MBPベースタギング戦略によってMgm101組換えタンパク質の調製

本手順の目的は、マルトース結合タンパク質（MBP）タグ付け戦略を用いて、MGM 1 0 1などの大きなオリゴマーDNA結合タンパク質を調製することです。まず、e coliで発現させるために、PMLC two Eベクター内のMBPの下流にMGM 1 0 1のオープンリーディングフレームをクローニングします。その後、MBP-MGM 1 0 1融合タンパク質を、AMLOアフィニティークロマトグラフィーによりe coliから精製します。

次に、MGM 1 0 1をタンパク質分解による切断によってMVPから遊離させ、陽イオン交換クロマトグラフィーによりMVPから分離させます。最後に、サイズ排除クロマトグラフィーを用いてMGM 1 0 1リングを均一になるまで精製します。最終的に、約0.8 milligramsの水溶性MGM 1 0 1が得られます。

1リットルの細菌培養液から、ミトコンドリアのDNA修復に重要なこのタンパク質の生化学的および構造的特性解析に使用できる量を得ることができます。MGM 1 0 1のモルタル結合タンパク質タグ付きバージョンを使用する主な利点は、タグなしバージョンよりも毒性が低く、溶解性が高く、安定性に優れていることです。その結果、大腸菌において天然のMGM 1 0 1タンパク質を高レベルで発現させることが可能になります。

こんにちは、サラ・ヴィッキーです。私はSUNYアップステート医学大学のDr. Jji Tenの研究室でシニアリサーチサポートスペシャリストを務めています。同僚のWan Wongと共に、MGM 1 0 1の発現と精製について実演します。まず、PCRを用いて成熟MGM 1 0 1コーティング配列を増幅し、融合タンパク質の作製を開始します。

切断されることが分かっているMGM 1 0 1のN末端22アミノ酸残基は含めないようにします。ミトコンドリアへの導入後、増幅したMGM 1 0 1を、改変した発現ベクターPM MAL C two Eにおいてマルトース結合タンパク質（MVP）をコードするMAL E配列の下流に配置します。これにより、精密プロテアーゼの切断部位を含むリンカーを介したM-V-P-M-G-M 1 0 1融合タンパク質が生成されます。このプラスミドは、まずブルーホワイト選択を用いずにE. coli形質転換体を選択することで構築します。

得られたプラスミドpLC2E-MGM101を大腸菌株BL21(DE3)-CodonPlus RILに導入し、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを含むLBプレート上で培養します。まず、新鮮な10 mLの補完LB培地に大腸菌形質転換体を接種し、37 °Cで200 RPMで振とうしながら一晩培養します。翌日、この前培養液10 mLを2 Lの補完LB培地に接種します。

細胞を37°Cで振盪培養します。OD 600が0.5に達したとき、最終濃度0.3 mMとなるようにIPTGを添加し、M-B-P-M-G-M 1 0 1融合タンパク質の発現を誘導します。その後、細胞を30°Cで5時間振盪培養します。5時間後、培養液を500 mLの遠心ボトルに移し、遠心分離によって細胞を回収します。

上清を捨てた後、プロテアーゼ阻害剤を含むライシスバッファーを30 milliliters加え、ピペッティングにより細胞ペレットを再懸濁します。次に、細胞懸濁液を氷上で20秒間ソニケーションします。超音波処理装置を50%duty cycleで用いた後、細胞を氷上で30秒間冷却します。

その後、超音波処理と冷却のステップをさらに2回繰り返します。懸濁液を氷上に保持したまま、2 mg/mLの溶液を1 mL加えます。

DNAs oneストックを細胞溶解液と共に4°Cで2時間振盪させます。2時間後、36 mLの溶解液に5 M塩化ナトリウムを4 mL加えることで、最終塩濃度を500 mMに調整します。

次に、細胞残渣を除去するために、4°Cで10,000 ×gにて30分間遠心分離します。上清を新しいチューブに移します。この時点で、20 µLのアリコートを用いて、超音波処理による溶解効率を確認することができます。

SDS-PAGEゲル上。次に、細胞溶解液をアミロースカラムに通します。MVP MGM 1 0 1 融合タンパク質を精製するには、まず15 mLコニカルチューブに50% AMLOレジンスラリーを1.5 mL加えることから始めます。

次に平衡化を行うため、13 millilitersの溶解バッファーを加え、2000 ×gで5分間遠心分離します。この洗浄操作をさらに4回繰り返し、その後、レジンを0.75 millilitersの溶解バッファーに再懸濁します。平衡化したAMLOスラリーを細胞溶解液に加え、4 °Cで一晩緩やかに揺盪させます。

翌日、ライセートとアミロースレジンの混合液を、コールドルームに設置したエコノカラムクロマトグラフィーカラムにロードします。ストップコックを開き、結合しなかったタンパク質を重力ろ過により回収チューブに通過させます。次に、300 mLの洗浄バッファー1を加えてAMLOレジンを洗浄します。

液がすべて通過したら、150 millilitersの洗浄バッファー2で洗浄を繰り返します。本文のプロトコルに従って溶出バッファーを添加し、溶出液（EIT）を回収した後、EITの一部をSDS-PAGEゲルにロードして、M-V-P-M-G-M 1 0 1の収量と純度を決定します。

ゲル電気泳動後、クマシー染色を行うと、約70 kilodaltonsの主要なシングルバンドが確認されるはずである。M-V-P-M-G-M 1 0 1 EITsに50 unitsのprecision proteaseを加え、透析バッファーと共に透析チューブに入れる。4 °Cで一晩かけて切断反応を進行させる。

前回と同様にSDS-PAGEを実施します。切断効率を評価するため、完全に切断された場合は、それぞれMVPとMGM 1 0 1に対応する42および28 kilodaltonsの2本のバンドが現れることを確認します。切断されたMVP MGM 1 0 1を、BioRad biologic DUO flow FPLCシステムに接続したbio scale mini macro prep high Sカートリッジに複数回注入してロードします。

塩化ナトリウム濃度を5 mM、300 mM、500 mM、750 mM、および1000 mMとするステップ塩濃度勾配を適用し、陽イオン交換クロマトグラフィーを開始します。この勾配は、バッファーAとバッファーBを混合することで作成します。流速は0.5 mL/minに設定してください。分画コレクターを用いて2 mLずつ分画を回収します。通常、MGM 1 0 1は500 mMの塩濃度で溶出します。

MGM 1 0 1ピークのフラクションを回収し、SDS-PAGEゲルを用いてタンパク質の純度を確認します。陽イオン交換クロマトグラフィーで得られたタンパク質フラクションを回収し、GF平衡化バッファー中で4 °Cで一晩透析した後、MGM 1 0 1ピークには約28 kilodaltonsの単一のバンドが検出されるはずです。次に、タンパク質をAveva spin 15 R超ろ過スピンカラムに移し、4 °Cで3000 ×gで遠心してタンパク質を濃縮します。

容量が約1 mLまで濃縮されたら、クロマトグラフィー緩衝液で平衡化したキャリブレーション済みのSuperdex 6 Prep GradeカラムにMGM 1 0 1をロードし、クロマトグラフィー緩衝液を用いて流速0.5 mL/minでサイズ排除クロマトグラフィーを開始します。大きなオリゴマータンパク質は早いフラクションに溶出し、小さなタンパク質は遅いフラクションに溶出します。MGM 1 0 1リングは約400 kDaで溶出します。

フラクションコレクターを用いて精製されたMGM 1 0 1ピークの画分を回収し、タンパク質の最終的な品質を確認するために、これらの画分のアリコートを12%SDS-PAGEゲルにロードします。次に、Avevaを用いてタンパク質を濃縮します。4°C、3000 ×gで遠心分離を行います。

次に、タンパク質分注分が入ったマイクロ遠心チューブを液体窒素に2分間浸し、急速凍結させます。サンプルを-80 °Cで6〜12か月間保存します。MGM 1 0 1サンプルを、一本鎖DNA結合アッセイおよび透過型電子顕微鏡による構造可視化に使用します。

電気泳動移動度シフトアッセイの結果は、精製されたMGM 1 0 1が一本鎖DNAに対して強力な結合活性を持つことを示しています。一本鎖DNAプローブは、オリゴマー型のMGM 1 0 1によって、ネイティブポリアクリルアミドゲルのウェルにより強く保持されます。

M GM 1 0 1を400 nanomolar以上の濃度で添加します。これらの電子顕微鏡写真は、MGM 1 0 1の高次構造組織を示しています。調製直後のM GM 1 0 1は、直径20 nanometersの明確なリング状に存在し、これは負染色透過型電子顕微鏡法によって確認できます。

4°Cで数週間保存した後、MGM 1 0 1は超分子ヘリカルフィラメントを形成します。この手法は、一度習得すれば1週間以内に完了させることができます。

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