携帯電話上の広視野蛍光顕微鏡と蛍光イメージングフローサイトメトリー
2013年4月11日
我々は、コンパクトでコスト効果の高い光流体添付ファイルを使用して携帯電話上の蛍光顕微鏡やイメージングフローサイトメトリーツールの統合、我々の最近の結果を確認します。これらの携帯電話基にしたマイクロ分析装置は、以下のようなリソースが限られた設定で、例えば、水試料のハイスループットスクリーニングのためだけでなく、様々な細胞計数タスクを実行するように、フローサイトメトリー分析のために有用かもしれません。
この手順の全体的な目標は、携帯電話のカメラを蛍光顕微鏡プラットフォームまたは蛍光イメージングサイトメーターに変換することです。まず、蛍光発光は、携帯電話、カメラユニット、および目的のサンプルの間に配置された取り付けられたレンズを介して収集されます。次に、アタッチメント内の単純なプラスチックフィルターが散乱した励起光を遮断し、蛍光イメージング用の暗視野背景を作成し、カメラ付き携帯電話を蛍光顕微鏡またはイメージングサイトメーターに変換します。
最後のステップでは、カメラをナイトモードで使用して、目的の蛍光粒子の写真またはビデオを撮影します。最終的に、蛍光ビーズまたは細胞は、携帯電話のカメラによって画像化され、特徴付けされ得る。従来の蛍光顕微鏡を使用するような既存の質量に対するこの技術の主な利点は、携帯電話ベースの顕微鏡がコンパクトで軽量、かつ費用対効果が高く、ポイントオブケア診断で使用できる可能性があることです。
従来の医療サービスが利用できないリソースが限られている設定では、オプト流体を組み立てるには、広視野蛍光顕微鏡をプラノ凸レンズを特定のレンズホルダー位置内の光学アタッチメントに配置することから始めます。次に、プラスチックフィルターをフィルタートレイに置き、アタッチメントにスライドさせます。次に、LEDトレイをアタッチメントに挿入します。
サンプルガラススライドをサンプルトレイに配置し、次にサンプルトレイをスライドさせてアタッチメントに挿入します。LEDをサンプルクリップに向けて、組み立てられた光流体広視野蛍光顕微鏡を携帯電話に取り付け、余分なレンズが携帯電話のカメラレンズに直接接触するようにします。次に、アタッチメントのスイッチを使用してLEDをオンにし、携帯電話のカメラで目的のサンプルを画像化します。
ナイトモードです。まれな事象を検出するために大量の液体サンプルをスクリーニングする必要がある場合は、オプト流体フローサイトメトリーデバイスを組み立てることができます。まず、A球面レンズをアタッチメントに配置します。
次に、カメラレンズの前にプラスチック吸収フィルターをテープで固定し、マイクロ流体チャンバーをアタッチメントにスライドさせます。次に、蛍光イメージングサイトメトリー用に組み立てられたオプト流体アタッチメントを携帯電話にクリップし、追加のレンズが携帯電話のカメラレンズに直接触れるようにし、アタッチメントのスイッチを使用してLEDをオンにします。次に、マイクロ流体チャネルをシリンジポンプに接続し、液体サンプルを一定の流量でマイクロ流体デバイスに供給します。
次に、携帯電話のカメラのビデオモードを使用して、マイクロ流体チャネルを流れる蛍光細胞の動画をキャプチャし、蛍光微粒子サンプルを調製します。まず、10マイクロリットルの緑色蛍光ビーズと10マイクロリットルの赤色蛍光ビーズを40マイクロリットルの脱イオン水と混合します。マイクロピペットを使用して、ビーズ混合物の10マイクロリットルをスライドガラスの上に置きます。
次に、別のスライドガラスを使用してサンドイッチ構造を作ります。最後に、サンドイッチ構造を広視野蛍光顕微鏡アタッチメントのサンプルトレイに挿入し、携帯電話アタッチメントにスライドさせます。蛍光標識された白血球サンプルを調製するには、まずEDTA採血チューブから200マイクロリットルの全血サンプルを1.5ミリリットルのポリスチレンチューブに移します。
次に、200マイクロリットルの全血サンプルに1ミリリットルの赤血球溶解バッファーを加え、5分後に完全に混合し、溶解した血液サンプルを遠心分離します。次に、上清を再懸濁液、200マイクロリットルのPBSの白血球ペレットを取り除き、遠心分離後に細胞を穏やかに混合します。再度、上清を取り除き、PBSに再懸濁します。
次に、5マイクロリットルの1ミリモルサイト16溶液を白血球に加え、サンプルをアルミホイルで30分間インキュベートします。次に、サンプルをスピンダウンした後、再度、標識された白血球ペレットをさらにPBSに再懸濁し、細胞サンプルの5〜10マイクロリットルをカバースリップに移します。サンプルの上部に2枚目のカバースリップを置き、サンドイッチしたカバースリップをサンプルトレイに挿入します。
携帯電話の蛍光顕微鏡アタッチメントを使用してサンプルをイメージングします。あるいは、標識された細胞は、ポータブルバッテリー駆動の自動シリンジポンプを使用して、マイクロ流体チャネルを介して連続的に送達することができます。次に、ビデオモードの携帯電話のカメラを使用して、流れる細胞の蛍光顕微鏡動画をキャプチャします。
蛍光細胞または粒子は、流体の流れがなくても、約10マイクロメートルの空間分解能を持つ非常に広いサンプル視野を観察できるように、静的モードでイメージングできます。例えば、この図では、緑と赤の蛍光ビーズを画像化しています。まともな画質は、中央視野の端に向かって約81ミリメートル四方の視野で達成されます。
ただし、ここには収差領域があり、蛍光標識された白血球の携帯電話画像が示されています。この挿入図は、メイン画像から蛍光標識された白血球をデジタルズームした携帯電話の画像を示しています。この挿入図では、最初の挿入図の圧縮解読結果が示されており、解読された画像は、同じ視野の従来の蛍光顕微鏡で10倍対物レンズで観察した同じ細胞サンプルと同程度の鮮明さを示しています。
このビデオを見るには、携帯電話を法医学顕微鏡またはイメージングサイトメーターに変換して、法医学ビーズまたは細胞のイメージング特性評価とコンテンツを可能にする方法についてよく理解しているはずです。
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概要
本記事では、小型のオプトフルイディクス（光流体）アタッチメントを用いて、携帯電話のカメラを蛍光顕微鏡プラットフォームまたはイメージングサイトメーターに変換する方法について解説します。この手法により、リソースが限られた環境においても、サイトメトリー分析やハイスループットスクリーニングが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 蛍光顕微鏡法
- イメージングフローサイトメトリー
- 携帯電話ベースの診断法
背景
- 蛍光顕微鏡法は、生物学的試料のイメージングに広く用いられている手法である。
- イメージングフローサイトメトリーにより、流体中の粒子の解析が可能となる。
- 従来の蛍光顕微鏡は、大型で高価な場合がある。
- 携帯電話の技術は、ポータブルで費用対効果の高い代替手段を提供する。
研究目的
- 携帯電話のカメラを蛍光イメージングツールに変換する方法を開発すること。
- さまざまな環境でサイトメトリー解析を可能にすること。
- ポイントオブケア診断のための、軽量で低コストなソリューションを提供すること。
使用した手法
- 蛍光放出を収集するためのレンズの装着。
- 散乱した励起光を除去するためのプラスチックフィルターの使用。
- スマートフォンのカメラのナイトモードを用いた蛍光粒子のイメージング。
- イメージングによる蛍光ビーズまたは細胞の特性評価。
主な結果
- 携帯電話のカメラで蛍光画像を効果的に撮影できます。
- この手法は暗視野背景を提供し、イメージングを向上させます。
- ハイスループットスクリーニングへの応用の可能性が示されています。
- 本手法は、従来の方法と比較してコンパクトで軽量であり、コスト効率に優れています。
結論
- 携帯電話ベースの顕微鏡法は、従来のシステムの実行可能な代替手段となります。
- このアプローチにより、資源が限られた環境におけるサイトメトリー解析を促進することが可能です。
- さらなる開発によって、ポイントオブケア診断への応用を強化できる可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
広視野蛍光顕微鏡法とイメージングフローサイトメトリーを携帯電話に統合することで、資源が限られた環境や分散型の環境において定量的な細胞解析を展開するという課題を解決します。このアプローチにより、初期段階の発見やトランスレーショナルリサーチに向けた、拡張可能で費用対効果が高く、ポータブルなワークフローが可能となり、従来の研究室インフラ以外でのサイトメトリーデータへのアクセスが拡大します。本プラットフォームは、検体のトリアージや予備的なターゲットバリデーションのための、現場で展開可能な迅速な意思決定をサポートします。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 汎用的なイメージングツールを用いて、細胞表現型の迅速な解析を可能にする。
- 蛍光標識した細胞集団を定量化することで、機能的なターゲットバリデーションをサポートする。
- 従来のサイトメトリー設備がない環境において、生物学的なリスク低減（de-risking）を促進する。
- 初期段階のプログラムにおいて、ポートフォリオの優先順位付け（triage）のための予備データを提供する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 下流の化合物スクリーニングワークフローに向けた、バリデーション済みの細胞ベースアッセイを調製します。
- デジタル画像およびビデオキャプチャを通じて、再現性のある定量的な出力を提供します。
- 分散型またはフィールドベースの研究におけるアッセイの標準化とスケールアップをサポートします。
- 多様なサンプルタイプにおける蛍光マーカーの信頼性の高い評価を可能にします。
トランスレーショナル＆前臨床研究
- 現場での細胞計数（例：CD4+ T細胞）を可能にすることで、トランスレーショナル・バイオマーカー戦略に適合します。
- 分散型環境における探索から前臨床検証までの連続性を維持します。
- アクセス可能なサイトメトリーデータを提供することで、リスク調整済みの進展判断を支援します。
- サンプルの品質および細胞マーカーの発現に関して、予測的なリスク低減を実現します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この携帯電話ベースのプラットフォームは、初期の発見から前臨床研究まで幅広く対応しており、集中管理型およびリモートの両方のワークフローにおいて、仮説検証、スクリーニング、およびトランスレーショナルなバイオマーカーの定量化を可能にします。
- 探索生物学：簡便な蛍光イメージングにより、仮説検証およびパスウェイの解明を促進します。
- スクリーニング：標準化されたデジタル出力を通じて、アッセイの準備状況と再現性を提供します。
- 分析：比較分析のための定量的な細胞数および蛍光強度の測定値を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：現場またはポイントオブケア設定におけるバイオマーカーの整合とサンプルの優先順位付け（トリアージ）をサポートします。
- エンタープライズ再利用：複数のプログラムや地域にわたって、サイトメトリー分析に再利用可能なポータブルな能力を確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：細胞アッセイにおける予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減する。
- 運用的価値：サイトメトリーワークフローの標準化、再現性、および拡張性を向上させる。
- 戦略的価値：迅速かつ分散的なデータ収集を可能にすることで、Go/No-go判断と資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響：リソースが制限された環境において、リスク調整後の優先順位付けと推進を支援する。
実施上の検討事項
- 試料調製および蛍光標識に関する基礎的な専門知識が必要です。
- 互換性のある携帯電話ハードウェアおよび光流体アタッチメントが必要です。
- イメージングプロトコルとデータ解析のチーム間での標準化が求められます。
- 最小限のインフラで、さまざまな細胞型や試料マトリックスに適応可能です。
- 画像品質と解像度は、ハイエンドの研究用システムと比較して制限される場合があります。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:05
Title
1:15
Opto-fluidic Attachment for Wide-field Fluorescent Microscopy
2:11
Opto-fluidic Attachment for Fluorescent Imaging Cytometry
3:13
Preparation of Fluorescent Micro-particle Samples
3:52
Preparation of Fluorescently Labeled White Blood Cells
5:18
Results: Representative Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cellphone
6:15
Conclusion
