤外線神経刺激の調査を容易にするように設計された全細胞パッチクランプ法が記載されている。十分に制御された条件下でin vitroでの赤外レーザ照射に対するこれらの細胞の応答を特徴付けることで、基本的な物理学会の改善された理解を得ることも可能であるlおよび生化学的プロセスは、赤外線神経刺激の基礎となる。

らせん神経節ニューロンは、電圧クランプと電流クランプ記録構成の両方で再現性のある波形のレーザー照射に応答します。 図3aは、2.5ミリ、0.8 mJのレーザーパルス（6から平均応答に応じて、細胞膜を横切る電流の流れの典型的な変化を示している-70 mVで、-60 mVで、-50 mVで開催された膜電位と1秒間隔で繰り返しレーザーパルス、）。ネット内向き電流が一貫した照明が停止した後に初期値に戻って、レーザパルスに応答して誘発される。レーザー誘起電流の形状は、それがINSの基礎となるプロセスの完全な理解を得るために、保持電位の範囲で実験を行うことが重要であり得ることを示す、膜電位を変化させて変化させることが分かる。これらの実験は、現在のプロトコルのマイナーな変更を加えて実施し、例えば、電荷電圧（QV）分析（それ自体として確立された技術を用いて分析することができるin vitroでの INSから得QV曲線の例については、電子文献7）。 図3bに示されたデータは、典型的には2.5...

赤外線神経刺激は、聴覚系に関連するものを含む神経種類の範囲内の電気刺激の代替として提案されている。このプロトコルは一次聴覚神経細胞の培養における赤外線神経刺激のメカニズムを研究するためのパッチクランプ法を説明しています。

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

本実験の全体的な目的は、in vitroにおいて赤外線レーザー照射が聴覚ニューロンに及ぼす影響を研究するためのモデルシステムを構築することである。これは、培養した聴覚ニューロンをホールセル構成でパッチクランプし、その電気的特性を調べることで達成される。続いて、ニューロンにレーザー照射を行うことで、照射された細胞に電気的応答を誘発させることができ、これをパッチクランプ装置を用いて測定することが可能となる。その後、照明パラメータと環境変数を変化させることで、レーザー誘発電気反応への影響を観察できます。レーザー光にさらされた聴覚ニューロンは、各レーザーパルスに反応して再現性のある電気活動を示し、これを後で解析することが可能です。この手法は、らせん神経節ニューロンの赤外線刺激の根底にあるメカニズムに関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法は、らせん神経節細胞への赤外線刺激について特に深い洞察を提供しますが、関与する物理的プロセスをさらに解明するために、他の細胞型や脂質二重層などの簡略化されたモデルに拡張することも可能です。得られる放射露光量は極めて重要なパラメータであるため、光伝達用光ファイバーを正確に配置させるためには、この手法を視覚的に実証することが重要です。抵抗値 2～6 MΩ の記録用マイクロピペットを準備します。これらは、CO2レーザープラーを用いてホウケイ酸ガラスから作製できます。ファイバー結合レーザーを準備します。幅広い種類の光ファイバーが使用可能です。FCPCコネクタ付きのパッチコード構成のファイバーを半分に切断することで、片端にコネクタがあり、もう片端が露出したファイバーリンクを2本作成できます。これらはピグテールです。1本のピグテールの裸端を準備するため、ファイバージャケットを取り除き、エタノールで洗浄し、顕微鏡下で適切なツールを用いて劈開（クリービング）します。端面がファイバ軸に対して垂直であり、平坦であることを確認してください。必要に応じて適切なスルーコネクタを使用し、ファイバーピグテールのもう一方の端を刺激用レーザーの出力端に接続します。この時点で、必ずファイバーからのレーザー出力電力を測定してください。また、その後のチップ操作を行った後にも同様に測定を行ってください。次に、ファイバーをチャックに挿入し、そのチャックを適切なマイクロポジショナーに固定します。続いて、光ファイバーとカバーグラスがなす角度を決定します。この配置を写真に撮り、Image Jを用いて角度を算出してください。その後、レーザーとパッチクランプデータ収集システムを同期させるための接続を確実に行います。パッチクランプデータ収集システムからのデジタル出力は、外部ファンクションジェネレータを介してレーザーに接続します。これにより、データ収集システムとは独立してレーザーパルスのパラメータを指定することが可能になります。レーザーをトリガーする信号は、データ収集システムの入力に再度接続し、レーザーパルスのタイミングと長さが電気生理学的信号と同時に記録されるようにします。灌流システムの流速を1～2 mL/minに設定してください。溶液を急速加熱するためのインラインヒーターを備えた重力供給システムと、使用済み溶液を吸引して除去するためのペリスタルティックポンプを用いれば、十分に機能します。培養細胞を載せたカバーガラスを、高倍率の水浸対物レンズと位相差顕微鏡を用いた正立顕微鏡の記録チャンバー内に配置し、らせん神経節ニューロンを特定します。典型的な螺旋神経節ニューロンは、明るい円形で直径は約15 µmであり、顕著な核が見えます。適切なニューロンが見つかったら、低倍率の対物レンズに切り替えて目的のニューロンを特定します。次に、マイクロポジショナーを使用して、光ファイバーの先端が水平および垂直の両方の面で目的のニューロンに近づくまで移動させます。高倍率の対物レンズに切り替え、光ファイバーの先端をニューロンの隣の目的の位置に配置します。ファイバーの垂直位置を調整する際は、ファイバーの下端がカバーリップに接するようにすることが重要です。ファイバーの位置に関する不確かさを最小限に抑えるため、顕微鏡画像内の視覚的な手がかりから接触点を特定することができます。ファイバーを定位置に配置した後、マイクロピペットのポジショニングに影響が出ないよう、長軸方向に既知の量だけ移動させます。マイクロピペットには細胞内液を満たし、アンプのヘッドステージにしっかりと固定してください。マイクロ電極ホルダーの側面に取り付けられたチューブを使用して、少量の正圧をかけ、マイクロピペットの詰まりを防止します。マイクロマニピュレーターを用いて、マイクロピペットを標的ニューロンの直上の位置まで移動させ、ギガオームシールを形成します。シールテストパルス中に、電流にフィッティングさせた指数曲線から決定した膜容量、直列抵抗、および入力抵抗を記録してください。アンプのCP fastおよびCP slowコントロールを調整し、容量過渡応答を最小限に抑えます。次に、アンプをホールセルモードに切り替え、SEALテスト中に電流が平坦になるまで容量補正（capacitance compensation）と抵抗補正（resistance compensation）を変更します。続いて、直列抵抗補正をcorrection 約70%、prediction 約70%で適用し、テストシール応答が平坦に維持されるよう容量および抵抗補正コントロールを調整します。次に、アンプをカレントクランプモードに切り替えます。電流注入がない状態での静止膜電位を記録してください。その後、保持電流を設定し、膜電位を目的のレベルで安定させます。ピペット容量を中和し、ブリッジバランスを調整して電圧降下を相殺します。脱分極電流で刺激し、ニューロンの発火特性を確認してください。この時点で、CCDカメラと連動したイメージングソフトウェアを使用して、光学ファイバーをニューロンの隣の元の位置に戻します。まずニューロンの平面に焦点を合わせ、次に光学ファイバーの上端に焦点を合わせて画像を取得してください。画像を解析して、ターゲットニューロンの中心に対する光ファイバー上端の位置であるデルタ値を決定します。光ファイバーの位置を正確に把握することは非常に重要です。これは、ターゲット細胞に届けられる単位面積あたりのエネルギー、すなわち放射輝度露出量（radiance exposure）が赤外線神経刺激における重要なパラメータであり、細胞に対するファイバーの位置によって大きく影響を受けるためです。このレーザーの光出力は、レーザーへの直接入力によりコンピュータで制御されており、各記録の前に手動で指定できます。パルス幅と反復率は、前述の通りファンクションジェネレーターを介して制御可能です。パッチクランプチャネルとレーザートリガーチャネルの両方からデータが記録されていることを確認してください。通常、0.25から5 mJの出力で、0.5から15 msのレーザーパルスを与えると、測定可能な電気的応答が得られます。望ましくない影響を最小限に抑えるため、レーザーパルスの繰り返し周波数を1 Hz以下に設定することが有用な場合があります。すべてのレーザーパラメータの設定が完了したら、データ収集に進みます。らせん神経節ニューロンは、2.5 millisecond、0.8 millijoulesのレーザーパルスに対し、電圧クランプおよび電流クランプ記録の両構成において、再現性のある波形で反応します。典型的な細胞では、さまざまな保持電位で正味の内向き電流が生じます。電流クランプ記録では、これらのレーザーパルスの期間中に定常的な膜脱分極が起こり、パルス後には静止膜電位に向かってほぼ指数関数的に減少することが示されています。場合によっては、レーザーパルスの後にわずかな追加の膜脱分極が起こることがあります。過剰なエネルギーでの照射や、大幅な温度上昇への曝露は、細胞の電気的特性の悪化や即死などの細胞損傷を招く可能性があります。この手順に従うことで、溶液温度や化学的因子などの様々な環境パラメータを変化させ、レーザー誘発電気活動への影響を検証することができます。レーザーを用いた作業は危険を伴う可能性があるため、標準的な安全上の予防策を講じることを忘れないでください。これには、レーザー保護メガネの着用、警告標識の掲示、およびビームが意図せず高反射面に当たらないようにすることなどが含まれます。

whole-cell-patch-clamp-for-investigating-mechanisms-infrared-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚におけるマウトナーニューロンおよび他の細網脊髄細胞の電気的特性を研究する方法である、全細胞パッチクランプ電気生理学と呼ばれる技術を説明しています。...

全細胞パッチクランプ電気生理学:ニューロンの電気的特性を研究する方法

このビデオは、トランスフェクションされたマウス海馬の脳スライスにおけるシナプス相互作用とニューロン応答を研究するためのプロトコルを示しています。これには、長距離の感覚ニューロンを照射して活動電位をトリガーし、全細胞パッチクランプ技術を使用して記録されたニューロンに結果として生じる興奮性シナプス後電位を記録することが含まれます。...

マウス海馬切片におけるニューロンの光刺激および全細胞パッチクランプ記録

このビデオでは、内耳感覚ニューロン細胞体のイオン電流を測定するためのパッチクランプ技術を示しています。アムホテリシンBを含む内部溶液を充填した研磨パッチクランプピペットの調製と使用について詳しく説明します。このピペットは、メンブレンに穴を開けて、細胞内状態を維持しながらイオンを移動できるようにします。電圧パルスは、イオンチャネルの活動をトリガーおよび記録するために印加され、その特性と挙動に関する洞察を提供します。...

穿孔パッチクランプによる内耳感覚ニューロン細胞体の記録

このビデオは、パッチクランプ技術を使用してレオベースと膜電位を測定し、増分電流注入に対するニューロンの応答を分析する後根神経節の感覚ニューロン興奮性の調査を示しています。...

Intact Rat背根神経節の全細胞パッチクランプ記録

ここで説明するには、セルに接続されたパッチクランプ技術を用いて1イオンチャネルから現在の記録の長いストレッチを取得するための手順です。この方法は、リアルタイムで、観察するための生体信号の基礎となる開閉チャネルコンフォメーションのパターンを可能にする。これらのデータは、邪魔されずに生体膜におけるチャネルのプロパティをお知らせ。...

一チャネルセル付パッチクランプ法

皮質ネットワークは抑制性介在ニューロンの小さいが、多様なセットで制御されます。介在ニューロンの機能的研究は、そのためターゲットを絞った記録や厳密な識別を必要とします。ここで説明するには、単一または細胞内の標識と神経細胞のシナプス結合のペア、事後形態学的および免疫細胞化学分析からホールセル記録を含む組み合わされたアプローチです。...

Morphologically-と神経化学的に特定し海馬介在ニューロンからホールセルパッチクランプ記録

このプロトコルは、全細胞パッチクランプ記録を実行するための基本的な処理手順を説明します。この技術は、神経細胞の電気的挙動の研究を可能にし、脳スライスに行ったときに、まだ比較的よく保存脳の回路に集積されているニューロンからの様々な神経機能の評価を可能にします。...

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

このプロトコルは、フラットマウント調製物から網膜ニューロンの全細胞パッチクランプ記録を実行する方法を示しています。...

Deafferentatedマウス網膜のフラットマウントの準備中のスターバーストアマクリン細胞のパッチクランプ記録

スライス パッチ ・ クランプの技術学習によって誘発される可塑性を分析するため

このプロトコルは、標準的なインビトロ電気生理学装置用に最近開発されたシステムを用いて自動画像ガイドパッチクランプ実験を行う方法を説明している。...

脳スライスにおけるニューロン研究のための自動画像誘導パッチクランプの応用

学ぶ全細胞パッチクランプ法を用いた赤外線レーザー刺激が聴覚ニューロンに与える電気応答のメカニズム。この手法は神経生理学と聴覚系研究の発展に貢献します。

赤外線神経刺激のメカニズムを調査するための全細胞パッチクランプ

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