Name: におけるプロスタグランジンの抽出と分析線虫（Caenorhabditis elegans） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 学ぶプロスタグランジンとエイコサノイドの抽出・分析手法。Caenorhabditis elegansを用いたLC-MS/MSによる高感度・高特異的な脂質代謝物測定法で、新規代謝物の同定と既知プロスタグランジンの定量が可能です。

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私たちは、UAB皮膚病研究センター（C. ElmetsへP30 AR050948）、A. AgarwalさんにUAB-UCSDオブライエン急性腎傷害センター（P30 DK079337によって部分的にサポートされていUAB標的メタボロミクスとプロテオミクスラボラトリーに感謝）とUAB肺保健センター（JEブラロックにR01 HL114439、R01 HL110950）。質量分析計のサポートはNCRR共有装助成（S.バーンズにS10 RR19261）からだった。また、テクニカル·サポートのためにレイ·ムーアに感謝します。C.虫株はNIHによって資金を供給される線虫の遺伝学センターによって提供された。この作品は、NIH（ARRA行政サプリメント含むR01GM085105にMAM）によってサポートされていました。

ワームの文化、プロスタグランジンの抽出、およびプロスタグランジンの分析：以下のように記述されたプロトコルは、次の3つのセクションに分かれています。上述のようにサンプルを一時的に-80°Cまたは-20℃で保存することができる場合に、複数のポイントがある 1。ワーム文化我々は包括的LC-MS/MSのための混合ステージワームの約6グラムをお勧めします。これは、検出、少なくとも6つの別々の注射のために十分な材料を提供する必要があります。単回注射または2つでMRMによって知らPG類の定量化、1-2 gで十分です。特定の段階からなる同期さ培養物からの抽出物の分析も可能である。最大4つの異なる株には同時に成長させることができる。例えば、野生型コントロール3つの異なる変異株。 <ol><li>補足給餌のために65（16 cm）のX-ラージNGMプレートと集中細菌を準備します。播種用NA22バクテリアを使用してください。補足給餌、GROのために濃縮された細菌を作成するにはW 16-24時間、LB培地でNA22の少なくとも4リットル。 M9バッファー100mlに、スピンダウンして上清を除去し、再懸細菌。この濃縮された細菌溶液200〜400mlをそれぞれウォーム株について必要とされ得る。 4℃で保存</li><li> 5 X-ラージプレート上にワームの培養を開始します。プレートは妊娠成人のいっぱいになるまで約3〜4世代に渡ってワームを育てる。 （〜1ミリリットル/プレートと蓋を交換する前に、完全に乾燥させて）、必要に応じて、飢餓を防ぐために、濃縮された細菌は、プレートに追加する必要があります。 </li><li> M9バッファーでプレートから妊娠雌雄同体を洗い、50 mlコニカルポリプロピレンチューブにワームを集める。 </li><li>妊娠雌雄同体が下（通常は約3〜5分）に落ち着くことができます。細菌、卵、幼虫期のワームを含む上清を取り除きます。 15ミリリットルM9バッファーに再懸濁し、穏やかに混合する。 </li><li> 60シードNGMプレートのそれぞれにワームの懸濁液を200μlを移す。プレート全体でワームを分散させる。ワームソリューションは混在しておくよく、すべてのプレートまで、彼らはワームのほぼ等しい数値を受け取ることを保証するためにシードされています。 </li><li>飢餓を防ぐために、必要に応じて濃縮された細菌とサプリメント（〜1 ml/plate/12〜24時間周期）。プレートは蓋を交換する前に空気乾燥させ。シードワームの元の数に応じて、2-4の世代のためにワームを育てたり、プレートは妊娠成人のいっぱいになるまで。 </li><li>収穫のワームプレート一度に1株。 M9バッファーでプレートからワームを洗浄した50mlポリプロピレンチューブ（ 例えば、6管）で収集しています。プレートを洗浄するためにM9のバッファを使用し、その後、次のプレートにワームに満ちたバッファを転送します。プレートの数（ 例えば 10 番目 ） を洗浄した後、50ミリリットルチューブにワームに満ちたバッファを転送します。 M9バッファーで一番上にチューブを埋める。プレートの残りのための洗浄を繰り返します。 </li><li>妊娠大人が5-6分で底に沈むように、上清（約35ミリリットル）を削除し、1つまたは2つのチューブに統合する。 FRで50 mlにチューブを埋めるESH M9バッファは、3〜5分間放置し、上澄み残し妊娠成人を削除しましょう​​。 3回繰り返したり、上清が透明になるまで。 </li><li>大口径パスツールピペット、2を15mlポリプロピレン製コニカルチューブにできるだけ多くのワームなどの転送を使用。臨床遠心機で5分間1,000 RCF（CentraSL2で〜3,500 rpm）でスピンダウン。上清を除去し、すべてのワームを同じチューブに移して、ペレット化されるまで繰り返します。 -80℃で可能と店舗ワームなど多くの上澄みとして削除℃にすべての株について、この手順を繰り返します。 </li></ol> 2。プロスタグランジンの抽出抽出のために必要な試薬を以下に示す。方法はゴロフコおよびマーフィー17のそれから変更及びLC-MS/MS感度を向上させる液液精製、続いてアセトン抽出を含む。同様の結果がダウンスホモジナイザーを得ることができるものの、弾丸ブレンダー5ホモジナイザーは、プロシージャで使用されている。ブチルhydroxytolueね（BHT）と窒素下で蒸発させ（N 2）ガスは、酸化を防止するために使用される。すべてのガラス製品は、脂質結合を減らすために（Sigmacote）シリコーン処理されるべきである。有機溶媒で抽出し、化学フード内で行われるべきである。 <ol><li>を50mlポリプロピレンコニカルチューブ重量を量る。 6.5ミリリットルマーク近くホットかみそりの刃で管を通って切断することによって-80℃で保存15ミリリットルコニカルチューブから冷凍ワームの約6.0グラムを転送します。メタノール洗浄しスパチュラは、管の底から凍結ウォームペレットを除去するために使用することができる。ペレットの上部から下部には、低密度幼虫ワームや残留細菌を取得するためにペレットを切断することで残されている。 </li><li>予め秤量50ミリリットルコニカルチューブに凍結したワームを転送します。複数のサンプルが処理されている場合は、比較研究のために組織の同量（6.0 g）を使用する。ペースト状にワームの雪解けのように、所望の質量を得るために、へらでワームを追加または削除する。オプション：広告抽出効率のための内部統制としてPGF2α-D4規格のD 1.00 ngの。 </li><li>ワームの懸濁液に0.005％のBHTと氷冷2時01アセトン/生理食塩水12ミリリットルを加え、ボルテックスでよく混ぜる。弾丸Blenderの使用のために12 5ミリリットル自立プラスチックチューブのそれぞれにワームスラリーの1.5ミリリットルを分注する。 </li><li>セリアは、各5ミリリットルチューブに酸化ジルコニウムビーズを安定直径0.5mmの0.7〜0.8ミリリットルを追加します。しっかりとキャップを閉め、ブレットブレンダー5ホモジナイザーに12チューブをロードします。速度は8-9で3分間ブレンダーを実行し、氷の上でチューブを置きます。非常にしっかりとキャップを閉じ、またはコンテンツがこぼれることを確認してください。ステレオスコープを使用して、スライド上の1つの管からホモジネート10μlのを確認してください。残りのごく少数そのままワームがあるはずです。必要であれば、別の分のために同じ速度で繰り返します。 </li><li>均等に9 &quot;パスツールピペットを用いて4個の10 mlコニカルガラス管にホモジネートを移す。ビーズを転送することは避けてください。seque 3本のチューブから、ビーズを洗浄ntially 1時02アセトン/生理食塩水を含むBHT 1mlで。すべてのビーズを洗浄されるまで、他のチューブについて、この手順を繰り返します。を10mlのガラス管に残った溶液（約4 ml）を移し、氷の上に置きます。 </li><li> 4℃で10ミリリットルのガラス管を遠心℃で10分間〜1,000 xgで臨床遠心分離機でC。各チューブからクリーンの10mlガラスコニカルチューブに上清を移す。 </li><li>化学フード中で、それぞれを10mlのガラス管に等量のヘキサンを加える。例えば、3.5ミリリットルアセトン/食塩水に3.5ミリリットルのヘキサンを追加します。 30秒最大速度でボルテックス。 </li><li> 4℃で10ミリリットルのガラス管を遠心℃で10分間〜1,000 xgで臨床遠心分離機でC。ヘキサンを含む上相と中性に荷電脂質を捨てる。 </li><li> 2 Mギ酸（ - 150μlの約100）を使用してpHを3.5に下相を酸性化。 pHのストリップを使用してpHをテストします。 </li><li>各チューブに等量のクロロホルムを加える。 30秒最大速度でボルテックスと4でチューブを遠心°C I10分間〜1,000 xgでNA臨床遠心分離機。 </li><li>上部の水相を取り外し、廃棄します。相間を避け、下クロロホルム相に残留乳白色の相間を通してピペットの先端を挿入します。新しい15 mlコニカルガラス管から4管のそれぞれから下相を収集します。少なくとも24時間、-20℃でインキュベートする。この時点で、抽出物は、最大2週間まで、-20℃で保存することができます。 </li><li>冷凍庫からエキスを取り出し、存在する場合は、残りの乳白色の水性のトップ層を捨てる。新しいパスツールピペットを用いて標識テフロン並ん½-ドラムのガラスバイアルにクロロホルム相を転送します。化学フードでは、N 2ガ ​​スの穏やかな流れの下で乾燥するまでクロロホルム可溶性画分を蒸発させる。乾燥した抽出物は、最大2週間まで、-20℃で保存することができます。 PG抽出および分析のために使用される全体的なスキームを図1に示されている。 </li></ol> 3。プロスタグランジンの分析<ol><li>株式を準備ワーキング溶液を調製し、水（8:2 v / v）の：そのようなPGF2αまたはPGF 2メタノール中α-D4（1μgの/ ml）のように、メタノールで希釈し、個々の基準プロスタグランジンのソリューションを提供しています。標準曲線を生成するために希釈系列（100、10、1、0.1、0.01 ngの/ ml）を調製する。 </li><li>乾燥されたCに水（8:2 v / v）の：200μlのメタノールを追加elegansの脂質抽出物（s）と徹底的に混ぜる。水溶液：ワーム組織未満の6グラムが抽出された場合は、乾燥された抽出物をメタノールの少ないボリュームに再懸濁させなければならない。 </li><li>水中0.1％ギ酸からなる移動相を調製[A]、0.1％ギ酸を含むアセトニトリル[B]。 </li><li> 4℃でオートサンプラを設定し、70カウント1.5 mlのバイアルラックにサンプルバイアルを置きます。 </li><li>約5分間で0.2ミリリットル/分の流速で、0.1％ギ酸とのシナジーハイドロRP-C18カラムを平衡化する。 </li><li>カラムにサンプル（20-50μL）を注入します。グラジエント溶出スタートを実行り、10％Bで0-11分と、11〜14分で80から100パーセントのBから80％のBまで行くと16分で10％Bに戻っ。合計実行時間は20分である。 13標準品の保持時間は、基準3は、表1に示す。 </li><li>負イオンモードで動作してESIインターフェースを使用して質量分析計へ流出列を導入する。窒素は、ネブライザー、カーテンガス（CUR = 10）として使用される。衝突ガス、衝突エネルギー、および温度は、それぞれ、10、-35 eVで、600°Cに設定されている。デクラスタリング電位（DP）、衝突エネルギー（CE）、および細胞出口電位（CXP）は、それぞれ、-90、-35、-10に設定されている。 </li><li>調査スキャン（Q1スキャン）の場合は、ほとんどのPGは（ 図2） のm / z 315から360までの質量範囲でマイナスイオンモードを使用します。範囲は、関心のある化合物の質量に応じて、変更することができる。 LC-MSイオンクロマトグラムの総イオン電流（TIC）からイオンを抽出し、抽かどうかを判断するテッドイオンが脱プロトン化又は付加物イオンに相当する、またはフラグメントイオンに関する。 </li><li> MRM実験では、質量遷移のためのm / z 311分の355はF1クラスを検出するために使用され、 のm / z 193分の353 F2クラスに使用され、およびm / zの 193分の351又は191分の351は、F3クラスのために使用され（ 図3）。 MRMは、内部標準（例えば、 のm / z 197分の357 PGF2α-d4のために）検出し、標準曲線を生成するために使用される。マーフィーらを参照してください。PG質量遷移18に関する追加情報。 </li><li> MS / MS実験では、F1クラスのm / z 353for F2クラス、およびm / zの 351for F3クラスPGのためのm / z 355を使用しています。Cで FシリーズPGのためのエレガンス MS / MSデータを図4および表2 3,16で利用可能です。哺乳類エイコサノイド用MS / MSデータがで利用可能です<a href="http://www.lipidmaps.org" target="_blank">www.lipidmaps.org</a> 。 </li><li> Analysを使用して分析データを処理Tソフトウェア（バージョン1.4.2、アプライドバイオシステムズ社）。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、利害の衝突を持っていません。

私たちは、FシリーズPGのに焦点を当て、エイコサノイド抽出および分析のための手順を説明します。問題となる可能性がある手順のいくつかの部分があります。まず最初に、それは飢餓がPG代謝を変えることができますようにワームの文化が、餓死しないことが重要です。 NA22は、より高い密度に達したので、補足的な給餌の場合、NA22細菌がより一般的に使用さOP50細菌の代わりに推奨されています。しかし、NA22株は抗生物質耐性を欠き、汚染を受けやすい。第二に、ワームは、哺乳動物の組織に比べて低濃度では、個々のPG異性体を合成する。これは部分的に、多数の異性間の冗長性に起因することがあります。我々は包括的な分析と強い信号のための組織の約6グラムをお勧めします。 PG濃度を増加させる水溶液：乾燥した抽出物を減らすメタノール中に再懸濁されている場合より少ない組織（1-2 g）を用いることができる。しかし、1〜2回の注射を行うことができる。我々のLC-MS/MS系の検出限界は10 pgの程度であるPGF2α/ mlの。密集混在ステージワームの一つミリリットル（約1g）がCePGF2の約25-50 pgのが得られます。より高感度な質量分析システムは、分析に必要なウォーム組織の量を低減することができる。第三に、サンプル間のPG抽出効率の違いは、変数の結果を引き起こす可能性があります。我々は、組織を並列に抽出する際の抽出効率は非常に類似していることを見出した。効率性を判断するには、内部統制などの均質化工程でPGF2α-D 4の1.0 ngのを追加します。質量遷移のm / z 197分の357を使用して、MRMは1 ngの/ mlの標準溶液に対してPGF2α-d4の濃度を測定するために使用される。抽出中に失われたPGF2α-dの4の量を算出する。 我々が含むクロマトグラフィパラメータおよび質量遷移は、他のPGとエイコサノイドを検出するように変更することができる。かなりの努力にもかかわらず、我々は、D-シリーズまたはE-SERを識別することができていないIESは抽出17 PGS。さらに、我々はPG立体異性体19の非選択的な混合物を生成し、フリーラジカル開始過酸化、の特徴である8 -イソPGF2αと8 -イソPGE 2を検出していない。ワームは、他のPG型を合成するかどうかは不明である。カンナビノイドとアラキドンとエイコサペンタエン酸の様々なエポキシ樹脂とヒドロキシ代謝物はCで発見されている虫は 5,7,20,21を抽出します。我々はそれぞれ、定量と同定のための本格的な標準規格に比べMRMとMS / MSの両方の使用をお勧めします。小説エイコサノイドの場合は、これらの分析が可能であれば、PUFA合成酵素22と同様に、機能アッセイに欠損している変異体脂肪の比較研究と組み合わせる必要がある。 脂肪変異体を分析する注意点は、ワームに存在するPUFAの微量はPG合成のために十分であるということです。例えば、 脂肪-2（wa17）変異体D12デサチュラーゼ活性を少量（野生型22〜5％）があり、これらの変異体は、まだPGの6を生成する。 脂肪-3（WA22）と脂肪-4（WA14）変異体はアラキドン由来のPGとエイコサペンタエン酸16を合成するために失敗する。我々はまた、 脂肪変異体が残りのクラスからアップレギュレートPG合成によるPUFAクラスの損失を補償することを見出した。例えば、 脂肪3（WA22）変異体は、20 -炭素のPUFA由来最もPG類を合成するために失敗する。代わりに、彼らは、18 -炭素PUFAは16由来の新規のPG類をアップレギュレートするように見える。これまでに、我々はCを確認されていませんPG合成を完全に欠損しているエレガンス株 。また、PGは、成長や開発に必須であることが可能である。

プロスタグランジン（PG類）は広く生物12-14の広い配列に再生、免疫、および開発の調節に調査し、関与している脂質ホルモンの重要なクラスである。彼らは共通の前駆体（S）から派生した脂質のシリーズを構成するためのPGは、理想的には包括的なシステム生物学の分析に適しています。線虫C.エレガンスは、遺伝学とシステム生物学の基本的な質問に対処するために最も広く使用されているモデル生物の一つである。 私たちは、実証されていることでエレガンスは、FシリーズのPG類を合成し、その卵母細胞3,6,16に精子ガイド。それぞれ3つ、4つ、5つの二重結合を含むF1、F2、およびF3クラスで20個のPUFAの由来のFシリーズのPGは、3,16同定されている。これらのPGは、シクロオキシゲナーゼ酵素の独立した合成、まだPGF1αとPGF2α立体異性体はまだGEあるさnerated。 Cの定性·定量分析のためのelegansの PGは、LC-MS/MSは、強力で高感度な分析手法である。この分析を実行する前に、分析プロセスの性能が大きくエキス品質に依存するため、最適化された抽出方法を開発することが重要である。液体クロマトグラフィーおよび質量分析は、比（m / z）を充電するために予想される質量、ならびにPG親イオンの望ましいピーク形状および保持時間を提供することができる。 CのPG類の代謝プロファイリングエレガンスは、様々なMSの買収戦略を必要とする困難な作業である。 LC-MSフルスキャンまたはアンケート走査（スキャンQ1）は、ほとんどのイオン化質量分析のPGは、応答を生成する保証するという利点を有する。サーベイスキャンは、野生型と変異型C.に関してのPG合計プロファイリングに関する有用な情報を提供していますがエレガンス 、マイナーPG類の検出は低感度のために危険にさらされます。いえ、以下、LC-MS調査走査のPGの全体像を与え、大きなPG集団の代謝に影響を及ぼすことが予想変異を分析するために特に有用であることができる。 代謝物の同定においては、化学的に合成された規格のPG LC-MS/MS分析は、最初の参照化合物としてのプロダクトイオンスペクトルを得るために行われる。これらのスペクトルは、未知の代謝物のスペクトルと比較することができる。多重反応モニタリング（MRM）モードが強化された感度および特異性のために使用される。 MRM実験は、化合物の親イオン/プロダクトイオン質量遷移を指定することによって達成される。標的分析物の質量と構造を知ることによって、それは多くの未知の代謝物の理論MRM遷移を予測することが可能である。 Cの異性体のPGをプロファイリングするための最適化されたLC-MS/MS法線虫は報告されていない。ここでは、LC-MSとからなる抽出および統合された質量分析アプローチを説明して、LC検出、定量化、 およびCを調査するためのMS / MSメソッドelegansの PG代謝物。このアプローチは、他のエイコサノイドに適用することができる。

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</strong</td></tr><tr><td>>X-large (16 cm) プレート</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td></td> 0875714<td></td></tr><tr><td>大腸菌 NA22</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>NA22</td><td><a href="http://www.cgc.cbs.umn.edu" target="_blank">http://www.cgc.cbs.umn.edu</a></td></tr><tr><td>アセトン, 399.5%</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>A928-4</td><td></td></tr><tr><td>ブチル化ヒドロキシトルエン</td><td>MPバイオメディカル101162</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘキサン、HPLCグレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>H302-1</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸、399%</td><td>アクロス</td><td>AC27048-0010</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td></tr><tr><td>クロロホルム、HPLCグレード</td><td>アクロス</td><td>AC26832-0010</td>フィ<td>ッシャーを通じて入手可能科学</td></tr><tr><td>的なPGF2&alpha;-d4</td><td>ケイマン ケミカルズ</td><td>316010</td><td>ケイマンには、購入可能なさまざまな標準があります</td></tr><tr><td>滅菌スクリュー キャップ自立型 5 ml チューブ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>14-222-651</td><td>バレット ブレンダー</td></tr><tr><td>0.5 mm 酸化ジルコニウム ビーズ</td><td>次へ >>>Advance</td><td>ZrOB05</td><td></td></tr><tr><td>10 mlガラス円錐形ヘビーデューティ目盛り遠心分離管</td><td>Kimble Kimax</td><td>45200-10</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td></tr><tr><td>15mlガラス円錐管</td><td>コーニングパイレックス</td><td>8082-15</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td></tr>ック<tr><td>シグマコート(シリコン化試薬)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>SL2-100ML</td><td></td></tr><tr><td>テフロンライニングキャップ付き1/2ドラムガラスバイアル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>V1235C-TFE</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>CentraSL2臨床遠心分離機</td><td>トーマスサイエンティフィック</td><td>2517N92-TS</td><td></td></tr><tr><td>弾丸ブレンダー5ブルーホモジナイザー</td><td>次へ >>>Advance</td><td>BBY5MB</td><td>A 40 ml Dounce ホモジナイザーは、Synergi</td></tr><tr><td>4 &mu;m ハイドロRP 80 &#197;LCカラム 250 x 2.0 mm</td><td>Phenomenenex</td><td>00G-4375-B0</td><td>HPLC</td></tr><tr><td>Column SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm</td><td>Phenomenenex</td><td>AJ0-7510</td><td></td></tr><tr><td>SecurityGuard Guard Cartridges Kit</td><td>Phenomenenex</td><td>KJ0-4282</td><td></td></tr><tr><td>島津製作所 プロミネンス HPLC 冷蔵オートサンプラー付</td><td>島津製作所 サイエンティフィックインスツルメンツ</td><td></td><td>標準的なHPLCシステムとトリプル四重極質量分析計を組み合わせたものであれば十分です</td></tr><tr><td>API 4000トリプル四重極質量分析計</td><td>Applied Biosystems/MDS SCIEX</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> <table border="1"> <tbody> <tr> <td colspan="2">M9バッファーレシピ(4リットル)<td> </tr> <tr> <td>12 g</td> <td>KH<サブ>2</サブ>PO<サブ>4</サブ></td> </tr> <tr> <td>24 g</td> <td>Na<サブ>2</サブ>HPO<サブ>4</サブ></td> <tr> <tr> <td>20 g</td> <td>NaCl</td> </tr> <tr> <td>最大4リットル</td> <td>脱イオン水</td> </tr> <tr> <td colspan="2">1リットルボトル8本分まで。オートクレーブと冷却.</td> </tr> <tr> <td>0.5 ml/bottle</td> <td>1 M MgSO4</td> </tr> </tbody> </table> </td></tr></tbody></table>

におけるプロスタグランジンの抽出と分析<em&gt;線虫（caenorhabditis elegans）</em

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

線虫（Caenorhabditis elegans）は、脂質1-9の生物学を研究するための強力な動物モデルとして浮上している。プロスタグランジンは、多価不飽和脂肪酸（PUFAは）10-14由来脂質信号でエイコサノイドの重要なクラスである。これらのシグナル伝達分子が低いため豊かさと反応性の性質を研究することは困難である。プロスタグランジンの特徴は、脂肪酸の主鎖内に位置するシクロペンタン環構造である。哺乳類では、プロスタグランジンは、シクロオキシゲナーゼ酵素依存性および非依存性経路10,15を貫通して形成することができる。℃でエレガンスは、シクロオキシゲナーゼ6,16,17の独立したプロスタグランジンの広い配列を合成する。 Fシリーズのプロスタグランジンの大きなクラスは識別が、エイコサノイドの研究は、新しい発見の余地と早い段階にありました。ここでは、プロスタグランジンおよび他のエイコサノイドを抽出して分析するための手順を説明します。荷電脂質sが液 - 液抽出法を用いた質量ワーム培養物から抽出し、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（LC-ESI-MS/MS）に結合液体クロマトグラフィーによって分析する。内部標準などPGF 2のようなプロスタグランジン、α-D 4の重水素化類似体の包含は定量分析のために推奨されます。多重反応モニタリング又はMRMは、野生型および変異動物との間に特定のプロスタグランジンの種類を定量化して比較するために使用することができる。衝突誘起分解又はMS / MSは、重要な構造的特徴に関する情報を得ることができる。液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）は、 のm / z 315から360として選択された質量範囲の調査スキャンは、プロスタグランジンレベルのグローバル変化を評価するために使用することができる。我々はすべての3つの分析の例を示します。これらのメソッドは、新規エイコサノイドを発見し、その代謝経路の輪郭を描くためのツールセットを研究者に提供します。

試料調製はゴロフコとマーフィー17から適応液-液抽出を行った。これは、内部標準（PGF2α-D4）の優れた回復を提供した。 CからPGを抽出するための一般的なスキーム線虫は、 図1に示されている。クロマトグラフィー条件は&gt; 30エイコサノイド基準（ 表1は 13規格を示す）のベースライン分離を提供するために最適化された。 0.1％ギ酸を含む水とアセトニトリルとハイドロ-RPカラム（250×2.0ミリメートルidは）最良の分離と感度を提供しました。野生型および脂肪3変異体抽出物の調査スキャンは315から360原子質量単位の質量範囲でイオンの図2文書グローバルレベルに示す。 脂肪-3（WA22）変異体はほとんどの20 -炭素のPUFAを欠いている。 F3クラスPGが強調表示されます。 図3では、野生型抽出物のMRM分析は、F1（ 図3Aの複数のPG異性体を示す</stro<html> NG&gt;）、F2（ 図3B）、およびF3（ 図3Cおよび3D）クラス。 F3クラスは、2つの質量遷移のm / z 193分の351またはm / zの 191分の351のいずれかを検出することができる。 CePGF2は主にPGF2αの鏡像異性体で構成されています。 CePGF1はPGF1αまたはその鏡像異性体である可能性が高い。 図4に示すCePGF2の衝突誘起分解（RT = 11.8）PGF2α標準（RT = 11.8）と比較。プロダクトイオンのわずかな違いは、おそらく抽出物中の低CePGF2豊富と共溶出化合物によるものである。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig1.jpg" /> 図1。 C.の概略図エレガンス PGは抽出とLC-MS分析 。両方の脂質酸化を最小限に抑えるための0.005％のBHTを持つアセトン/生理食塩水及びクロロホルムことに注意してください。詳細については、テキストを参照してください。https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。 <img alt="図2" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2.jpg" /> 図2。野生型のm / z 315から360と脂肪-3（WA22）変異体抽出物の調査をスキャンします。液体クロマトグラフィーの保持時間（RT）がパネルに表示されます[A]。 RT = 11.3で抽出されたイオンは、野生型[B]と脂肪-3（WA22）[C]抽出のために示されている。質量のm / z 351とF3クラスPGが強調表示されます。 CPS、カウント/秒; AMU、原子質量単位。 <img alt="図3" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3.jpg" /> イチジクURE 3。野生型の抽出物のMRM分析。F1クラスPGは、質量移行のm / z 311分の355 [A]で検出されています。 PGはなさそうであり、いくつかの疎水性化合物（RT&gt; 14分）にも、この移行で検出されていることに注意してください。 F2クラスPGは、質量移行のm / z 193分の353で検出されている[B]。 F3クラスPGは、質量移行のm / z 193分の351のいずれかで検出された[C]またはm / zの 191分の351 [D]。抽出物はそれぞれのクラスの複数のPG異性体を含んでいることに注意してください。番号は、 表2に示すのPGに相当する。 CePGF2の濃度は1.8 ngの/ mlである。 RT、保持時間、CPS、カウント/秒。 <img alt="図4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4.jpg" /> 図4。化学的にシンセの衝突誘起分解PGF2αとCePGF2 esized。パネルの矢印[A] PGF2αとCePGF2（RT = 11.8）との間で共有され、製品や断片化イオンを示す。 のm / z 309およびm / zの193のプロダクトイオンが示された構造に対応して指定された切断部位（aとb強調）から生成され、F-シリーズのPGの特徴である[B]。さCPS、カウント/秒。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig4large.jpg" target="_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 標準 </td><td> RT（分） </td><td> [MH] - のm / z </td><td> MS / MSでキー生成イオン </td></tr><tr><td> 20 -ヒドロキシPGE 2 </td><td> 9.43 </td><td> 367 </td><td> 349、331、287、234、189、129、109 </td></tr&gt; <tr><td> PGF 3 - </td><td> 11.26 </td><td> 351 </td><td> 333、307、289、271、245、219、209、193、191、171、165、111 </td></tr><tr><td>トロンボキサンB 2 </td><td> 11.66 </td><td> 369 </td><td> 289、191、177、169、151 </td></tr><tr><td> PGF 2 - </td><td> 11.80 </td><td> 353 </td><td> 335、309、291、273、263、247、235、209、193、171、165、111 </td></tr><tr><td> PGF 1 - </td><td> 11.79 </td><td> 355 </td><td> 337、319311、301、293​​、275、265、237、211、195 </td></tr><tr><td>リポキシンB 4 </td><td> 12.38 </td><td> 351 </td><td> 201、191189、165、155、115、107、71、59 </td></tr><tr><td> PGD ​​2 </td><td> 12.56 </td><td> 351 </td><td> 315、271203、189 </td></tr><tr><td> 5（S）、6（R） -リポキシン4 </td><td> 12.83 </td><td> 351 </td><td> 235、217、189、144、135、115、99、59 </td></tr><tr><td> PGA 2 </td><td> 14.02 </td><td> 333 </td><td> 315、297、271、235、191、189、175、163、137、113、109 </td></tr><tr><td> Δ12-PGJ 2 </td><td> 14.20 </td><td> 333 </td><td> 271、189、123 </td></tr><tr><td>ロイコトリエンB 4 </td><td> 14.73 </td><td> 335 </td><td> 181、109、93、71、69、59、57 </td></tr><tr><td> 15D-Δ12,14-PGJ 2 </td><td> 16.80 </td><td> 315 </td><td> 297、271、217、203、158 </td></tr><tr><td> 5（S）-HpETE </td><td> 17.88 </td><td> 335 </td><td> 97、83、81、57 </td></tr></tbody></table> 表1。保持時間とLC-MS/MS法 3 から13エイコサノイド基準の主要なプロダクトイオン 。 30以上の基準はLC-MS/MSプログラムを開発するために使用された。クロマトグラフィーの保持時間（RTS）はさえ非常に似ているPGの間で、異なる。例外はPGF1αとPGF2αです。それにもかかわらず、これらのPGは、Dです（ - のm / z [MH]）と衝突誘起分解スペクトル（MS / MS）親イオン質量によってistinguished。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> プロスタグランクラス </td><td> 図3の番号 </td><td> [MH] - のm / z </td><td> MS / MSでキー生成イオン </td></tr><tr><td> F1（CePGF1） </td><td> 1 </td><td> 355 </td><td> 319、301、311、293​​、275、265、237、223、211、195、157 </td></tr><tr><td> F1 </td><td> 2 </td><td> 355 </td><td> 311、301、293​​、275、265、211、195、167、157 </td></tr><tr><td> F2（CePGF2） </td><td> 3 </td><td> 353 </td><td> 309、291、273、263、247、209、193、171、165、127 </td></tr><tr><td> F2 </td><td> 4 </td><td> 353 </td><td> 309、291、273、263、255、247、219、209、193、171、113 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 5 </td><td> 351 </td><td> 315、307、289、275、249、205、193、191、167、153、139 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 6 </td><td> 351 </td><td> 333、289、271、261、245、223、193、191、163 </td></tr></tbody></table> 表2。いくつかの主要なCの衝突誘起分解生成イオン虫 F1、F2、およびF3のPGは、図3に示す 。他のあまり豊富な異性体のMS / MS示されていない。これらのデータは、複数の分析からのものではなく、すべてのプロダクトイオンは、指定されたランに見えるかもしれません。抽出物の複雑さを考えると、いくつかのより少なく豊富なプロダクトイオンは、干渉から同様の保持時間または結果を持つ別の親イオンから導出してもよい。ピーク2は、おそらくCePGF2の立体異性体である可能性が高いCePGF1とピーク4の立体異性体である。追加データ3用エドモンズら （2010）を参照してください。

本稿では、プロスタグランジンや他のエイコサノイドからを抽出し、分析するために最適化された手順を説明<em&gt; C.エレガンス</em&gt; LC-MS/MSを用いた。

におけるプロスタグランジンの抽出と分析<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

本手順の目的は、sea eleganceの抽出物に含まれるプロスタグランジンおよびその他のエイコサノイドを同定し、定量することである。まず、線虫を大規模培養で増殖させる。次に、液液抽出法を用いて線虫組織から親水性脂質を抽出し、得られた脂質抽出物を質量分析計に接続したHPLCカラムに注入する。次に、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析（LC-MS/MS）のデータを解析します。最終的に、精製した線虫抽出物に対するこのLC-MS/MSアプローチにより、新規代謝物の同定や、Sシリーズプロスタグランジンなどの既知の代謝物の定量が可能です。したがって、酵素免疫測定法などの既存の手法に対する本技術の主な利点は、高感度かつ特異的であると同時に、包括的で柔軟であることです。この技術の実演は、私の研究室の大学院生であるHugh Hongが行います。線虫の補充給餌には、ペレットNA22を使用します。細菌培養液を遠心分離し、上清を捨てて細菌ペレットを100 millilitersのM9バッファーで再懸濁します。濃縮した細菌溶液を4 °Cで保存します。5枚の特大NGMプレートで線虫の培養を開始します。プレートが worms で満たされるまで、3〜4世代にわたって worms の増殖を継続します。飢餓を防ぐため、必要に応じて濃縮細菌液を約 1 mL、 worms プレートに添加してください。蓋を閉める前に、完全に風乾させてください。次に、M9バッファーを用いてプレートから雌雄同体を洗い流します。50 mLの円錐形ポリプロピレンチューブにワームを回収します。その後、ワームが底に沈殿するまで待ちます。細菌の卵および幼虫期の虫体を含む上清を廃棄します。次に、残った虫体を15 millilitersのM9バッファーに懸濁させ、穏やかに混合します。この虫体懸濁液を、種まき済みのNGMプレート60枚に、1枚あたり200 µLずつ分注します。すべてのプレートに播種が完了するまで、各プレートにほぼ同数の個体が分配されるよう、線虫懸濁液を十分に混ぜ合わせ続けてください。線虫をプレート上に分散させます。線虫を2〜4世代にわたって培養し、12〜24時間ごとに1枚のプレートにつき1 mLの濃縮細菌を添加してください。プレートがGR成体で満たされたら、系統ごとに線虫を回収します。M9バッファーでプレートから線虫を洗い流し、6本の50 mLポリプロピレンチューブに移します。チューブにM9バッファーを満たし、線虫を洗浄します。成虫が底に沈殿したら、上清を約35 milliliters取り除きます。次に、線虫を1本または2本のチューブに回収します。大口径のパスツールピペットを用いて、M9洗浄を3回、あるいは上清が透明になるまで繰り返します。できるだけ多くの虫を15 milliliterのポリプロピレン製コニカルチューブに移します。1000 RCFで5分間遠心分離し、上清を捨てます。他の系統についても、回収、洗浄、集約の手順を繰り返します。採取した線虫株のストックを-80°Cで保存します。赤熱させたカミソリの刃を用いて、ポリプロピレン製コニカルチューブの重量を記します。採取した線虫を含む凍結したポリプロピレンチューブを、6 mLの目盛付近で切断します。無菌条件下で行う。約6gの凍結した虫ペレットをサンプルチューブに移す。1ngの内標準物質と12mLの氷冷アセトン生理食塩水を加える。BHT混合液を用い、1.5 mLの線虫スラリーを、5 mLの自立型プラスチックチューブ12本に均等に分注します。安定化ジルコニアビーズを0.7 mL加えます。必要に応じて、線虫懸濁液を均質化してください。9インチのパスチャーピペットを使用し、無傷の虫が10%未満になるまで、この工程をさらに1分間繰り返します。ホモジネートを、ビーズが入らないように注意して4本の10 mL円錐形ガラスチューブに分注します。3本のチューブからビーズを回収してまとめ、BHTを含む1 mLのアセトン生理食塩水で洗浄します。残りのビーズ入りチューブについても、この洗浄操作を繰り返します。洗浄液を氷上のガラスチューブに移します。次に、ホモジネートを 1000 Gs で 10 分間遠心分離します。4 °Cで、各チューブの上清を清潔な10 mLガラス製コニカルチューブに移します。次に、化学用ドラフトチャンバー内で、各チューブに等量のヘキサンを加え、最大速度で30秒間ボルテックスします。その後、4 °C、1000 Gsで10分間遠心分離します。ヘキサンと中性脂質を含む上層を廃棄し、2 mMギ酸を用いて下層の水相を酸性化します。pH試験紙を用いてpH 3.5であることを確認します。次に、各チューブに同量のクロロホルムを加え、最大速度で30秒間ボルテックスします。サンプルを4°C、約1000 gで10分間遠心分離します。ガラス製ピペットチップを下のクロロホルム相に挿入し、チューブを傾けて固相界面を避けるようにします。4本のチューブから抽出物を吸い出し、1本の15 mLコニカルガラスチューブにまとめます。ガラス管内の空気を窒素ガスで置換し、-20 °Cで24時間から2週間インキュベートします。抽出物を解凍した後、乳白色の水層が上層に残っている場合はこれを廃棄します。新しいパスピペットを使用してください。化学用ドラフト内で、クロロホルムをラベル付きのテフロンライナー付きDRMガラスバイアル（ハーフサイズ）に移します。窒素ガスを緩やかに流して有機溶媒を蒸発させ、サンプルは-20 °Cで最大2週間保存してください。まず、個々のプロスタグランジン標準物質のストックソリューションをメタノールで調製します。次に、80%メタノールを用いて連続希釈を行い、標準曲線を作成します。続いて、乾燥させたsea elegance脂質抽出物を200 µLの80%メタノールに溶解して分析に供します。サンプルの20〜50 µLを逆相カラムに注入し、テキストプロトコルに詳述されている通り、ネガティブイオンモードESIインターフェースを用いてグラジエント分析を行います。カラム流出液を質量分析計に導入します。衝突ガスを10 electron voltsに設定します。衝突エネルギーは-35 electron voltsに設定します。温度を600 °Cに設定します。デクラッタリング電位を-90 V、セル出口電位を-11 Vに設定し、Analystソフトウェアを用いて、抽出サンプルに含まれる異なるクラスのプロスタグランジンを分析するための標準曲線を作成します。データを処理し、線虫抽出物中に存在するプロスタグランジンを同定します。野生型およびfat-3変異虫の抽出物のサーベイスキャンでは、原子量315から360の質量範囲におけるイオンの全体レベルが示されています。野生型虫と比較して、fat-3変異体では、F3系プロスタグランジンに代表されるほとんどの20炭素PFASが欠損しています。グレーで強調表示された質量電荷比351を用いて、MRM解析により異なるクラスのプロスタグランジンを同定できます。例えば、野生型抽出物にはF1系プロスタグランジンが存在しており、また、より保持時間が長い他のいくつかの疎水性化合物も含まれています。マス・トランジション（質量遷移）を変更することで、F2およびF3系プロスタグランジンのさらなる分析が可能となり、線虫抽出物には各系の複数のプロスタグランジン異性体が含まれていることが示されます。C. elegansのプロスタグランジンの衝突誘起解離（CID）を標準プロスタグランジンと比較することで、期待される開裂部位のプロダクトイオンをマッピングできます。脂質の酸化を防ぐために。適切な予防措置を講じることを忘れないでください。例えば、指示された溶液に抗酸化剤VHTを添加し、抽出液を窒素ガスでパージします。

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JoVE Journal

Biology

生物学

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インビボカエノハブディティス・エレガンスニューロンにおける微小管動態と向きの評価

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Caenorhabditis elegansにおける揮発性性フェロモン抽出と化学吸引アッセイ

学ぶプロスタグランジンとエイコサノイドの抽出・分析手法。Caenorhabditis elegansを用いたLC-MS/MSによる高感度・高特異的な脂質代謝物測定法で、新規代謝物の同定と既知プロスタグランジンの定量が可能です。

におけるプロスタグランジンの抽出と分析

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