ミツバチにおけるRNAiによる二重遺伝子ノックダウンと味覚知覚測定（

このビデオプロトコルでは、成蜂において2つの遺伝子を同時にノックダウンし、その後、口吻伸展反応（PER）アッセイを行って、二重遺伝子ノックダウンがミツバチの味覚知覚に及ぼす影響を測定する新しい手法を実演します。これはまず、vitelli、genin、ultras、spherical、および緑色蛍光タンパク質（GFP）の3つのタンパク質の遺伝子を標的とした二本鎖RNAを合成することで達成されます。

GFPをコードする遺伝子はミツバチのゲノムに存在しないため、GFP二本鎖RNAをネガティブコントロールとして使用します。次のステップは、4つの処理戦略を用いてミツバチに二本鎖RNAを注入することです。注入内容は、GFP二本鎖RNAのみの注入、VGとUSPの二本鎖RNA混合液による単回注入、1日目にvg二本鎖RNAを注入し2日目にUSP二本鎖RNAを注入する方法、および1日目にUSP二本鎖RNAを注入し2日目にVG二本鎖RNAを注入する方法です。注入後、処理内容に対応する色分けされた塗料でミツバチにマークを付け、巣に戻しました。

6日後、処理したミツバチにおけるVGおよびUSP遺伝子のノックダウンをリアルタイムPCRで検証し、VGとUSPのダブルノックダウンが味覚知覚に及ぼす影響をPERアッセイによって判定します。最終的に、ダブルノックダウン個体ではVGおよびUSP遺伝子の発現が著しく減少し、ショ糖に対する味覚知覚が有意に亢進することが示されます。本干渉法は、遺伝子機能を明らかにするための強力なツールとなります。

通常、これは単一の遺伝子を標的とするために使用されます。しかし、遺伝子は複雑な調節ネットワークの一部です。生物学的プロセスをより深く理解するための一つの方法は、遺伝子が遺伝子ネットワークとどのように相互作用するかを学ぶことです。

これを実現するためには、複数の遺伝子を同時に操作する必要があります。これまで、昆虫において一度に操作できた遺伝子は1つだけでしたが、ここでは初めて、ミツバチにおいて1つではなく2つの遺伝子をノックダウンする方法を紹介します。口髭触覚反応（PER）は、ミツバチの社会行動の行動学的予測因子である味覚知覚を測定するための非常に有用な手法です。

例えば、味覚感知能力の高い巣蜂は、行動的な成熟が早く、生活の早い段階で採餌を行い、花粉の収集を好みます。この手順を開始するには、無料ソフトのprimerThreeを用いて、ノックダウン対象となる遺伝子を標的とした二本鎖RNAのプライマーを設計します。本実験でノックダウンの標的とする2つの遺伝子は、vitelligenin（VG）およびultraspiral（USP）です。

VGおよびUSPの設計に加えて、ミツバチのゲノムに存在しない緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするコントロール遺伝子を標的とした二本鎖RNAのプライマーを設計します。続いて、Promega社のRibMax T7 RNA production systemを用いたin vitro転写により、VG、USP、およびGFPの二本鎖RNAを合成します。

標準的な手順で二本鎖RNAを精製した後、各二本鎖RNAペレットをヌクレアーゼフリー水に溶解します。遺伝子ダウンレギュレーションの効率を確保するため、二本鎖RNA濃度は1 µLあたり9から10 µg程度にする必要があります。ミツバチを注射に備えさせるため、羽化したばかりのミツバチを4 °Cの冷蔵庫で1から2分間冷却します。ミツバチが不動になったら、固形ワックスを満たしたペトリ皿に3から4匹のミツバチを並行に配置し、腹部と胸部の間に昆虫ピンを刺して固定します。

ミツバチを再び4 °Cの冷蔵庫で約1〜2分間冷却します。ミツバチが完全に静止していることを確認してください。ミツバチは、体を丸めたりねじったりせず、弛緩した状態である必要があります。

わずかな動きでも傷口が広がり死亡率が高まる可能性があるため、完全に固定することが重要です。体が丸まっていたりねじれていたりするミツバチは、冷却時間が長すぎ、死亡率が高いため使用しないでください。ハミルトンマイクロシリンジに使い捨ての30ゲージ針を装着します。

シリンジに3 µLの2本鎖RNAを満たし、シリンジ内に気泡がないことを確認します。単回注射法を用いる場合は、2つの遺伝子の2本鎖RNAの混合液をシリンジに充填します。2日間にわたる注射法を用いる場合は、2つの2本鎖RNAのうちのいずれか一方をシリンジに充填します。

腹部の側面に針を挿入します。内臓への損傷を避けるため、シリンジのプランジャーをゆっくりと押し、二本鎖RNAを吸収させます。二本鎖RNAは非常に粘性が高いため、シリンジから完全に排出させるまでに2〜3秒かかります。

プランジャーを完全に押し切った後、針を傷口に4〜5秒間留めておきます。注射後、3〜5秒間ミツバチを観察してください。傷口から血リンパが漏れた場合は、そのミツバチを廃棄してください。その後、処理内容に応じて異なる色でミツバチの胸部をマークします。

この時点で、単回注入戦略を用いている場合は、蜂蜜を供給した容器内でミツバチを1時間観察し、その後コロニーに戻します。一方、2日間注入戦略を用いており、1回目の二本鎖RNAのみを注入した場合は、側面に蜂蜜を供給したシリンダーメッシュケージにミツバチを入れます。ミツバチを34 °C、湿度80%のインキュベーター内で一晩保持し、翌日まで維持します。

最初の二本鎖RNAと同様の手順で、同じミツバチに2種類目の二本鎖RNAを注入します。ハチを蜂蜜が提供された容器に入れ、室温で1時間回復させた後、コロニーに戻します。注入から6日後、燻煙器を使用して巣箱を開けることなく、コロニーから処理済みのミツバチを回収します。

本手順ではミツバチの味覚認識をテストするため、それに影響を及ぼす可能性がある煙は使用しません。PERアッセイのため、柔らかいピンセットを用いてミツバチを金属メッシュのシリンダーケージに回収し、1ケージあたり3匹を超えないようにして配置します。

ハチを4°Cで冷却し、完全に不動になるまで待ちます。各個体を、PER用に特別に設計されたプラスチックチューブに垂直に固定します。テープを使用して、腹部をチューブ内に保持し、頭部がチューブから外に出るように固定します。

チューブを、2列の小さなプラスチック製コラムがあるラックに配置します。1列には番号が振られており、固定したミツバチにID番号を割り当てることができます。処理済みのミツバチが入ったラックを、ミツバチをインキュベートさせるため、34 °C、湿度 80% のインキュベーターに2時間入れます。

一連のショ糖水溶液を調製します。PERアッセイに使用するため、これらの溶液を15～20ゲージの針を付けたシリンジに充填します。

ミツバチはグループごとにテストします。まず、各ミツバチの触角に0%溶液（水）の液滴を触れさせ、その後、0.1%、0.3%、1%、3%、10%、および30%のショ糖水溶液でテストします。各溶液の投与間隔は、少なくとも2分空けてください。

1種類の濃度のショ糖を用いて20匹の蜂をテストする場合、通常は約2分かかります。したがって、各グループには常に20匹以上の蜂を用意する必要があります。蜂が口吻を完全に伸ばした場合を陽性反応としてカウントします。リアルタイム。

PCR解析により、単回注入および2日間にわたる注入の両戦略において、ミツバチのFijiおよびUSPの転写産物レベルが有意に減少したことが確認されました。これらのグラフは、二本鎖RNAを注入してから6日後の結果であり、RQは標的遺伝子の転写産物の相対定量レベルを示し、バーの上の異なる文字は処理群間の有意差を示しています。事後解析の結果、二本鎖RNA混合物を用いた単回注入、および最初にVG、次にUSPを注入した2日間注入によるUSP転写産物の抑制は、最初にUSP、次にVGを注入した2日間注入よりも有意に低いことが明らかになりました。

これは、VGがVGと幼若ホルモンの調節ループにおける主要な調節因子である可能性を示しています。処置したミツバチのGUAに対する反応スコア（GRS）は、ここに示すように、口吻伸展反応（PER）アッセイの結果から算出されました。VGとUSPの二本鎖RNA混合物を注射したミツバチのGRSは、GFPコントロール群のミツバチのGRSよりも有意に高く、ダブルノックダウン個体がショ糖に対してより敏感であったことを示しています。

バーの上の異なる文字は、処理群間の有意差を示しています。ここでは、VGおよびUSP遺伝子を同時に抑制することで明らかになった、vigenin ultras、spherical、および juvenile hormone 間の想定される調節ネットワークを示しています。USP単独のノックダウンでは juvenile hormone に変化は見られませんが、VGとUSPのダブルノックダウンでは、VG単独のノックダウンよりも juvenile hormone の大幅な増加が引き起こされます。

このことは、vitelliが幼若ホルモンの産生を抑制するだけでなく、USPノックダウンに対する幼若ホルモンのフィードバック応答も抑制していることを示唆しています。ダブルノックダウンにおいて幼若ホルモンの産生が劇的に増加するのは、VGノックダウンによるVI geninからの抑制減少と、USPノックダウンによる幼若ホルモン伝達の減少に対する代償的応答の結果です。この調節ネットワークに関するより詳細な考察は、付属のプロトコルテキストに記載されています。

二重遺伝子ノックダウン法を用いることで、単一の遺伝子を抑制しただけでは発見できなかった、vital genic、ultras、spherical、および幼若ホルモンの詳細な関係を明らかにしました。現在、この手法を用いることで、研究者は制御ネットワーク内における遺伝子間の相互関係を探索することが可能です。PRはミツバチの味覚知覚を測定するために用いられる標準的な手法ですが、ハンドリングに対して非常に敏感であるため、動物の環境およびハンドリングの一貫性を維持する際には細心の注意を払う必要があります。

さらに、アッセイを数日間にわたって行う場合は、簡潔なタイムラインを作成し、天候や環境に変動がないか注意深く監視することが推奨されます。