Name: の4Dのマルチモダリティイメージングシトロバクターrodentium感染症 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: 学ぶ4Dマルチモーダルイメージングを用いたマウスにおけるCitrobacter rodentium感染サイクルの可視化法。拡散光イメージングトモグラフィーとマイクロCTを組み合わせ、細菌コロニゼーションの時空間的変化をリアルタイムで追跡する技術です。

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インペリアルカレッジにおけるin vivoイメージング施設で MRCによって資金を供給された。

<ol><li>Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Luciferase+to+Image+Bacterial+Infections+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice.</a> J. Vis. Exp. (48), e2547(2011).</li>
<li>Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infect Immun. 74, 5391-5396 (2006).</li>
<li>Wiles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+specificity%2C+colonization+and+clearance+dynamics+in+vivo+following+oral+challenges+with+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Cell Microbiol. 6, 963-972 (2004).</li>
<li>Wiles, S., Dougan, G., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+a+%27hyperinfectious%27+bacterial+state+after+passage+of+Citrobacter+rodentium+through+the+host+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Emergence of a 'hyperinfectious' bacterial state after passage of Citrobacter rodentium through the host gastrointestinal tract.</a> Cell Microbiol. 7, 1163-1172 (2005).</li>
<li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifidobacterial+surface-exopolysaccharide+facilitates+commensal-host+interaction+through+immune+modulation+and+pathogen+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Bifidobacterial surface-exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2108-2113 (2012).</li>
<li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li>
<li>Collins, J. W., et al. Pre-treatment with Bifidobacterium breve UCC2003 modulates Citrobacter rodentium-induced colonic inflammation and organ specificity of infection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCollins%2C+JW+%22Microbiology%22">Microbiology</a>. , 10-1099 (2012).</li>
<li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol. Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li>
<li>Hardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+replication+of+Listeria+monocytogenes+in+the+murine+gall+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder.</a> Science. 303, 851-853 (2004).</li>
<li>Szittner, R., Meighen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence%2C+expression%2C+and+properties+of+luciferase+coded+by+lux+genes+from+a+terrestrial+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium.</a> J. Biol. Chem. 265, 16581-16587 (1990).</li>
<li>Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+antituberculosis+drug+activity+in+vitro+and+in+macrophages+using+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence.</a> J. Antimicrob. Chemother. 67, 404-414 (2012).</li>
<li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J. Biomed. Opt. 12, 024007(2007).</li>
<li>Cronin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+vivo+bioluminescent+imaging+for+the+study+of+bacterial+tumour+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting.</a> PLoS One. 7, e30940(2012).</li>
<li>Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrobacter+rodentium+of+mice+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Citrobacter rodentium of mice and man.</a> Cell Microbiol. 7, 1697-1706 (2005).</li>
<li>Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variations+of+skin+pigmentation+in+C57BL%2F6+mice+affect+optical+bioluminescence+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation.</a> Mol. Imaging Biol. 13, 1114-1123 (2011).</li>
<li>Wiles, S., Crepin, V. F., Childs, G., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+biophotonic+imaging+as+a+training+aid+for+administration+of+substances+in+laboratory+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Use of biophotonic imaging as a training aid for administration of substances in laboratory rodents.</a> Lab Anim. 41, 321-328 (2007).</li>
<li>Crepin, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+role+of+the+Tir%3ANck+and+Tir%3AIRTKS%2FIRSp53+signalling+pathways+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dissecting the role of the Tir:Nck and Tir:IRTKS/IRSp53 signalling pathways in vivo.</a> Mol. Microbiol. 75, 308-323 (2010).</li>
<li>Willekens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+radiation+dose+in+micro-CT+with+optimization+of+the+scan+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22ContrastMedia+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the radiation dose in micro-CT with optimization of the scan protocol.</a> ContrastMedia Mol. Imaging. 5, 201-207 (2010).</li>
<li>Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-animal+X-ray+dose+from+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Small-animal X-ray dose from micro-CT.</a> Mol Imaging. 3, 149-158 (2004).</li>
<li>Sato, F., Sasaki, S., Kawashima, N., Chino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+effects+of+whole+or+partial+body+x-irradiation+on+mice%3A+life+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Biol.+Relat.+Stud.+Phys.+Chem.+Med%22%5BJournal%5D)">Late effects of whole or partial body x-irradiation on mice: life shortening.</a> Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 39, 607-615 (1981).</li>
<li>Kohn, H. I., Kallman, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+strain+on+acute+x-ray+lethality+in+the+mouse.+II.+Recovery+rate+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat.+Res%22%5BJournal%5D)">The influence of strain on acute x-ray lethality in the mouse. II. Recovery rate studies.</a> Radiat. Res. 6, 329-338 (1957).</li>
</ol>

この記事への生産とフリーアクセスは、パーキンエルマーが主催しています。 著者はケビン·P、フランシス、ジェフMeganckとChaincy郭はキャリパー·パーキンエルマー社の従業員です。 全ての動物実験は、動物科学手続法1986に従って実施され、地元の倫理審査委員会によって承認された。

細菌感染の4D映画は、迅速かつ容易にマルチモダリティイメージング、大量のデータを視覚化し、解釈するための有用なツールを提供しています。この手法は、感染症は、個々のマウスを介して拡散し、縦断的研究7時にホストまたは細菌遺伝子または特定の介入戦略の効果細菌負荷、流通、ローカライズの方法削除を調査するために使用する方法の詳細な分析を容易にします。これらのビデオにも便利教材や国民に情報発信の手段を提供します。 DLIT-μCTイメージングと感染の4Dのビデオをコンパイルする機能から得られたデータの品質に影響を与える可能性があり、このプロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。このプロトコルの最も重要な部分は、C.を有するマウスの正常かつ均質な感染症であるrodentium。これは、研究のために使用されるマウスは18〜20グラムの間で、そのあることが不可欠であるbacteリアル接種は、新たに調製し、約5×10 9 cfuのは、前述2,3に記載されている。以前はマウスの感染に、それは接種はスペクトルCTを使って、一度接種が準備されている生物であることを確認することが重要であるそれぞれのマウスがマウスが同じような感染量を受け取ることを保証するために強制経口投与する前に、それが継続的に均質化されている必要があります。マウスのDLIT-μCTイメージングは​​リビングイメージ4.3.1ソフトウェアの自動露出機能が自動的にうまくノイズの上になるように信号用に最適化された撮像パラメータを決定するように最適化されています。ただし、自動露光機能が手順で説明したように変更する必要がユーザ設定及びパラメータに依存している。これを怠ると、自動露出のためのスペクトラムCTの工場出荷時の設定は、撮像腫瘍が発現するためにプログラムされると、感染の明らかな進行をもたらさないことを集めた光子の数が少ないと悪いイメージになりますホタルルシフェラーゼ。復元は、560から620 nmのシミュレートと測定データとの間の最良の合意を与える使用して実行し、そのため、復興に含めるより信頼性の高いデータである。 DLIT-μCTの使用に制限はμCTスキャンからの電離放射線は、縦断的研究18の累積である亜致死放射線損傷の原因となります。亜致死放射線露光は、DNA損傷、および内臓19におけるアポトーシスを引き起こす免疫応答を弱めることができる。電離放射線のためのLD 30分の50はマウスのマウス系統や年齢に応じて、5〜7 Gyの間で18,20,21を使用され、超過した場合に最終的に、累積致死放射線損傷は、死を引き起こす可能性があります。包括的な原則は、保守的に線量を推定することであるため、電離放射線の分子損傷のいくつかは、癒すことができますが、これは一般的に研究計画では占めていません。その代わりに、目的はずっとベルとして滞在することですできるだけOWはこれらの制限はまだ研究の目標を達成しながら。これは、感染に対する正常な免疫応答のこの研究において特に重要である、画像化、およびトランスジェニック動物を免疫構成され、又は頻繁に感染しているという事実の周波数は、電離放射線の影響をより受けやすいかもしれない。 感染の4Dムービーを生成する実験を計画するとき、それは実験の長さを考慮することが重要である、μCT数が使用されているマウス系統に対して電離放射線のために、この期間中に必要とLD 30分の50スキャンします。これは細菌の検出限界とイメージング時間に影響を与えるとしてDLIT-μCTに別の潜在的な制限は、使用されている菌株内レポーター発現の強さです。 BLIのために以前に実証されるようにこれは非常に、研究者が完全に病原性である菌株を検証し使用することをお勧めしますが、最大のルクスオペロンの発現のために最適化され2,3。 4Dイメージングの現在の設計の一つの注意点は、それぞれのムービーが異なる光子スケーリングを持つ個々のDLIT-μCTスキャンで構成されているということです。 BL病巣の局在、またはその強度に変化は微妙である場合、これは解釈が画像を困難にすることができたり、複数の弱巣に囲まれた1激しいBLフォーカスが存在する場合。したがって、長手方向の視覚化のために、それは時間ポイント間のカラーバーの一貫性を保つことが重要である。 感染の4D映画の概念は、任意の適切に標識された細菌性病原体に適用することができる。この技術の今後の展開は、感染に対する宿主応答を調査する赤外線プローブ近い蛍光生物発光細菌性病原体および注射の組み合わせを使用して、感染に対する宿主応答の調査を容易にするために、蛍光イメージング断層撮影（FLIT）ならびにDLITを使用することを目指します。さらにこれに、このプロトコルで我々だけ感染の4Dムービーを作成するための生物発光細菌の使用を記載している。しかし、いくつかの例では、生物発光レポーター、感染時にホスト遺伝子を調査するために使用することができるので、IRFPでタグ付けされ、例えば、蛍光標識された細菌を使用する必要があるかもしれない。重要なのは、DLIT / FLIT-μCTを組み合わせたマルチモダリティイメージングの使用は、私たちは非侵襲的に削減、洗練、および科学研究における動物の使用の交換に大きく貢献する細菌感染症、間に複数のパラメータを調べることができますNC3Rのイニシアチブ（に概説されているよう<a href="http://www.nc3rs.org.uk/" target="_blank">http://www.nc3rs.org.uk/</a> ）。

特に小さな動物モデルは、これらのマウスを利用して、日常的に細菌の病原性を調査するために、又は抗生物質、プロバイオティクス、プレバイオティクスおよびワクチン1-7などの感染のために介入戦略をテストするために使用される。小動物の感染症からの主な実験的な読み出しは病原体負荷、感染症の空間的および時間的局在、および感染した生物の免疫応答への変更である生体内光学イメージングでは感染症研究のための貴重なツールであり、複数の監視に使用できますレポーター遺伝子を使用することにより実験的読み出し（ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、β-ラクタマーゼ、等）、蛍光色素、ナノ粒子またはタンパク質、生物学的プロセス、又は微生物6に標的化学発光プローブ。 生物発光イメージング（BLI）が病原性bacteにより、例えば、マウス、ラットなどの小動物のコロニー形成を監視するために使用される光学撮像モダリティであるRIA 3,6,8,9。マウスはそのようなPhotorhabdusのluminescensからルクス CDABEオペロンとしてルシフェラーゼを発現する組換え細菌に感染している。これらの細菌は、その後vivoイメージングシステム3,6,9 に基づいてCCDを使用して光生成を介して検出することができます。重要なのは、唯一の代謝的に活性な微生物は、生存細菌細胞は、この方法論10,11によって検出される、つまり生物発光（BL）である。 2D BLI使用して、BL源の位置は、信号が発せられる動物8の表面から推測される。 in vivoでの BL病巣の正確な解剖学的局在は対照的に、臓器3,6,9のex vivoでの分析によって決定されなければならない、合成3次元拡散光トモグラフィイメージング（DLIT）はBLの定量的な3次元再構成をコンパイルするために使用することができるソース12。 DLITが定義狭帯域通過光フィルタを用いて撮影したBL画像を収集することによって行われ、その後、拡散光トモグラフィー3次元再構成アルゴリズム1,7,12,13にそれらを入力する。 現在のところ、マルチモダリティイメージングはex vivoでの解析を必要とせずに、in vivoで生物発光病巣の真の非侵襲的な解剖学的局在を得ることができる唯一の方法論です。最近、我々はDLITプロバイオティクス細菌7と予防的治療後にシトロrodentium（C.rodentiumの ）植民地化の動態を評価するためにμCTイメージングと共同で登録された組み合わせを使用していました。C. rodentiumは病原性とenterhemorrhagic 大腸菌 14とモデル、人間の感染に使用されたマウス特有の腸病原体である。Cでrodentium感染は一般的に軽度の体重減少、下痢、偏Th1型免疫応答と結腸陰窩の過形成など、明確な病理学的変化、及び取り付け、控えめ病変のformatiに関連付けられている、大腸炎を引き起こす14。これに加えて、C. rodentiumの病因は、徹底的にこの細菌マルチモダリティイメージング3,4,7での使用に理想的なモデル微生物作り、十分に文書化されているC57BL/6JマウスにBLIとその植民地化のダイナミクスを使って研究されてきた。 このプロトコルは、単一のマルチモダリティイメージングプラットフォーム、IVISスペクトラムCT、および非侵襲的に、この感染症の真の力学的な関係を示すの4D映画の生成を使用して細菌感染の統合DLIT-μCTイメージングのための方法論を概説する最初のものです。

<table><tbody><tr><td>生物発光 C. rodentium</td><td>Frankel lab</td><td>ICC180</td><td>Wiles et al., 2004</td></tr><tr><td>Veet</td><td>Boots</td><td></td><td>最適な脱毛時間は7分です。</td></tr><tr><td>イソフルオラン(100%v / v)</td><td>アボット</td><td>B506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>医療用酸素</td><td>BOC メディカル</td><td></td><td>サイズFシリンダー <ストロング>注:</ストロング> 適切なレギュレーターが必要です。</td></tr><tr><td>Luria Bertaniブロス</td><td>メルク</td><td>1.10285.0500</td><td>25 g1L脱塩水。</td></tr><tr><td>Luria Bertani 寒天</td>メル<td>ク</td><td>1.10283.0500</td><td>37 g 1L 脱塩水。</td></tr><tr><td>硫酸カナマイシン</td><td>Sigma (Fluka)</td><td>60615</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>50 mlポリプロピレン円錐形ファルコンチューブBD</td><td>(ファルコン)</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ユニバーサルコー</td><td>ニング(ゴセリン)</td><td>E5633-063</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1mlシリンジ</td><td>BD(Plastipak)</td><td>300013</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>経口投与針(16G x 75 mm)湾曲</td><td>Vet Tech</td><td>DE005</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロバンクス(クライオバイアル)</td><td>Pro-Lab Diagnostics</td><td>PL.170/Y</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum CT</td><td>Caliper- A PerkinElmer Company</td><td>133577 Rev A/ Spectrum CT&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>6kVA UPS</td><td>キャリパー - PerkinElmer社</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>XGI-8麻酔システム</td><td>キャリパー-パーキンエルマーカンパニー</td><td>118918</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>XAF-8麻酔フィルターチャコール</td><td>キャリパー-パーキンエルマーカンパニー</td><td>118999/00</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Living Image v4.3.1 SP1</td><td>Caliper- PerkinElmerの会社</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>卓上振盪インキュベーター</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 44</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4"> </td></tr></tbody></table>

の4dのマルチモダリティイメージング<em&gt;シトロバクターrodentium</emマウスにおける&gt;感染症

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

このプロトコルは、縦方向に感染サイクルの4次元（4D）のムービーを生成するために統合されたμCT（DLIT-μCT）及びこのデータのその後の使用との複合3D拡散光イメージングトモグラフィーを用いた生物発光細菌感染を監視するために必要な手順の概要を説明します。 4D感染ムービーを開発し、IVISスペクトラムCTを用いた細菌感染症研究のためDLIT-μCTイメージングを検証するために、我々は生物発光C.感染を使用マウスで自己限定性大腸炎を引き起こすrodentium、。このプロトコルでは、生物発光C.によるマウスの感染を概説rodentium、毎日DLIT-μCTイメージングと8日間の糞便からの細菌の列挙によって植民地化の非侵襲モニタリング。 IVISスペクトラムCTの使用は、単一のイメージングプラットフォームを用いた光とμCTスキャンのシームレスな同時登録を容易にする。低用量μCTのモダリティは、マウスのイメージングを可能にする累積放射線からアーチファクトを引き起こすことなく、3Dで生物発光細菌の巣の詳細な解剖学的局在を提供する感染中の複数の時点、で。重要なのは、感染したマウスの4D映画がin vivoで細菌のコロニー形成のダイナミクスを監視するための強力な分析ツールを提供する。

5×10 9 cfuのC.とC57BL/6Jマウスの感染rodentiumはよく説明し、細菌感染モデルと自己限定胃腸感染の結果である日6-8感染後の間に3〜4週間2,14間続く ​​ピーク。感染症は、マウス免疫系によって腸管腔に限定されており、結果として、細菌が絶えず糞便中に流されている。 C.によるマウスの植民地化rodentiumは糞、または生物発光イメージング2,3から直接細菌の列挙によって非侵襲的に監視することができます。 本稿では、Cの 3Dと4Dのマルチモダリティイメージングを実行するための最適化されたプロトコルを概説感染中の細菌負荷およびローカリゼーションを監視するマウス内rodentium。 図1に示した結果が成功の4Dイメージングのために必要とされる制御を示す。それを阻止することが不可欠であるマウスの感染に先立ち使用される細菌の接種は、生物発光（ 図1A）であることを鉱山とその生物発光Cとマウスの強制経口投与後に信号は動物の胃の中ではなく、肺（ 図1B）16で観察できることrodentium、。 生物発光イメージングを使用して細菌のコロニー形成を監視することに加えて、それは糞便中の細菌数を定量化することをお勧めだ、胃腸粘膜の細菌定着の間接的な測定として使用される図2 8 C57BL6 / Jから取ら糞便中の典型的な細菌負荷を示しています。 〜5×10 9 CFU ICC180に感染し、約5×10 10 CFU / gであり、一日6-7どこで感染ピーク日まで2 PIから8日間のPI植民地の上昇のために監視されているマウス 以前の報告2,3,17に沿ったです。 評価の重要性を強調するにはティンシングルマウス、 図1b及び3と同様に、 ビデオ1での感染の広がりが C以下同じマウスから生成されています上述したようにrodentium感染 、。毎日DLIT-μCT、解剖学的基準としてスケルトンを使用して、このマウス内の生物発光細菌の空間分布を評価した。 図3は、少なくともPI 3キーの時点でICC180に感染したC57BL/6JマウスのDLIT-μCT再構成を示してい3日目PI小さな生物病巣は空間分布の変化が少ないと5日目PIによる生物発光強度の緩やかな増加を示す結腸で観察することができる。 7日目PIで私たちは生物発光の大幅な増加と結腸全体にわたる生物病巣の広がりを観察した。 ビデオ1日からICC180と1-8 PI 3D DLIT-μCT再建の集大成であり、Cを示しています日で細菌病巣は結腸全体をカバーする7 PIピーキングまで大腸内細菌の数字は拡大4-6 PI日から3日目のPIで大腸に広がる日1-2 PIの間に近位消化管内rodentium。 8日目PIのみで二つの異なる細菌の巣には、近位および遠位結腸に存在している。時系列順に各時点で完全な3D再構成を表示する機能は、ホスト病原体の相互作用を分析するための強力なツールを表し、同じデータセットの3D静止画より解釈が容​​易である。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig1.jpg" /> 図1の2次元生物発光イメージング）生物発光C. rodentium ICC180接種と接種200μlで強制経口投与後にB）マウス。アローヘッドは（&gt;）生物発光C.を示しrodentium </<html> em&gt;の胃である。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig2.jpg" /> 図2。C. rodentium植民ダイナミクス℃の定量8日間PIのため糞からrodentiumコロニー形成単位<img alt="図3" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3.jpg" /> 図3。生物発光Cの拡散光イメージングトモグラフィー-μCTスキャン3日目、5と7 PIアロー（&gt;） で監視1マウスからrodentium感染は結腸植民地化を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50450/50450fig3large.jpg" target="_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 ビデオ1。P :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;映像を表示するには、ここをクリックしてください。 日1から8までのPIを監視1マウスからC.rodentiumの感染の 4D映画

マルチモダリティイメージングは​​、小さな動物モデルで細菌のコロニー形成を研究するための貴重なアプローチである。このプロトコルは、生物発光とマウスの感染症を概説<em&gt;シトロバクターrodentium</em&gt;との4Dムービーを作成するためにμCTイメージングと複合3D拡散光イメージングトモグラフィーを用いた細菌のコロニー形成の長手方向の監視<em&gt; C. rodentium</em&gt;感染。

の4Dのマルチモダリティイメージング<em&gt;シトロバクターrodentium</emマウスにおける&gt;感染症

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

本手順の全体的な目的は、統合マイクロCTを用いた複合拡散光イメージングトモグラフィーにより、*Z. dunum*の感染サイクルをモニタリングし、感染の4D動画を作成することです。まず、生物発光細菌接種源を調製します。次に、経口投与によりマウスに*Z. dunum*を感染させます。その後、感染したマウスをD light micro CTを用いて毎日撮影し、最終ステップとして3D DLI micro CTデータを再構成し、感染サイクルの4D動画としてまとめます。最終的に、感染マウスの4Dマルチモーダルイメージングを通じて、細菌量の分布と局在の変化を示すことができます。ジェームズ・コリンズ博士。私の研究室のポストドクターが、本日この手順を実演します。感染前日の夕方に、Zoreudum strain IC 180のクライオバイアルを準備し、解凍させます。解凍後すぐに、細菌を含むクライオビーズ1個を15 mLのカナマイシン含有LB培地に接種してください。その後、37 °C、220 RPMの振盪条件下で一晩培養します。また、培地のコンタミネーションを制御するため、接種していないLB培地15 mLも同様に培養し、翌朝まで保持してください。接種済みの未処理（UN）コントロールが濁っていない場合は、接種した培養液を50 mLチューブに移し、4°Cで4,000 RPMで10分間遠心分離します。ペレットをPBSで再懸濁し、再度遠心分離を行います。その後、細胞を1.5 mLのPBSで完全に再懸濁し、細菌接種液を作成します。ICC 180培養液が生物発光していることを確認し、細菌数を推定するために、ivus spectrum CTを用いてオープンフィルター生物発光イメージングで培養液を撮影し、living image 4.3 0.1 wizardのオート設定を使用します。これについては、以前に公開されたビデオで詳細に説明されています。生物発光する齧歯類への感染を実証するため、1匹のマウスに感染させ、もう1匹のマウスをPBSを用いて模擬感染（モック感染）させます。感染操作を行う前に、XGI 8麻酔システムを用いて3% isof fluorineでマウスを麻酔し、麻酔が十分にかかるまで人道的に拘束します。細菌接種液を混合し、経口ゾンデ用シリンジに既知の菌数を含む0.2 millilitersを採取します。次に、1匹目のマウスを項皮でしっかりと把持して取り出します。なお、マウスは本文中に記載されている通り、脱毛クリームを用いてイメージング前に脱毛させています。針を舌の上から口蓋側へ、そして食道に沿って挿入し、細菌接種液を胃内に注入します。抵抗がある場合は、無理に針を押し込まないでください。そうすると、接種物が肺に入ってしまうため、ゆっくりと針を刺し直してください。その後、マウスに呼吸困難や歩行困難が見られる場合は、擬似感染（mock infection）として安楽死させてください。0.2 millilitersのPBSをマウスに経口投与し、経口投与が正しく行われたかを確認します。IVUSスペクトラムCTを用いて、オープンフィルター生物発光イメージングでマウスを撮影し、LivingImageのオート設定および既述の4.3 0.1イメージングウィザードを使用します。Delight micro CTは、低線量micro CTスキャンと統合されたDelight光学イメージングで構成されています。イメージングセッションごとに動物への被曝線量が蓄積するため、線量は合理的に可能な限り低く抑えることを目的にします。これらの懸念があるため、有害な症状の最初の兆候が現れたとき、またはマイクロCTイメージング期間の終了時に、マウスを安楽死させる必要があります。本研究では、in vivoでの細菌ルシフェラーゼのイメージングのために、Living Image 4.3 0.1の自動露光機能パラメータを最適化します。まず [Edit] を選択し、次に [Preferences]、続いて [Acquisition]、そして [Auto Exposure Window] を選択してください。次に、レンジ値を選択し、続いて実験時間を秒単位で設定し、最大値を300秒に設定します。最後に、最小ターゲットカウントを選択し、続いてルミネッセンスを選択して、この値を10,000カウントに設定します。これで、システムの初期化、麻酔のセットアップ、およびX線安全インターロックの確認が完了しました。マウスの麻酔処置を行います。XGI eight麻酔システムを用い、酸素流量を2 L/min、イソフルラン濃度を3%に設定します。マウスのイメージング準備が整ったら、ソフトウェアのイメージングウィザードを開きます。このツールは、選択した各エミッションフィルターに対して可能な限り最高の信号対雑音比を提供できるよう、複数のパラメータを自動的に最適化します。イメージングウィザードの指示に従い、565 nm、860 nm、および620 nmのエミッションフィルターを含めてください。次に、1 mouse micro CT scanが選択されていることを確認し、[acquire]をクリックしてイメージングを開始します。麻酔したマウスをケージに戻した後、spectrum CTからマウス用イメージングプラットフォームを取り外し、1% tri geneを用いて動物プラットフォームを消毒します。注：動物プラットフォームがひどく汚れている場合は、フォームパッドを交換してください。縦断的なイメージングデータを取得するため、感染後8日目まで毎日マウスのイメージングを継続します。試験期間が長くなると、累積放射線被ばくによるアーチファクトが発生する可能性が高まります。高品質で再現性のある3DライトマイクロCT再構成を行うには、いくつかの手順が必要です。まず、Living Imageソフトウェア 4.3 0.1を開き、ブラウズウィンドウから「Browse」を選択します。「load」をクリックして、delight micro CTファイルが含まれているフォルダを開きます。living image browserでDLI micro CTファイルを開きます。例として、「deum day seven post-infection」を参照してください。ツールパレットで「surface topography」を選択し、次に「nude mouse」を選択します。しきい値を調整し、「generate surface」をクリックします。表面再構築に成功すると、3Dビューウィンドウに表面の輪郭が表示されます。3DビューウィンドウでレンダリングされたマイクロCTスキャンを表示するには、表面のアウトラインを非表示にするか、表面の不透明度を下げます。どちらのオプションも、まず「3D optical tools」を選択することでアクセスできます。次に、「display surface object」の選択を解除するか、不透明度のスライダーバーを調整して、3つのDD光再構成の詳細な解剖学的部位特定を行います。動物骨格に関して、3Dボリュームデータを編集します。骨格を最適なコントラストで表示するには、「3D multimodality tools」をクリックし、骨のみが鮮明に見えるまでヒストグラムスライダーを右に調整します。次に、まだ選択されていない場合は、「logarithmic histogram」、「reverse coloring gradient」、「illumination quality」および「de-noise」をクリックしてください。必要に応じて、ツールパレットから画像をクロップし、3D再構築から不要な構造を除去します。D light 3D reconstructionを選択してください。565 nm、860 nm、および620 nmのフィルターのみが選択されていることを確認します。その後、Startをクリックします。これにより、2Dで撮影されたマウスからの分光フィルタリング済み生物発光信号を含むデータプレビューウィンドウが開きます。これらの信号はソフトウェアによって自動的に閾値処理されますが、必要に応じてメニュー下部のタブを使用して手動で調整できます。この閾値によって、再構成データとして組み込まれる最小のデータ強度が決定されます。次にツールパレットから「D light micro CT 3D reconstruction」を選択し、光学プロパティを確認します。「properties」タブをクリックし、組織プロパティ（tissue properties）を「mouse tissue」に、光源スペクトル（source spectrum）を「bacteria」に設定してください。その後、「reconstruct」をクリックしてD light再構成を実行します。赤色で囲まれたD光信号の実際の位置は、骨盤帯内にあります。これは、動画の中で画像が回転する際に、より解釈しやすくなります。DLIマイクロCT 3D動画を作成するには、ツールメニューから「3D animation」、「preset animations」、「counterclockwise axis」、そして「total duration」を順に選択してください。この値を10秒または25 frames per secondに設定します。3Dアニメーションの設定が正しく完了したら、録画ボタンを押し、DLI micro CT 3D再構築データをVIファイルとして保存します。比較を可能にするため、これらの再構築を同一の設定で行うことが極めて重要です。また、すべてのビデオを同じフレームレート（fps）および総再生時間で作成することが重要です。そうしないと、40本のビデオのタイミングに均一性がなくなります。コンピュータでWindows Live Movie Makerを開き、新しいファイルを作成します。感染後1日目からの時系列順にDLI micro CTの再構成画像を挿入します。「ツール」タブを使用し、ビデオを選択して「ホーム」を選択し、「キャプションを追加」を選択することで、各ビデオの冒頭にキャプションを追加します。キャプション内のテキストはツールバーでフォーマットでき、キャプションの表示位置も調整可能です。次に、「ホーム」から「タイトル」をクリックしてタイトルページを追加します。ツールバーを使用してテキストをフォーマットしながら、ボックスにタイトルを入力してください。最後に、プロジェクトをMMPファイルとして保存します。動画を編集したい場合にこれは不可欠です。最後に、ムービーメーカーのメニューから「動画を保存」を選択し、WMVファイルとして保存してください。4つのコンピューターオプションコントロールは、良好なテクニックを実現するために不可欠です。マウスに感染させる前に、使用する細菌接種液が生物発光することを確認しました。生物発光マウスへの経口投与後、白い矢印で示される動物の胃で信号が観察され、肺では観察されないことを確認しました。このマウスは、個別の感染の後の例でも提示されます。Zero dentureは、実演された感染期間中、腸管腔内に限定される細胞外病原体です。したがって、細菌は糞便中に排出されます。糞便を分析した結果、定着率は2日目から6日または7日目にかけて増加し、その時点で1日あたりの感染がピークに達することが示されました。このマウスにおける生物発光細菌の空間的分布を評価するため、骨格を解剖学的指標としてDのライトマイクロCTが使用されました。感染後3日目において、青色の矢印で示される小さな生物発光焦点が結腸に観察されました。これらの焦点は、感染後5日目までに生物発光強度の緩やかな上昇を示し、感染後7日目においても空間分布にほとんど変化は見られませんでした。その後、生物発光は著しく増加し、発光焦点は結腸全体に広がりました。感染後1日から8日目までの3つのDDライトマイクロCT再構成像は、sero deum感染の広がりを示しています。細菌感染は、近位胃腸管内の独立した焦点として始まります。3日目までに、感染は結腸へと広がります。その後数日間で、感染巣はさらに拡大し、その数とサイズが増加します。感染は7日目にピークに達します。その後、8日目には、コロニーは近位結腸と遠位結腸の2つの明確な細菌病巣に減少しました。この技術により、研究者は細菌の定着と感染のメカニズムをリアルタイムで研究し、介入戦略の有効性を調査することが可能になります。

4d-multimodality-imaging-of-citrobacter-rodentium-infections-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Valentine, M. E.ら、『 緑膿菌 におけるインフレーム遺伝子欠失変異体の生成および感染の単純なマウスモデルにおける病原性減損の検証』。 J. Vis.

生物発光を用いたマウスモデルにおける細菌感染のリアルタイムイメージング

出典: Luyts, N. ほか。 マウスにおける尿路感染症の縦断的追跡調査およびマウスにおける治療法。 J. Vis. Exp.(2021年)。このビデオは、膀胱に注入した発光 性大腸菌...

生物発光を用いたマウスモデルにおける尿路感染症の可視化

シトロrodentium感染は腸内細菌感染症を勉強するだけでなく、マウスでは免疫応答や大腸炎をホストするための貴重なモデルを提供します。このプロトコルは、障壁の完全性、病原体負荷と病原体と宿主マウス感染性大腸炎への貢献を徹底特性評価を可能にする組織学的損傷の測定の概要を説明します。...

ザ<em&gt;シトロrodentium</em&gt;マウスモデル：感染性大腸炎に勉強病原体とホスト貢献

肺炎球菌は、重症市中肺炎、世界中200万人以上の死亡の原因を引き起こす主要な病原体である。フィットネスまたは病原性に関与する細菌性因子の影響は、生物発光細菌を用いて、マウスの急性肺炎または菌血症モデルにおいてリアルタイムでモニターすることができる。...

生物発光細菌を使用してリアルタイムに急性肺炎のマウスモデルにおける肺炎球菌の毒性因子の影響を以下の

動物モデルは、慢性炎症の発展に貢献宿主および病原体特異的なメカニズムを定義する上で非常に貴重なツールであることが分かっている。ここでは、ローカルおよび全身の部位での炎症の進行を評価するために、ヒト病原体ポルフィロモナス·ジンジバリスとディテールの方法論で経口感染のマウスモデルを記述する。...

局所および全身所における病原体により誘導される慢性炎症のためのマウスモデル

このプロトコルは、臨床的に関連すると遺伝的に扱いやすい歪み、R20291を使用して、 クロストリジウム・ディフィシル感染症（CDI）のセフォペラゾンマウスモデルの概要を説明します。臨床疾患のモニタリング、 ディフィシル細菌列挙、毒素の細胞毒性、およびマウスモデルにおいてCDIを通じて組織病理学的変化を重視したプロトコルで詳述されています。...

臨床的に関連のセフォペラゾン処理されたマウスモデル<em&gt;クロストリジウム・ディフィシル</em&gt;ひずみR20291

腸管出血性発光標識細菌によるエシェリヒア属大腸菌(EHEC) の植民地化のためのマウスモデルの詳細なプロトコルが表示されます。非侵襲的生体内でイメージ投射生きている動物のシステムによってこれらの発光細菌の検出は、EHEC...

非侵襲体内生物発光システムによってマウスのホストである腸管出血性大腸菌の植民地化の検出

マイコバクテリウムの結核(結核) レポーター酵素蛍光 (REF)...

レポーター酵素蛍光を用いたマウスにおける結核菌をイメージング

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化イメージング質量分析 による...

イメージング質量分析 による 寒天上および感染組織内で増殖した細菌コロニーの微生物連携の検討

生体内顕微鏡所見の翻訳は、組織への深さの浸透が浅いという課題があります。ここでは、生体内顕微鏡と臨床的に適用可能な画像モダリティ(CT、MRIなど)の同時登録を可能にし、直接的な空間相関を実現し、生体内顕微鏡所見の臨床翻訳を効率化する可能性のある背側窓室マウスモデルについて説明します。...

トランスレーショナルがん研究における生体内顕微鏡検査と磁気共鳴画像法の併用のための背側Skinfold Window Chamber腫瘍マウスモデル

ここでは、感染時の病原菌の臓器全体にわたる検出と蛍光レポーター活性の定量化を可能にする手順について説明します。...

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

学ぶ4Dマルチモーダルイメージングを用いたマウスにおけるCitrobacter rodentium感染サイクルの可視化法。拡散光イメージングトモグラフィーとマイクロCTを組み合わせ、細菌コロニゼーションの時空間的変化をリアルタイムで追跡する技術です。

の4Dのマルチモダリティイメージング

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