Name: MBPベースタギング戦略によってMgm101組換えタンパク質の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: 学ぶ MBPタギング戦略による酵母ミトコンドリアタンパク質Mgm101の調製法。アミロース親和性クロマトグラフィー、陽イオン交換、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、大きなオリゴマー環状タンパク質を精製する手法を解説します。

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私たちは、透過型電子顕微鏡で助けステファンウィルキンスに感謝。この作品は、健康グラントR01AG023731の国立研究所によってサポートされていました。

これまでの研究では、Mgm101の最初のアミノ末端22残基がミトコンドリア19へのインポート後に切断されることが示されている。 大腸菌における発現のために、最初の22コドンを欠くMGM101オープンリーディングフレームをPCRで増幅された発現ベクター物pMAL-C2Eの修正版でマルトース結合タンパク質（MBP）をコードする雄配列の下流に配置された。これは、プレシジョンプロテアーゼ（ 図3）のための切断部位を含むリンカーとMBP-Mgm101融合を生成します。プラスミドは、第E.を選択することにより構成されているIPTGおよびXgal白/青選択せずに形質転換体。得られたプラスミド物pMAL-C2E-MGM101その後、E.に導入され、アンピシリンとクロラムフェニコール耐性コロニーを選択することにより、 大腸菌株BL21-CodonPlus（DE3）-RIL。 1。表現、誘導、細胞溶解とのDNase I処理<ol><li> INOCグルコース（0.2％）、アンピシリン（100μg/mlの/ ml）およびクロラムフェニコール（50μgの/ ml）を添加したLB培地10ml（1％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl）中に新鮮な形質転換体をulate。 200 rpmで振とうしながら37℃CO / Nでインキュベートする。 </li><li>上記のように添加したLB培地を2リットルに10ミリリットルの前培養に接種。 OD 600が 0.5に達するまで振とうしながら37℃で細胞を成長させる。 </li><li> 0.3mMの最終濃度イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加することによりMBP-Mgm101融合タンパク質の発現を誘導する。 5時間30℃で振とうしながら細胞を育てる。 </li><li>ベックマンJA-10ローター（5,500×gで、4℃、10分）を使用して、遠心分離により細胞を回収。上清を廃棄した後に、プロテアーゼ阻害剤を含む溶解緩衝液（20mMのトリス-HCl、pHが7.4および1mM EDTA、pH7.4）中（25μMロイペプチン、1μMのペプスタチン及び1mM PMSF）30ml中に細胞ペレットを再懸濁。 </li><li> 20氷上で細胞懸濁液を超音波処理秒超音波プロセッサ（熱機関;モデルW-385）を用いて50％のデューティサイクルで、30秒間、氷上で冷却し、そして2×繰り返すことができる。 </li><li> 2 mg / mlのDNアーゼで1株を1 mlを加える。 2時間4℃で細胞溶解物を揺する。 </li><li> 500mMの最終濃度のNaClを調整します。 </li><li> 30分間、4℃で10,000×gで遠心分離することにより細胞の破片を取り除きます。 </li></ol> 2。アミロースアフ​​ィニティークロマトグラフィーによる精製<ol><li>溶解緩衝液中のアミロース樹​​脂を1.5ml（50％スラリー）を平衡化する。細胞ライセートに平衡化アミロース樹​​脂を追加します。 4℃のCO / Nで優しく揺らし</li><li>寒い部屋に設置エコノカラムクロマトグラフィーカラムにライセート樹脂ミックスをロードします。非結合タンパク質は重力によって列を渡すことができます。 </li><li>洗浄バッファーI（; 400のNaCl、1mMのEDTA、pHが7.4、および0.2 mMのPMSF、20mMのトリス-HCl、pH7.4）で300mlでアミロース樹​​脂を洗ってください。 </li><li>洗浄バッファーII（20mMのT 150mlで洗浄を繰り返し立上り - 塩酸、pHが7.4、NaClが200 mM、1 mMのEDTA、pHは7.4であり、0.2 mMのPMSF）。 </li><li>カラムに、4℃で10分間インキュベートする、収集溶出緩衝液5mlの（; 200mMのNaClを、図1 mMのEDTA、pHが7.4および0.2 mMのPMSF、10mMのマルトース20mMのトリス-HCl、pHが7.4）を追加もっと回溶出を繰り返し。 </li><li>溶出液を組み合わせ、クマシー染色（ 図4）に続いて、SDS-PAGEゲル上で溶出液のアリコートをロードすることにより、MBP-Mgm101の収率および純度を決定します。 </li></ol> 3。プレシジョンプロテアーゼ切断及び陽イオン交換クロマトグラフィー<ol><li> MBP-Mgm101溶出液にプレシジョンプロテアーゼの50単位を追加します。 4℃での切断を行うCO / Nし、透析緩衝液に対して透析中継続することができ（20mMのトリス-HCl、pH7.4の、100mMのNaCl、2mMのDTT、1mMのEDTA、pHは7.4であり、0.2 mMのPMSF） </li><li> SDS-PAGEゲル（ 図5A）の切断の効率を確認してください。 </li><li>複数の注入によって切断MBP-Mgm101を読み込むバイオスケールミニマクロプレップハイSカートリッジのイオンは、Bio-Rad社の生物学的DuoFlow FPLCシステムに接続。 </li><li> 300mMの、5mMの工程の塩勾配を適用することによって、陽イオン交換クロマトグラフィーを開始し、500mMの、混合液（5 mMの塩化ナトリウムによって作成され750mMのNaClを、1,000 mMの、10mMのリン酸ナトリウム、pH7.2の図1 mMのPMSF）とバッファーB（1MのNaCl、10mMのリン酸ナトリウム、pHは7.2、1mMのPMSF）。 0.5ml /分で、流量を設定してください。 Mgm101画分を回収し、SDS-PAGEゲル（ 図5B）上のタンパク質の純度を確認してください。 </li></ol> 4。サイズ排除クロマトグラフィー<ol><li>陽イオン交換クロマトグラフィーからのタンパク質画分を兼ね備えています。 GF平衡緩衝液（; 150mMのNaCl、1mMのEDTA、pH7.4の、5mM 2 - メルカプトエタノール、0.2mMのPMSFを20mM MOPS、pH7.0）中でのタンパク質の透析。 </li><li> 4℃で3,000 xgで回転させて〜1ミリリットルの容積を減らすためにビバスピン15Rの限外ろ過スピンカラムにタンパク質を集中</li><li> Mgm101 OのロードNAはクロマトグラフィバッファー（; 150mMのNaCl、5mMのβ-メルカプトエタノール、1mMのEDTA、pH7.4の、0.2 mMのPMSFを20mM MOPS、pH7.0）で平衡化したスーパーロース6プレップグレードカラムをキャリブレーション。 </li><li> 0.5ml /分の流速でクロマトグラフィーを実行する緩衝液を用いてサイズ排除を開始する。 </li><li>精製Mgm101ピークの画分を集め。タンパク質の最終品質をチェックするための12％SDS-PAGE上の画分のアリコートをロードします。 </li><li>ビバスピン6タンパク質を集中し、その後速やかに-80℃で液体窒素とストアでサンプルを凍結℃に</li><li>一本鎖DNA結合アッセイ（ 図8）および透過型電子顕微鏡（ 図9）による構造可視化のための6-12カ月以内にMgm101サンプルを使用。 </li></ol>

<ol><li>San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+eukaryotic+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of eukaryotic homologous recombination.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).</li>
<li>Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMC1%3A+a+meiosis-specific+yeast+homolog+of+E.+coli+recA+required+for+recombination%2C+synaptonemal+complex+formation%2C+and+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression.</a> Cell. 69, 439-456 (1992).</li>
<li>Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad51+protein+involved+in+repair+and+recombination+in+S.+cerevisiae+is+a+RecA-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein.</a> Cell. 69, 457-470 (1992).</li>
<li>Passy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Dmc1+protein+binds+DNA+as+an+octameric+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).</li>
<li>Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+E.+coli+recA+protein+monomer+and+polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer.</a> Nature. 355, 318-325 (1992).</li>
<li>Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+structure+and+dynamics+in+the+helical+filaments+formed+by+RecA+and+Rad51+on+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).</li>
<li>Conway, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Rad51+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Rad51 filament.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).</li>
<li>Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+allele+of+RAD52+that+causes+severe+DNA+repair+and+recombination+deficiencies+only+in+the+absence+of+RAD51+or+RAD59%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59.</a> Genetics. 153, 1117-1130 (1999).</li>
<li>Bai, Y., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rad52+homolog+is+required+for+RAD51-independent+mitotic+recombination+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).</li>
<li>Paques, F., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+of+recombination+induced+by+double-strand+breaks+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).</li>
<li>Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+novel+recombinases+in+bacteriophage+genomes+unveils+Rad52%2C+Rad51+and+Gp2.5+remote+homologs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).</li>
<li>Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+structure+and+quaternary+organization+of+the+bacteriophage+P22+Erf+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein.</a> J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).</li>
<li>Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rings+and+filaments+of+beta+protein+from+bacteriophage+lambda+suggest+a+superfamily+of+recombination+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).</li>
<li>Ploquin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+basis+for+a+bacteriophage+homolog+of+human+RAD52%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52.</a> Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).</li>
<li>Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MGM101%2C+a+nuclear+gene+involved+in+maintenance+of+the+mitochondrial+genome+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).</li>
<li>Meeusen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mgm101p+is+a+novel+component+of+the+mitochondrial+nucleoid+that+binds+DNA+and+is+required+for+the+repair+of+oxidatively+damaged+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA.</a> J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).</li>
<li>Mbantenkhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mgm101+is+a+Rad52-related+protein+required+for+mitochondrial+DNA+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination.</a> J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).</li>
<li>Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+properly+configured+ring+structure+is+critical+for+the+function+of+the+mitochondrial+DNA+recombination+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mgm101.+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein.</a> Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).</li>
<li>Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+core+of+the+mitochondrial+genome+maintenance+protein+Mgm101p+in+Saccharomyces+cerevisiae+determined+with+a+temperature-conditional+allele%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele.</a> FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).</li>
<li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+packaging+proteins+Glom+and+Glom2+coordinately+organize+the+mitochondrial+nucleoid+of+Physarum+polycephalum%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum.</a> Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).</li>
<li>Janicka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+RAD52-like+single-stranded+DNA+binding+protein+affects+mitochondrial+DNA+repair+by+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination.</a> Plant J. 72, 423-435 (2012).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

これは、Eから安定した、ネイティブ換えMgm101タンパク質を産生するために課題となっている細菌細胞におけるその不溶性が原因の可能性大腸菌 。本稿では、MBP融合戦略はタンパク質が適度に高いレベルで発現されることができることを示している。ネガティブ染色透過型電子顕微鏡およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、我々は以前にMBP-融合タンパク質は、インビトロ 18 に均一なオリゴマーを形成することが示されている。それはMgm101のフォールディングおよびオリゴマーはミトコンドリアマトリックスと比べて細菌細胞内に遅くなる可能性があります。 unoligomerized Mgm101はすぐにインビボで毒性である凝集体を形成してもよい。 MBP-タギングは、生産的なオリゴマー化を可能にし、その毒性を減少させる水溶性のコンフォメーションでMgm101を保つかもしれない。 良質Mgm101の調製のための重要な基準は、DNAによる最小限の汚染を持つことである。 280</s...

相同組換えは、二本鎖切断（DSBの）と鎖間架橋の修復のための、および縮小複製フォーク1からDNA複製の再開始のために重要である。従来の相同組換えでは、中央の反応は、原核生物においてRecAタンパク質、及びRad51の1-3および真核生物におけるDMC1含むATP依存性リコンビナーゼにより触媒される。これらのリコンビナーゼは、二本鎖DNAテンプレート（ 図1、左パネル）4-7内の相同性検索と鎖侵入を開始するために不可欠である一本鎖DNA上で核タンパク質フィラメントを形成。従来方式に加えて、相同組換えはまたRecA/Rad51-independent方法（ 図1、右パネル）で行うことができる。例えば、酵母RAD52とRad59タンパク質は直接二本鎖DNA切断の切除によって公開され、相補鎖DNA鎖のアニーリングを触媒することができます。歌うと呼ばれるこの再結合過程、ル鎖がアニーリング、一般的に相同な二本鎖DNAテンプレートとのペアリングは含まれません。アニール後、異種尾はエキソヌクレアーゼとニックゲノム継続8-10を復元するために連結されることにより除去される。一本鎖アニーリング機構により修復は、しばしば直接繰り返さ地域間のゲノム配列の欠失を伴っている。 RAD52はバクテリオ11の間で普及している組換えタンパク質の多様なグループに属しています。これらのタンパク質はまた、相同な一本鎖DNA分子のアニーリングを促進するそれらの活性に基づいて、一本鎖アニーリングタンパク質（SSAPs）として知られている。最高の特徴バクテリオファージSSAPsはRedβとラクトコッカスファージul36からプロファージRACおよびサックタンパク質からバクテリオファージλとP22、RecTをからErfにある。類似性が事実上undetectですがSSAPsは、構造的、典型的なβ-β-β-α倍によって特徴付けられる彼らの主要なシーケンスでできる。 10彼らは、すべてのフォーム大ホモオリゴマーリング- 体外 12-14 で 14回対称。この特徴的な高次構造、組織の機能的な意味はよく理解されていない。 私たちは、ミトコンドリアゲノムに相同組換えのメカニズムを理解することに興味を持っています。我々は以前に、サッカロミセス·セレビシエ 15内のmtDNAの維持に必須であるMGM101遺伝子を同定した。MGM101は 、その後、ミトコンドリア核様体と関連することが見出され、DNA損傷剤に対するミトコンドリアの許容16に必要とされる。しかし、Mgm101の研究は、組換えMgm101を生産する難しさによって10年で戻って開催されています。我々は最近、E.から大量に可溶Mgm101を生産することに成功しましたMBP融合戦略を使用して大腸菌 。これは、Mgm101株式を発揮することができましたタンパク質17,18のRAD52-家族と生化学的および構造的類似性。本報告では、三段階精製法は均質Mgm101for生化学的および構造解析します（ 図2）を生成し、これに記載されています。

<table><tbody><tr><td>発現ベクター pMAL-c2E</td><td>New England Biolabs</td> <td>#N8066S</td><td></td></tr><tr><td>PreScission Protease</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>#27-0843-01</td><td></td></tr><tr><td>BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells</td><td>Strategene</td><td>#230245</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Roche Applied Science</td><td>#11034626001</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Roche Applied Science</td><td>#11359053001</td><td></td></tr><tr><td>フッ化フェニルメチルスルホニル (PMSF)</td><td>Roche Applied Science</td><td>#10837091001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma</td> <td>#DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &#946;-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)</td><td>Roche Applied Science</td><td>#11411446001</td><td></td></tr><tr><td>Amylose resin</td><td>New England Biolabs</td> <td>#E8021L</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column chromatography column</td><td>BIO-RAD</td><td>#7372512</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Scale Mini Macro-Prep High S カートリッジ (1 ml)</td><td>BIO-RAD</td><td>#732-4130</td><td></td></tr><tr><td>VIVASPIN 15R 限外ろ過スピンカラム (10,000 MWCO)</td><td>Sartorius Stedium</td> <td>#VS15RH02</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 prep grade column</td><td>Amersham Bioscirnces</td><td>#17-0489-01</td><td></td></tr><tr><td>VIVASPIN 6 Ultrafiltration スピンカラム (5,000 MWCO)</td><td>Sartorius Stedium</td><td></td><td></td>#VS0611</tr></tbody></table>

mbpベースタギング戦略によってmgm101組換えタンパク質の調製

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

MGM101遺伝子はミトコンドリアDNAの維持におけるその役割のために20年前に同定された。いくつかのグループからの研究がMgm101タンパク質は、ミトコンドリアDNAの組換え修復に関与することが示唆されている。最近の研究は、Mgm101がRAD52型組換えタンパク質ファミリーに関連することが示されている。これらのタンパク質は、大きなオリゴマーの環を形成し、相同な一本鎖DNA分子のアニーリングを促進する。しかし、Mgm101の特徴は、組換えタンパク質を産生することが困難によって妨げられてきた。ここでは、組換えMgm101の調製のための信頼性のある手順を説明する。マルトース結合タンパク質（MBP）タグ付きMgm101は、第大腸菌で発現される。融合タンパク質は、最初アミロースアフ​​ィニティークロマトグラフィーにより精製する。タンパク質分解切断によって放出された後、Mgm101は、陽イオン交換クロマトグラフィーによってMBPから分離される。単分散Mgm101その後、得られたサイズ排除クロマトグラフィーによる。細菌培養のリットルあたりMgm101の〜0.87ミリグラムの収量は日常的に得ることができる。換えMgm101は、DNAの最小の汚染されています。調製したサンプルが正常にMgm101の、生化学的構造及び単粒子像分析のために使用される。このプロトコルは、ミスフォールドおよび細菌細胞に対して毒性することができる他の大きなオリゴマーDNA結合タンパク質の調製のために使用することができる。

Mgm101はミトコンドリアにおけるRAD52関連の組換えタンパク質である。 RAD52が広くミトコンドリアDNA組換え（ 図1）におけるその役割のために研究されてきた。組換えMgm101は、3段階の手順（ 図2）により調製することができる。これは、Mgm101が可溶型で発現することができ、その後、タンパク質分解的切断（ 図3）により、タグから放出MBP-タグ付け戦略の使用によって促進される。 典型的な準備のために、MBP-Mgm101融合の約2〜3 mgのアミロースアフ​​ィニティークロマトグラフィーの後に細菌培養物1リットルから回収することができる。 SDS-PAGEゲル上で、MBP-Mgm101を約70 kDaの（ 図4）の主要バンドとして検出される。樹脂が適切に溶出前に洗浄されている場合は他のタンパク質による汚染は最小限に抑えられます。プレシジョンプロテアーゼによる切断後、MBPとMgm101がオンにそれぞれ42キロダルトンと28キロダル...

酵母ミトコンドリア核様体タンパク質、Mgm101は、大きなオリゴマーの環を形成するRAD52型組換えタンパク質である。プロトコルは、陽イオン交換およびサイズ​​排除クロマトグラフィーと連結マルトース結合タンパク質（MBP）タギング方式を使用して可溶性組換えMgm101を調製するために記載されている。

MBPベースタギング戦略によってMgm101組換えタンパク質の調製

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

本手順の目的は、マルトース結合タンパク質（MBP）タグ付け戦略を用いて、MGM 1 0 1などの大きなオリゴマーDNA結合タンパク質を調製することです。まず、e coliで発現させるために、PMLC two Eベクター内のMBPの下流にMGM 1 0 1のオープンリーディングフレームをクローニングします。その後、MBP-MGM 1 0 1融合タンパク質を、AMLOアフィニティークロマトグラフィーによりe coliから精製します。次に、MGM 1 0 1をタンパク質分解による切断によってMVPから遊離させ、陽イオン交換クロマトグラフィーによりMVPから分離させます。最後に、サイズ排除クロマトグラフィーを用いてMGM 1 0 1リングを均一になるまで精製します。最終的に、約0.8 milligramsの水溶性MGM 1 0 1が得られます。1リットルの細菌培養液から、ミトコンドリアのDNA修復に重要なこのタンパク質の生化学的および構造的特性解析に使用できる量を得ることができます。MGM 1 0 1のモルタル結合タンパク質タグ付きバージョンを使用する主な利点は、タグなしバージョンよりも毒性が低く、溶解性が高く、安定性に優れていることです。その結果、大腸菌において天然のMGM 1 0 1タンパク質を高レベルで発現させることが可能になります。こんにちは、サラ・ヴィッキーです。私はSUNYアップステート医学大学のDr. Jji Tenの研究室でシニアリサーチサポートスペシャリストを務めています。同僚のWan Wongと共に、MGM 1 0 1の発現と精製について実演します。まず、PCRを用いて成熟MGM 1 0 1コーティング配列を増幅し、融合タンパク質の作製を開始します。切断されることが分かっているMGM 1 0 1のN末端22アミノ酸残基は含めないようにします。ミトコンドリアへの導入後、増幅したMGM 1 0 1を、改変した発現ベクターPM MAL C two Eにおいてマルトース結合タンパク質（MVP）をコードするMAL E配列の下流に配置します。これにより、精密プロテアーゼの切断部位を含むリンカーを介したM-V-P-M-G-M 1 0 1融合タンパク質が生成されます。このプラスミドは、まずブルーホワイト選択を用いずにE. coli形質転換体を選択することで構築します。得られたプラスミドpLC2E-MGM101を大腸菌株BL21(DE3)-CodonPlus RILに導入し、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを含むLBプレート上で培養します。まず、新鮮な10 mLの補完LB培地に大腸菌形質転換体を接種し、37 °Cで200 RPMで振とうしながら一晩培養します。翌日、この前培養液10 mLを2 Lの補完LB培地に接種します。細胞を37°Cで振盪培養します。OD

preparation-mgm101-recombination-protein-mbp-based-tagging

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生物学

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の遺伝的操作<em&gt;Δku80</emの機能ゲノム解析のための&gt;株<em&gt;トキソプラズマ</em

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具体的にはヒト細胞における選択的スプライシングを操作するために工学人工要因

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誘導性T7 RNAポリメラーゼ媒介マルチ遺伝子発現システム、pMGX

クラスター化された定期的に空間短い回文の繰り返し/CRISPR 関連付けられている蛋白質 9 (CRISPR/Cas9) システムは遺伝子工学の有望なツールを提供し、transgenes の対象となる統合の可能性を開きます。(HMEJ) に参加する相同性の終わりについて述べる-ベースの戦略を効率的な DNA が生体内で統合対象し、標的遺伝子療法 CRISPR/Cas9...

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AviTag特異的位置制限照明強化ビオチニル化(ALIBi)は、リボソームの細胞内集団を標識し親和性を精製し、下流のシーケンスおよびプロテオーム解析のために開発された新しいオプトジェネティック活性化法です。...

組換えペプチドタグ特異的位置制限照射強化ビオチニル化に基づく細胞内リボソームサブポピュレーションの単離

チャールズテイラーとジョンマーシャルは、人口置換戦略の有効性を評価するための数学的モデリングの有用性を説明する。洞察力は、計算モデルは、蚊の個体群動態とA.

数理モデルを使用して人口置換戦略の有効性を予測

学ぶ MBPタギング戦略による酵母ミトコンドリアタンパク質Mgm101の調製法。アミロース親和性クロマトグラフィー、陽イオン交換、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、大きなオリゴマー環状タンパク質を精製する手法を解説します。

MBPベースタギング戦略によってMgm101組換えタンパク質の調製

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