Name: ミツバチにおけるRNAiによる二重遺伝子ノックダウンと味覚知覚測定（ミツバチ） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-25T08:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 学ぶミツバチにおけるRNAiによる二重遺伝子ノックダウンと味覚知覚測定法。PERアッセイを用いて遺伝子機能と行動の関係を解明し、ミツバチの採餌行動の遺伝基盤を理解する。

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著者は、実験を支援するエリンFennernに感謝したいと思います。この作品は、ノルウェーの研究評議会（180504、185306及び191699）、ピュー慈善トラスト、および国立老化研究所（NIA P01 AG22500）によって賄われていた。

パート1：RNAiによる二重の遺伝子ノックダウン 1。 dsRNAを合成<ol><li> VG、USPとミツバチのゲノムに含まれていない緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードする制御遺伝子を標的dsRNAをの設計プライマー：プライマーはオンラインフリーソフトウェアPrimer3のを（使用して設計された<a href="http://frodo.wi.mit.edu/" target="_blank">http://frodo.wi.mit.edu/</a> ） 。 </li><li> VG、USPとGFPのためのdsRNA合成：in vitro転写用プロメガからの使用RiboMax T7 RNAの生産システム。 </li><li> dsRNAの精製： <ol><li>変性および再生：85への熱のdsRNAを℃で5分間、それを1時間室温で冷ましてみましょう。 </li><li>のDNase I処理：それぞれのdsRNA反応に1μlのDNアーゼIを追加し、チューブをフリックでそれらをミックス。 37℃で15分インキュベート</li><li>各反応にLS、そして優しくINVでそれらをミックス - 150μlのヌクレアーゼフリー水と750μlのトリゾールを追加チューブerting。 30℃で5分のためのサンプルをインキュベート</li><li>各サンプルに200μlのクロロホルムを追加します。 20秒間激しく混ぜる。 4℃12,000×gで15分間サンプルを遠心℃に</li><li>各新しいチューブに上清位相を移し、各チューブに500μlのイソプロピルアルコールを追加します。反転チューブでそれらをミックス。 -20℃で20分間混合物をインキュベート4℃で12,000×gで10分間、それを遠心</li><li>上清を除去し、ペレットを洗浄するために1,000μlの75％エタノールを使用しています。 C、空気乾燥したdsRNAはペレット4℃で7,500×gで5分間チューブを遠心分離した後、ペレットを溶解するヌクレアーゼフリーの水を使用しています。遺伝子の効能ダウンレギュレーションを確保するためには、dsRNA濃度は9 -10μgの/μlの周りでなければなりません。 </li></ol></li></ol> 2。 dsRNAは腹部注射 1）単回注射：ミックス二つの遺伝子のdsRNAと麟蹄二重遺伝子ノックダウンのために、2つの戦略がありますカラットは、混合物、2）2日間注射：初日に一つの遺伝子を標的とする最初のdsRNAを注入し、二日目の同じ蜂に第二のdsRNAを注入。 <ol><li>寒さは、新たに1〜2分のために4℃冷蔵庫にミツバチを浮上した。ミツバチが固定化されている場合、それらの腹部とthoraxの複数形の間で交差虫ピンで固形ワックスの完全ペトリ皿上で並列に3-4ミツバチをマウントします。 </li><li> 4℃の冷蔵庫に再びミツバチを冷やす。ミツバチは完全に不動であることを確認してください。それは、約1〜2分かかります。ミツバチが緩んでいるはずです。ミツバチが丸まったりねじ曲げなった場合、それは彼らがあまりにも長い間避けるべきであるどの冷やしていることを意味します。なごむはあまり高い死亡率の原因となるが、どんな動きが傷や死亡のサイズが大きくなりますように、完全な固定化は重要です。 </li><li>ハミルトンマイクロシリンジで使い捨て30 G針（BD）を入れます。 3μlのdsRNAのを取ると、シリンジ内に気泡がないことを確認してください。針は玉を避けるために、腹部の側面に挿入される内臓パトン。 dsRNAは、吸収されるように徐々にシリンジプランジャを押す。 dsRNAは、非常に粘性があるので、それは完全にシリンジから追放する2-3秒かかります。完全にプランジャーを押し下げた後、4,5秒のために傷口に針を残す。注射後3-5秒間ミツバチを観察します。傷口から血リンパ液滴が漏れた場合は、蜂を捨てる。 </li><li>さまざまな治療法に対応した彼らのthoraxの複数形をマークするために異なる色を使用してください。シングル注入戦略が使用された場合、この時点で、蜂、1時間の観察の後にコロニーに戻って配置することができる。しかし、2日間の注入戦略は最初のdsRNAを注射された後、使用された場合、ミツバチは蜂蜜シリンダメッシュケージに置かれるべき側に供給され、34のインキュベーターで保たれる℃、湿度80％ 。 </li><li>二日目は、メッシュケージにミツバチを冷やし、ワックスプレートにマウントするためのステップ2.2および2.3に従ってください。それはdescriあるように、第2のdsRNAで注射を行うステップ2.4​​のベッド。 </li><li>ミツバチが1時間室温で回復し、植民地にそれらを紹介しましょう​​。 </li></ol>注：ノックダウン効果を定量的RT-PCR（定量RT-PCR）およびウェスタンブロットによって検出することができる。一般的には、ノックダウン効果が変化し、多くの要因に依存する。我々の研究では、二重の遺伝子ノックダウンは7日、シングル注入と二日間の注射後に検出することができます。 パート2：テングザル拡張応答（PER）アッセイ 1。ハイブから集めるミツバチ注射後6日目に、喫煙者を使用せずに、コロニーからの処理ミツバチを収集します。金属メッシュシリンダーケージでミツバチを収集します。各ケージに3ミツバチを保つ。 2。 PER用取付ミツバチ彼らが完全に固定化されている°Cまで4でミツバチを冷やす。特別にPERのために設計プラスチックチューブに垂直各蜂をマウントします。ボイジャーによって管内腹部を保つgの二つの小さなテープ片、チューブから突き出頭を維持。小さなプラスチック製のカラムの2行を持つラックにチューブを入れて、ID番号で各チューブ（蜂）を割り当てます。その後、インキュベーター（34℃、湿度80％）にラックで治療ミツバチを入れて、2時間インキュベーターに保管してください。 3。ショ糖水溶液のシリーズの準備 0％、0.1％、0.3％、1％、3％、10％及び30％スクロース水溶液を調製し、15〜20 G針とシリンジにソリューションを読み込む。 4。アッセイPER 0.1％、0.3％、1％、3％、10％および30％スクロース水溶液に続いて0％溶液（水）の液滴と蜂のアンテナをタッチします。最初に水ですべてのミツバチをテストし、各ソリューション間の間隔として、少なくとも2分が使用されていることができます。したがって、我々は、通常、各試験のために少なくとも20蜂を持っている。ハチが完全に彼女の口吻を拡張する場合、肯定応答がカウントされます。 5。データ管理味覚応答スコア（GRS）のために、個々の総陽性反応をまとめる。データに適切な統計分析を実行します。 パート3。遺伝子ノックダウンの検証脂肪体は7日齢扱わミツバチの別のセットから解剖されています。標準トリゾール手順は、DNアーゼI処理24が行われるRNA抽出のために使用される。Vgとし、USPの遺伝子発現は二段階定量RT-PCRによって分析される。 アクチンは、それが、異なる組織で安定した式を有するので、参照遺伝子として用いられるミツバチの。 VG及びUSP遺伝子の公表リアルタイムPCRプライマーは、24本実験で使用されている。データは、デルタデルタCT法25を用いて分析される。

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開示するものは何もありません。

我々の研究は、同時に成虫に二つの遺伝子をノックダウンするための最初の取り組みです。我々の結果は、dsRNAを注射（単回注射と二日間の注射）の2つの戦略は、二重遺伝子抑制に有効であることを示している、とVGとUSPの同時遺伝子サイレン蜂8,9に6日間dsRNAを注射した後にテストすることができます。しかし、遺伝子ノックダウンの効果は、細胞や臓器によって標的遺伝子、タンパク質の代謝回転率とdsRNAの取り込み効率の転写レベルに応じてさまざまな昆虫種が異なります。また、RNAiはの効果は用量依存的である。私たちは、新たに出現し蜂はよく4μlのdsRNAをを受け入れることが見つかりましたが、以上の4μLのdsRNAを注入した場合、死亡率が急速に増加しています。したがって、2日間の注入戦略は、注入量のより高い量を必要とする実験のための単一の注入よりも適切であり得る。 ここでは、二重の遺伝子ノックダウン9 </supは&gt;我々は、2つのレギュレータの共同効果を研究するために使用することができます開発しました。ま...

RNA干渉（RNAi）は、真核生物の多種多様に発生するRNAベースの転写後遺伝子サイレンシングである。 RNAiのプロセスは、内因性又は外因性の二本鎖RNA（dsRNA）前駆物質によって引き起こされる。 dsRNAは、結合して小さな断片（20〜25塩基対）へのdsRNAを切断するリボヌクレアーゼタンパク質ダイサーを活性化する。 dsRNAのガイドの、小さな断片アルゴノートタンパク質による補完的なmRNAの認識と切断、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）1の触媒成分。哺乳類では、30ヌクレオチドより長いdsRNAはは、RNA転写産物2の非特異的な劣化につながる抗ウイルス応答（インターフェロン応答、IFN）を活性化する。しかし、長いdsRNAは、このIFN 3の不足しているため、昆虫に有効かつ特異的であることが証明されている。 長いdsRNAは、異なる昆虫種の標的遺伝子の下方制御に使用されてきた。ミツバチは、パイオンの一つです発達や行動の多くの重要な遺伝子の機能がdsRNAは4,5を使用することによって明らかにされているEER昆虫生物。いくつかのdsRNAの発送方法はミツバチで行われています：dsRNAをインジェクションはミツバチの胚4と成体ミツバチ7,8の遺伝子ノックダウンのための効果的なアプローチであるのに対し、dsRNAを送り、効率的に、ミツバチの幼虫6に標的遺伝子の発現を下方制御する。 昆虫へのdsRNAを適用することにより、展示遺伝子ノックダウン効果は一過性とローカライズされています。研究では、腹部のdsRNA注射胸部のdsRNA注射の両方を効果的に昆虫9,10の腹部脂肪体細胞において標的遺伝子の発現を抑制することが示されている。 dsRNAは、細胞が10を浴びている血リンパからのdsRNAを取ることができている腹部や胸部の空洞や脂肪体細胞内に注入される。しかし、そのような卵巣や脳などの他の臓器、の遺伝子のいずれかが対象とすることはできません腹部や胸部注射。ミツバチの脳内の遺伝子を標的とするためには、dsRNAの脳の注入は効果的局所脳領域11内の標的遺伝子の発現に影響を及ぼす、行われている。ここで、我々は唯一の、より一般的に成人のミツバチで使用されている腹部のdsRNA注入を文書化します。 RNAiは、主に単一遺伝子を標的とするために使用されており、遺伝子の機能を明らかにするための強力なツールとなっている。しかし、任意の遺伝子は他から絶縁されていません、それは複雑な制御ネットワークである。生物学的プロセスを理解するための鍵は、遺伝子が複数の遺伝子の同時操作ではなく、単一の遺伝子ノックダウンを必要とする、どのように相互作用するかを詳細に分析することである。哺乳動物細胞株において、科学者は、送達システム12またはマルチマイクロRNA（miRNAの）ヘアピンのデザイン13を用いて同時に阻害する二、三の遺伝子に成功した。しかし昆虫で、複数の遺伝子ノックダウンはまだ未検証です。ここでは、プレゼンテーション二重の遺伝子ノックダウンを達成することができますトンの異なる注入戦略。卵黄タンパク質前駆体をコードしてビテロゲニン（VG）、及び幼若ホルモン（JH）のため推定受容体をコードし、ミツバチにJH 14への応答を仲介する転写因子として働くことができるピラクル（USP）：我々は2つの遺伝子をターゲットにしています。 VGとJHは、フィードバックループ15でお互いを調節し、ミツバチの行動規制9に関与している。二重の遺伝子ノックダウンを使用して、我乱すVgを両方とJH経路、そして、彼らが共同でミツバチの行動と生理機能とどのようにVG、USPとJHは9対話にどのように影響するかを発見する。 味覚認識はミツバチ社会的行動のための16の行動予測因子である。高い味覚認知と行動の発達、巣のミツバチ行動成熟速く、通常人生の早い段階で飼料の観点と花粉16,17を収集することを好む。ものの規制M味覚認識を根底echanismsはまだ不明で、研究は味覚知覚は内部エネルギー代謝9、ホルモン分泌18,19及び生物遺伝アミンにリンクされていることが示されている20の経路。 VgはとJHの両方が変調味覚認知7,21重要なホルモンのレギュレータです。研究室では、ミツバチで味覚知覚の変化が異なるショ糖溶液に口先拡張応答（PER）をテストすることによって評価することができます。各蜂、0.1、0.3、1、3、10、30％スクロースの上昇濃度系列に続いて、水の液滴と彼女のアンテナの両方に触れることによってテストされる。水またはスクロースの液滴は、各アンテナに触れたときのハチが完全に彼女の口吻を拡張する場合は正の応答が注目される。ソリューションに対する肯定応答の数に基づいて、各個体の味覚知覚レベルが16を決定することができる。しかし、PERの適用はグラム測定に限定されるものではないustatory認識。 PERはまた、このような飽食対飢餓としてミツバチの代謝状態をテストするための有効な方法である。ショ糖へのより大きな応答とミツバチは、一般的にハングリー（王とAmdam、未発表データ）である。また、PERパラダイムはミツバチに連想学習と記憶にも使用することができます。このケースではミツバチは臭気とショ糖水の存在を関連付けるために訓練されます。ミツバチが関連を学ぶとき、臭気の唯一の存在は、スクロース22,23とそれらを報いることなく、正口先応答を呼び起こすことができます。このビデオでは、我々は以前の研究9でVGとUSPダブルノックダウンで接続された味覚の知覚を評価するために、PERを実行する方法を示しています。

<table><tbody><tr><td>GE Healthcare PCR ビーズ 96ウェルプレート</td><td>GE Healthcare</td><td>27-9557-01</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>RiboMax T7 RNA産生システム</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td></td></tr><tr><td>Trizol LS</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton micro syringe</td><td>Hamilton</td><td>80301</td><td></td></tr><tr><td>30G BD 使い捨て針</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>1 ml シリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>30960</td><td></td></tr><tr><td>ステレオ解剖顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステム</td><td>S6D</td><td></td></tr><tr><td>昆虫ピン</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td>ワックスプレート</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ミツバチにおけるrnaiによる二重遺伝子ノックダウンと味覚知覚測定（<em&gt;ミツバチ</em&gt;）

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

このビデオでは、二本鎖RNA（dsRNA）注射を用いたミツバチで同時に二つの遺伝子をダウンレギュレートするRNA干渉（RNAi）の新規技術を示しています。また、味覚の知覚を測定するための口先拡張応答（PER）アッセイのプロトコルを提示します。 RNAiによる遺伝子ノックダウンは、標的遺伝子の発現をダウンレギュレーション有効な技術である。この技術は、通常、単一の遺伝子操作に用いられるが、それは相互作用と遺伝子との接合効果を検出するための限界​​を有している。このビデオの最初の部分で、我々は、同時に2つの遺伝子を（二重遺伝子ノックダウンと呼ばれる）をノックダウンするための2つの戦略を提示する。我々は両方の戦略が効果的に規制のフィードバックループにある2つの遺伝子、ビテロゲニン（VG）とピラクル（USP）を抑制することができますを示しています。この二重の遺伝子ノックダウンのアプローチは、遺伝子間の相互関係を分析するために使用することができ、容易に適用することができ異なる昆虫種。 このビデオの第二部は、二重遺伝子ノックダウンの治療後のミツバチで口先拡張応答（PER）アッセイのデモンストレーションです。 PERアッセイは、ミツバチ、ミツバチの行動の成熟がどれほど速いの鍵な予測因子であるの味覚の知覚を測定するための標準的なテストです。巣ミツバチの大味覚認識は、多くの場合、花粉の特化を餌と餌の発症に早い年齢に関連付けられて増加した行動の発展を示している。また、PERアッセイはミツバチに飽食か飢餓の代謝状態を識別するために適用することができます。最後に、1アッセイあたりミツバチも広くミツバチの学習と記憶研究のために使用されているエアコンに異なる匂い刺激をペアリングと組み合わせる。

シングル注入と2日間注入戦略大幅VG（一方向ANOVA、P &lt;0.001）（ 図2A）とUSP（一方向ANOVA、P &lt;0.001）（ 図2B）ミツバチにおける転写レベルを減少させ、両方のdsRNAを注入した6日後。 dsRNAの混合物およびVG第一および第二のUSP（VG / USP）と2日間の注射で単回注射を使用してUSP転写の抑制がUSP第一および第二のVG（USP / VG）で2日間の注射よりも有意に低かった（事後分析、P 混合対USP / VG = 0.013、P VG / USP対USP / VG = 0.019）。 ダブルノックダウンミツバチでGRSは、GFPコントロール<...

このプロトコルでは、我々は同時に、ミツバチの二つの遺伝子（二重遺伝子ノックダウン）を抑制の2つの戦略について説明します。その後私たちはミツバチ味覚知覚に二重遺伝子ノックダウンの効果を研究するために口先拡張応答（PER）アッセイを使用する方法を提示します。

ミツバチにおけるRNAiによる二重遺伝子ノックダウンと味覚知覚測定（<em&gt;ミツバチ</em&gt;）

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

このビデオプロトコルでは、成蜂において2つの遺伝子を同時にノックダウンし、その後、口吻伸展反応（PER）アッセイを行って、二重遺伝子ノックダウンがミツバチの味覚知覚に及ぼす影響を測定する新しい手法を実演します。これはまず、vitelli、genin、ultras、spherical、および緑色蛍光タンパク質（GFP）の3つのタンパク質の遺伝子を標的とした二本鎖RNAを合成することで達成されます。GFPをコードする遺伝子はミツバチのゲノムに存在しないため、GFP二本鎖RNAをネガティブコントロールとして使用します。次のステップは、4つの処理戦略を用いてミツバチに二本鎖RNAを注入することです。注入内容は、GFP二本鎖RNAのみの注入、VGとUSPの二本鎖RNA混合液による単回注入、1日目にvg二本鎖RNAを注入し2日目にUSP二本鎖RNAを注入する方法、および1日目にUSP二本鎖RNAを注入し2日目にVG二本鎖RNAを注入する方法です。注入後、処理内容に対応する色分けされた塗料でミツバチにマークを付け、巣に戻しました。6日後、処理したミツバチにおけるVGおよびUSP遺伝子のノックダウンをリアルタイムPCRで検証し、VGとUSPのダブルノックダウンが味覚知覚に及ぼす影響をPERアッセイによって判定します。最終的に、ダブルノックダウン個体ではVGおよびUSP遺伝子の発現が著しく減少し、ショ糖に対する味覚知覚が有意に亢進することが示されます。本干渉法は、遺伝子機能を明らかにするための強力なツールとなります。通常、これは単一の遺伝子を標的とするために使用されます。しかし、遺伝子は複雑な調節ネットワークの一部です。生物学的プロセスをより深く理解するための一つの方法は、遺伝子が遺伝子ネットワークとどのように相互作用するかを学ぶことです。これを実現するためには、複数の遺伝子を同時に操作する必要があります。これまで、昆虫において一度に操作できた遺伝子は1つだけでしたが、ここでは初めて、ミツバチにおいて1つではなく2つの遺伝子をノックダウンする方法を紹介します。口髭触覚反応（PER）は、ミツバチの社会行動の行動学的予測因子である味覚知覚を測定するための非常に有用な手法です。例えば、味覚感知能力の高い巣蜂は、行動的な成熟が早く、生活の早い段階で採餌を行い、花粉の収集を好みます。この手順を開始するには、無料ソフトのprimerThreeを用いて、ノックダウン対象となる遺伝子を標的とした二本鎖RNAのプライマーを設計します。本実験でノックダウンの標的とする2つの遺伝子は、vitelligenin（VG）およびultraspiral（USP）です。VGおよびUSPの設計に加えて、ミツバチのゲノムに存在しない緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするコントロール遺伝子を標的とした二本鎖RNAのプライマーを設計します。続いて、Promega社のRibMax T7 RNA production systemを用いたin vitro転写により、VG、USP、およびGFPの二本鎖RNAを合成します。標準的な手順で二本鎖RNAを精製した後、各二本鎖RNAペレットをヌクレアーゼフリー水に溶解します。遺伝子ダウンレギュレーションの効率を確保するため、二本鎖RNA濃度は1 µLあたり9から10 µg程度にする必要があります。ミツバチを注射に備えさせるため、羽化したばかりのミツバチを4 °Cの冷蔵庫で1から2分間冷却します。ミツバチが不動になったら、固形ワックスを満たしたペトリ皿に3から4匹のミツバチを並行に配置し、腹部と胸部の間に昆虫ピンを刺して固定します。ミツバチを再び4 °Cの冷蔵庫で約1〜2分間冷却します。ミツバチが完全に静止していることを確認してください。ミツバチは、体を丸めたりねじったりせず、弛緩した状態である必要があります。わずかな動きでも傷口が広がり死亡率が高まる可能性があるため、完全に固定することが重要です。体が丸まっていたりねじれていたりするミツバチは、冷却時間が長すぎ、死亡率が高いため使用しないでください。ハミルトンマイクロシリンジに使い捨ての30ゲージ針を装着します。シリンジに3 µLの2本鎖RNAを満たし、シリンジ内に気泡がないことを確認します。単回注射法を用いる場合は、2つの遺伝子の2本鎖RNAの混合液をシリンジに充填します。2日間にわたる注射法を用いる場合は、2つの2本鎖RNAのうちのいずれか一方をシリンジに充填します。腹部の側面に針を挿入します。内臓への損傷を避けるため、シリンジのプランジャーをゆっくりと押し、二本鎖RNAを吸収させます。二本鎖RNAは非常に粘性が高いため、シリンジから完全に排出させるまでに2〜3秒かかります。プランジャーを完全に押し切った後、針を傷口に4〜5秒間留めておきます。注射後、3〜5秒間ミツバチを観察してください。傷口から血リンパが漏れた場合は、そのミツバチを廃棄してください。その後、処理内容に応じて異なる色でミツバチの胸部をマークします。この時点で、単回注入戦略を用いている場合は、蜂蜜を供給した容器内でミツバチを1時間観察し、その後コロニーに戻します。一方、2日間注入戦略を用いており、1回目の二本鎖RNAのみを注入した場合は、側面に蜂蜜を供給したシリンダーメッシュケージにミツバチを入れます。ミツバチを34 °C、湿度80%のインキュベーター内で一晩保持し、翌日まで維持します。最初の二本鎖RNAと同様の手順で、同じミツバチに2種類目の二本鎖RNAを注入します。ハチを蜂蜜が提供された容器に入れ、室温で1時間回復させた後、コロニーに戻します。注入から6日後、燻煙器を使用して巣箱を開けることなく、コロニーから処理済みのミツバチを回収します。本手順ではミツバチの味覚認識をテストするため、それに影響を及ぼす可能性がある煙は使用しません。PERアッセイのため、柔らかいピンセットを用いてミツバチを金属メッシュのシリンダーケージに回収し、1ケージあたり3匹を超えないようにして配置します。ハチを4°Cで冷却し、完全に不動になるまで待ちます。各個体を、PER用に特別に設計されたプラスチックチューブに垂直に固定します。テープを使用して、腹部をチューブ内に保持し、頭部がチューブから外に出るように固定します。チューブを、2列の小さなプラスチック製コラムがあるラックに配置します。1列には番号が振られており、固定したミツバチにID番号を割り当てることができます。処理済みのミツバチが入ったラックを、ミツバチをインキュベートさせるため、34 °C、湿度 80% のインキュベーターに2時間入れます。一連のショ糖水溶液を調製します。PERアッセイに使用するため、これらの溶液を15～20ゲージの針を付けたシリンジに充填します。ミツバチはグループごとにテストします。まず、各ミツバチの触角に0%溶液（水）の液滴を触れさせ、その後、0.1%、0.3%、1%、3%、10%、および30%のショ糖水溶液でテストします。各溶液の投与間隔は、少なくとも2分空けてください。1種類の濃度のショ糖を用いて20匹の蜂をテストする場合、通常は約2分かかります。したがって、各グループには常に20匹以上の蜂を用意する必要があります。蜂が口吻を完全に伸ばした場合を陽性反応としてカウントします。リアルタイム。PCR解析により、単回注入および2日間にわたる注入の両戦略において、ミツバチのFijiおよびUSPの転写産物レベルが有意に減少したことが確認されました。これらのグラフは、二本鎖RNAを注入してから6日後の結果であり、RQは標的遺伝子の転写産物の相対定量レベルを示し、バーの上の異なる文字は処理群間の有意差を示しています。事後解析の結果、二本鎖RNA混合物を用いた単回注入、および最初にVG、次にUSPを注入した2日間注入によるUSP転写産物の抑制は、最初にUSP、次にVGを注入した2日間注入よりも有意に低いことが明らかになりました。これは、VGがVGと幼若ホルモンの調節ループにおける主要な調節因子である可能性を示しています。処置したミツバチのGUAに対する反応スコア（GRS）は、ここに示すように、口吻伸展反応（PER）アッセイの結果から算出されました。VGとUSPの二本鎖RNA混合物を注射したミツバチのGRSは、GFPコントロール群のミツバチのGRSよりも有意に高く、ダブルノックダウン個体がショ糖に対してより敏感であったことを示しています。バーの上の異なる文字は、処理群間の有意差を示しています。ここでは、VGおよびUSP遺伝子を同時に抑制することで明らかになった、vigenin ultras、spherical、および juvenile hormone 間の想定される調節ネットワークを示しています。USP単独のノックダウンでは juvenile hormone に変化は見られませんが、VGとUSPのダブルノックダウンでは、VG単独のノックダウンよりも juvenile hormone の大幅な増加が引き起こされます。このことは、vitelliが幼若ホルモンの産生を抑制するだけでなく、USPノックダウンに対する幼若ホルモンのフィードバック応答も抑制していることを示唆しています。ダブルノックダウンにおいて幼若ホルモンの産生が劇的に増加するのは、VGノックダウンによるVI geninからの抑制減少と、USPノックダウンによる幼若ホルモン伝達の減少に対する代償的応答の結果です。この調節ネットワークに関するより詳細な考察は、付属のプロトコルテキストに記載されています。二重遺伝子ノックダウン法を用いることで、単一の遺伝子を抑制しただけでは発見できなかった、vital genic、ultras、spherical、および幼若ホルモンの詳細な関係を明らかにしました。現在、この手法を用いることで、研究者は制御ネットワーク内における遺伝子間の相互関係を探索することが可能です。PRはミツバチの味覚知覚を測定するために用いられる標準的な手法ですが、ハンドリングに対して非常に敏感であるため、動物の環境およびハンドリングの一貫性を維持する際には細心の注意を払う必要があります。さらに、アッセイを数日間にわたって行う場合は、簡潔なタイムラインを作成し、天候や環境に変動がないか注意深く監視することが推奨されます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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ミツバチにおけるRNAiによる二重遺伝子ノックダウンと味覚知覚測定（

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