Name: トランスレーショナル血管柄コンポジット同種移植（VCA）研究用に修正異豚後肢移植モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学ぶ 修正異豚後肢移植モデルを用いた血管柄コンポジット同種移植研究。骨髄を含む骨筋皮弁採取と腹部皮下ポケット移植により、免疫調節プロトコルの免疫学的転帰を評価する信頼性の高い大動物モデルを確立する方法です。

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Kakaliサルカール、PhDは、Joaniクリステンセン、B​​S、ケイトBuretta、BS、ナンス元、BS、ウィリアムLehao​​、メリーランド、ヨハンナGrahammer、ゲオルクFurtmüller、MD、エリンラダ：私たちは、このプロジェクトへの貢献のために以下の個人を認識したいと思いますMDは、モハメッドアル·羅漢MD、カリムSarhane MD、サーメKhalifian、BS、真央チー、MD、そしてアンジェロレトバローネMD、VCA研究所、プラスチックおよび再建外科、医学のジョンズホプキンス大学医学部、ジャニス·タウベ、MDは、マーク·フィッシャー、MD、皮膚科病理医学のジョンズホプキンス大学医学部、スーEllerの、低侵襲手術トレーニングセンター、医学のジョンズホプキンス大学医学部とチェン·フン·リン、メリーランド州長庚記念病院、林口、台湾の部門。 資金源：再生医療の軍研究所（DOD W81XWH-08-2から0032）

このビデオ出版物では、すべての動物の手続きは、ジョンズホプキンス大学施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認された動物のプロトコルに従って行った。 1。術前計画<ol><li>私たちは、MGHが1男性のドナーは二人の女性の受信者の手足（ 図1）を提供し、ここで四肢同種移植のための私達の翻訳の研究でミニブタ（15〜kg）を同系交配のMHC定義利用する。手術前に、ドナーとレシピエント動物は獣医によって徹底的な臨床評価を受ける。 </li><li>麻酔および虚血時間を最小限にするために、ドナーとレシピエントの手順は、1つの専用の大型動物手術室で3つの動作のテーブル上で同時に行われる。外科チームだけでなく、獣医スタッフのチームワークとの連携は、この手順の全体的な成功のために重要である。手術計画は正式な会議で獣医チームと議論されている1手術前の日に-2週間。 </li><li>トンネル型中心静脈カテーテル（7神父ダブルルーメンヒックマンカテーテル）、免疫抑制薬のレベルの監視や免疫抑制の静脈内投与および/または免疫調節薬の移植前に、各レシピエント動物の外部または内頸静脈に配置されます。これらのカテーテルは、静脈切開技術により直視下に置き、背側首と上の高終了するには、後方にトンネリングされるモノフィラメント非吸収性縫合糸と首周りの接着剤包帯ラップを使用して保護。 </li><li>手術前に、動物の特定非営利活動法人（固形食品が、水のアドリブ許可されていない）少なくとも12時間にしてください。 </li><li>手術の日に、ケタミン20 mg / kgのとキシラジン2 mg / kgのIMと落ち着いた動物。 </li><li>適切なサイズの気管内チューブを配置し、麻酔器や人工呼吸器に接続します（イソフルラン0.5から3パーセントに維持される） </li><li>辺縁耳静脈に静脈内カテーテルを配置し、管理する作業中は重量ベースの0.9％生理食塩水。 </li><li>先制鎮痛（ブプレノルフィン0.02 mg / kgのIVを）管理する。 </li><li>前ドナーとレシピエント動物の両方に最初の切開するための予防的抗生物質（セファゾリン20〜25 mg / kgのIVを）管理する。 </li><li>受信者とドナーの両方のためのすべての手順で無菌技術を使用してください。これはオートクレーブ処理やガス滅菌器、マスク、ヘッドキャップ、無菌手術用ガウンと滅菌手袋の使用を含む。バリカンで切開の面積を剃るとベタジン液とアルコールを交互に消毒。 </li></ol>術中モニタリング： <ol><li>誘導および挿管した後、酸素吸入混合物0.5から3パーセントイソフルランで麻酔を維持。 </li><li>連続して心拍数、パルスオキシメトリ、心電図、呼気終末CO 2および直腸温度を監視し、15分毎に記録します。 </li><li>ベアーハガー暖かい強制空気毛布で低体温を防ぐ。 </li></ol><ol><li>手術台に仰臥位でドナー動物を配置し、無菌的にドレープ。 </li><li>前内側皮膚に穴あけ血管を識別するために、近赤外レーザー血管造影を使用してください。末梢血管アクセスを通して生理食塩水2〜5中に希釈し、インドシアニングリーンは約0.06 mg / kgで注入する。約10秒後に、近赤外の録音の30秒2分を実行します。穴あけを識別するために、これらの録音からのビデオを使用してください。穿孔をもとにして、監視のために皮膚の領域（約100 cm 2）をマークする。 </li><li>肌のパドル（ 図2）のためのマーキングとの連続性における鼠径部の皮膚切開を作るためにメスを使用してください。 </li><li>大腿血管を特定し、suprageniculate枝のレベルにし、近位に鼠径靱帯のレベルまで遠位にそれらを分離します。 </li><li> preservinながら皮膚や皮下組織を切開G皮膚パドルの面積。フラップの収穫の際に収縮を避けるために、筋肉を根底に、皮膚の縁を縫合。 </li><li>ただ往復のこぎり（電気ペンドライブ、シンセス、ウエストチェスターPA）を使用して、瞼板の上に骨切りを行う。 </li><li>電気メスを使用して、近位大腿部の筋肉を分ける。 </li><li>血管茎上osteomyocutaneousフラップを残し半ば軸に大腿骨を分割。フラップは、太ももの筋肉、膝関節、大腿骨遠位端とそのユニークな免疫学的機能を備えた完全な血管新生し、骨髄が含まれて近位脛骨の基礎となる、肌のパドルが含まれています。 </li><li>骨髄空間で止血を達成するために、骨のワックスを使用してください。スムーズな骨は、受信者の準備のためにronjeursを使用してエッジ。 </li><li>受信者の大腿血管が（ 図3）を用意するまでその血管茎上に灌流移植片を保管してください。 </li><li>受信者の解剖が完了すると、可能なAのような近位のドナー大腿血管を結紮ND移植前にヒスチジン - トリプトファン - ケトグルタル（HTK、Custodiol、ニュータウン、PA）で移植片を注入。 注：ドナー四肢は、受信者と受信者の左側に適したドナー四肢）の右側左ドナー四肢すなわち 、受信者の反対側に移植する。 </li><li>すぐに100 mg / kgのIV型ペントバルビタールナトリウムを用いて第後肢を収穫した後のドナー豚を安楽死させる。死が確立されたプロトコルごとの獣医スタッフによって確認された。 </li></ol> 4。受信者の手順（後肢同種移植） <ol><li>ドナー手足が収穫されている間に、受信者の血管の製造を可能にするために、すぐに最初のドナー切開後に受信者の誘導及び挿管を開始します。これにより、不要な待ち時間をなくし、ドナーとレシピエントの総麻酔時間が短縮されます。 </li><li>アロに操作側30°回転して、動物の仰臥位を置き背側のワット暴露。 </li><li>鼠径部切開を行い、大腿血管を公開し、suprageniculate枝のレベルにし、近位に鼠径靱帯のレベルまで遠位にそれらを分離します。 </li><li>グラフト挿入図（ 図4）のために背側腹壁に脚の付け根から皮下ポケットを作成します。 </li><li>ドナー血管を結紮し、HTKで移植をフラッシュします。 </li><li>反転してグラフトインセットを行います。肌パドルは、血管上の任意の緊張せずに、エンドツーエンドの血管吻合を可能にするために立ち位置や尾側に面した大腿血管の切断端に簡単に免疫監視を可能にするために背外側に直面したことがあります（ 図5）。 </li><li>可能な場合は、（サイズ2.5〜10〜20キロの動物に適しています）静脈吻合のための脈管連結装置（Synovis、セントポールミネソタ州）を使用します。これは、有意に、従来の方法に比べて虚血時間を短縮する。 </li><li>動脈anastを行う9-0縫合糸（Synovis、セントポールミネソタ州）で、従来の縫合技術を用いてomoses </li><li>血管開通確認後、3-0 PDS縫合糸（ 図5）で所定の位置に移植片を固定します。移植片の筋肉を腹壁の筋肉に縫合されています。ケージの周りの時に動物が移動し、それが有害であり得るので、移植の筋肉は、受信者の太ももの筋肉に縫合してはならない。 </li><li>免疫監視のための背側の皮膚パドル（ 図6）を体外にと3-0ビクリル皮下縫合糸および4-0モノフィラメント吸収中断皮膚縫合糸を使用して、隣接する皮膚に縫合。 </li><li> 3-0ビクリル皮下縫合糸および4-0モノフィラメント吸収中断皮膚縫合糸を使用して層状に脚の付け根の皮膚を閉じます。 </li><li>術後鎮痛のため50〜100マイクログラム/時のフェンタニルパッチを配置します。 </li><li>後肢同種移植片移植後、一回目を覚まし、独自に楽に呼吸する、そのペンに動物を戻す。</li>
</ol>

<ol><li>Barth, R. N., Rodriguez, E. D., Mundinger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+bone+marrow-based+immunosuppression+inhibits+rejection+of+vascularized+composite+allografts+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Vascularized bone marrow-based immunosuppression inhibits rejection of vascularized composite allografts in nonhuman primates.</a> Am. J. Transplant. 11 (7), 1407-1416 (2011).</li>
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<li>Wachtman, G. S., Wimmers, E. G., Gorantla, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologicals+and+donor+bone+marrow+cells+for+targeted+immunomodulation+in+vascularized+composite+allotransplantation%3A+a+translational+trial+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Biologicals and donor bone marrow cells for targeted immunomodulation in vascularized composite allotransplantation: a translational trial in swine.</a> Transplant Proc. 43, 3541-3544 (2011).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

歴史的には、異後肢移植プロトコルは、腹側腹壁に皮膚パドルの具象化が含まれており、血管は、エンド·ツー·サイド方式（Hettiarachty 2004）に吻合された。しかし、我々の修正された方法では、反転フラップがinsettingとエンドツーエンドの吻合は、より横方向に、皮膚のパドルを持参し、それ故に動物の立ち位置での免疫監視を容易にします。さらに、近赤外レーザー血管造影を使用して腓腹動脈の同定と、最大灌流のゾーンは、肌のパドルの信頼性を向上させる。 我々の修飾された技術では、微小血管吻合術に関連する技術的な障害を最小限にするために、大腿血管の間のエンドツーエンドの吻合を行う。エンド·ツー·エンドの吻合は、さらに温虚血時間を減少させた静脈吻合のための血管結合デバイス（Synovisセントポール、MN）を使用することができました。我々の経験では、虚血時間はより予測した結合装置を用いておよび虚血時間の変動が直接、免疫学的転帰と相関することができるので、本変形例では、このモデルの信頼性を向上させる。しかしながら、結合装置の使用は、追加の材料コストをもたらすが、それでも費用対効果の高い手順...

このような、手や顔の移植などの血管新生したコンポジット同種移植（VCA）は、現在、世界12行われ、多数の手や顔の移植の臨床の現実である。初期及び中間結果が良好で高2を奨励しているという事実にもかかわらず、慢性多剤免疫抑制の必要条件は、その広範な臨床応用を制限し続けています。超顕微吻合とnonsutureカフ技術13を含め、VCAのマウスモデルにおける進歩は、3は VCAにおける同種免疫応答のより良い理解に道を開いてきた。免疫プロトコルの無数のVCAの免疫メカニズムのよりよい理解に基づいて臨床応用のために提案されているが、それらは人間の7でのパフォーマンスの合理的予測となり、大きな動物モデルで検証する必要がある。人間とブタの臓器系の間の生理学的および免疫学的類似性に基づいて<sup&gt; 6、ブタVCAモデルが信頼できると考えることができ、費用対効果の高い代替物9および非ヒト霊長類モデル1をイヌする。 この記事では、VCAに対する免疫寛容を誘導するので、その臨床応用を広げることを目的とした当社の現在および将来の免疫調節戦略の土台となって私たちのMHC定義豚異後肢移植モデルで使用される方法の詳細な概要を提供します。我々は、特に移植関連の研究11での使用のために豚白血球抗原遺伝子座でホモ接合に交配十分に特徴付けられた近交系豚を利用している。私たちは、大腿血管に基づく血管化osteomyocutaneousフラップを上げる。フラップは、遠位大腿骨と脛骨近位端にそのまま血管化骨髄が含まれています。前内側大腿皮膚も移植に含まれており、ほとんどの免疫原性成分Oの免疫監視のためのレシピエント動物の背外側側面に露出されているVCA F。背外側位置決め位置を立って座っての臨床試験を容易にし、また、比較的きれいな同種移植片肌を保ちます。 Ustener ら近交系ファーム豚15ラジアル前肢osteomyocutaneousフラップを移植することにより、VCAの最初の大型動物の翻訳モデルのいずれかを導入しました。基は高度に免疫原性の皮膚成分を含まVCAにおける急性拒絶反応は、有意な薬物特異的合併症および副作用を伴わずに遅延され、臨床的に関連する戦略で治療することができることを初めて実証するために、このモデルを利用した。本研究で得られた良好な結果は、その後人間の再建移植のための薬物療法を設計する際の基礎的なステップを構築しました。これらの初期の豚のVCAモデルは皮膚、筋肉、骨、神経、彼らはこのような関節cartilagなど特殊な構造を欠いていた血管の拒絶反応を防ぐためにプロトコルを開発するのに適していたがEと関節の滑膜。その後の努力が、移植片の抜け14を防ぐために、完全長のキャストの配置を必要とした動物の中間の数字を含む焦点を当てていた。四肢移植のすべての主要な構成要素の拒絶反応を調査するのに適していますが、このモデルの主な制限の1つは、配置をキャストによる移植後、歩行困難だった。したがって、異ブタ四肢同種移植モデルは、脛骨から成る、腓骨、膝関節、遠位大腿骨、周囲の筋肉および皮膚のパドルは、動物が自由に最小限morbidit 8術後歩き回るさせながら、主にVCAの免疫学的側面 ​​を研究するために作成された。 デビッドH.サックスの先駆的な仕事を通じて十分に特徴付けられたSLA定義の近交系豚の開発は翻訳のVCA研究の新時代をもたらした。マイナー抗原不一致の設定で異後肢移植モデルを利用して、マットHES ら 10は、シクロスポリン治療の短期コースと筋骨格部品の無期限の生存を示した。無治療対照と比較した場合、スキンコンポーネントの生存は、しかし、唯一の延長された。移植片の皮膚成分の損失は、表皮は、特に、単離された、高度に活発な免疫応答に起因するものであった。それでも5を拒否された瞬間T細胞枯渇に完全にミスマッチのブタを用いて、シクロスポリン及びサイトカインの短期コースは、筋骨格系の構成要素および皮膚成分に対する寛容を誘導したドナーの末梢血単核細胞を動員した。 「スプリット寛容」と呼ばれるこの現象は、これまでに実施し、再建移植の大多数の不可欠な要素である高い免疫原性皮膚コンポーネント、上の大きな焦点とVCA研究におけるパラダイムシフトをもたらした。 この修​​正モデルでは、ligatinにより、エンドツーエンドの吻合を利用するグラム受信者大腿動脈、それを回転させます（ 図1）を頭側。これは、従来のカップリング装置の使用を可能にすることによって虚血時間を短縮しなく吻合故障の可能性を低下させるだけでなく。私たちは、側副血行路がネイティブ脚に血管分布を提供するのに十分であることを示している私たちのレシピエントにおける大腿動脈の結紮後の任意の虚血性イベントを確認されていません。従来のモデル10における腹鼠径部位置とは対照的に（ 図1）また、この変形方法では、皮膚の外部化成分が下地穿孔、血管に基づいて、動員され、横方向に配置されている。これは、動物の立ったり座った姿勢での免疫監視のための移植を容易に可視化することができます。 従って、信頼性と再現性大型動物モデルは、VCAのスキンコンポーネント向かっ寛容誘導戦略を調査し、新規nを開発することが不可欠である移植片の生存をより良く予測するためのoninvasive免疫監視戦略。

<table><tbody><tr><td colspan="4">試薬</td></tr><tr><td>HTK</td><td>カストディアル</td><td>N/A<td</td><td></td></tr><tr> colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>電動ペンドライブ</td><td>シンセ、ウェストチェスターPA</td><td>05.001.011</td>レ<td>シプロソー</td></tr>血管<tr><td>結合装置</td><td>Synovis、ニュータウンPA</td><td>21003B</td><td></td></tr></tbody></table>

トランスレーショナル血管柄コンポジット同種移植（vca）研究用に修正異豚後肢移植モデル

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Research

このような、手や顔の移植などの血管新生したコンポジット同種移植（VCA）は、複雑な筋骨格外傷や壊滅的な組織損失のための実行可能な治療の選択肢を表します。有利性の高い有望な初期及び中間機能的転帰にもかかわらず、VCAと慢性多剤免疫抑制の潜在的な悪影響の高い免疫原性皮膚構成要素の拒絶は、VCAの広範な臨床応用を妨げ続けている。したがって、この小説分野の研究は、VCAのユニークな免疫学的機能に関連するトランスレーショナル研究に集中することと長期的な免疫抑制を必要とせずに、VCAを以下の免疫調節および寛容誘導のための新規の免疫調節戦略を開発する必要があります。 この記事では、MHCに定義された豚異後肢同種移植におけるosteomyocutaneousフラップで構成されているVCAの信頼性と再現性の並進大型動物モデルについて説明します。ブライefly、十分に血管、皮膚のパドルは、近赤外レーザー血管造影を使用して前内側腿領域で識別されます。下にある筋肉、膝関節、大腿骨遠位端と脛骨近位大腿血管茎に収穫される。この同種移植片は、VCAとそのユニークな免疫特権的機能を備えた血管化、骨髄移植の両方が考えられる。移植は、免疫監視のために背外側領域に体外に皮膚の成分とレシピエント動物の皮下腹部のポケットに移植されている。 三つの外科チームは、それにより、このモデルの効率を改善し、実験プロトコルの潜在的な交絡因子を減少させる、麻酔及び虚血時間を減少させるために十分に協調して同時に動作する。このモデルは、削減し、潜在的にVCAの慢性多剤免疫抑制の必要性を排除することを目的とし、将来の治療戦略のための基礎として役立つ。

二十四SLAに定義されたブタ異後肢移植は、78分（：62から94分の範囲）の平均虚血時間が我々の修飾された技術を用いて行った。グラフトインセットと背外側皮膚パドルの位置は全ての動物において困難なく達成された。近赤外レーザー血管造影は、すべての受信者に優れたグラフト灌流を示した。最後の12の静脈吻合、血管結合装置を使用して実施している間、最初の12の静脈吻合術は従来の縫合技術を用いて実施した。静脈血栓が直後の手順を確認した際に、従来の縫合技術の一つの動物は、再吻合を必要とした。合併症は、連結装置を用いて行っ任意吻合観察されなかった。レシピエント動物は、またはドナーの骨髄（BM）注入および共刺激遮断薬なしのタクロリムス単独療法の短期コース（30日間）を受けた。タクロリムス投与は、目標レベルを達成するように調整した<html> 10月15日ng / mlの。短いコースのタクロリムスおよび未処理動物を対照とした。免疫プロトコルベースの​​共刺激遮断は、6ヶ月の生存移植後の上となりました。いずれのレシピエントにおけるGVHDの証拠はなかった。すべての長期生存（150日先以降の移植後）は、VCAの骨髄コンポーネント（ 図7）</st...

血管化コンポジット同種移植（VCA）は、臨床現実のものとなっている。ただし、VCAの広範な臨床応用は、慢性多剤免疫抑制によって制限されます。著者らは、最小化または潜在的にVCAにおける免疫抑制の必要性を排除することができる新規免疫調節戦略を変換するために、信頼性と再現性のある大規模な動物モデルを提示する。

トランスレーショナル血管柄コンポジット同種移植（VCA）研究用に修正異豚後肢移植モデル

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma ...

本実験の全体的な目的は、臨床的に関連のある免疫調節プロトコルの免疫学的結果を研究するため、無傷の血管付き骨髄を含む後肢移植の信頼性と再現性の高い大動物トランスレーショナルモデルを確立することである。これは、まず、血管付き複合同種移植（VCA）の皮膚成分と血管付き骨髄の特有な免疫学的特徴を研究するために、骨筋皮弁を採取することによって達成される。次に、この同種移植片を腹壁の皮下ポケットに移植する。これにより、レシピエントの移動能力を妨げることなく、技術的に実行可能なモデルとなる。次に、動物が立位の状態での直接的な視覚的観察によって移植片をモニタリングできるよう、皮膚成分を腹壁背外側に外在化させます。結果として、本手法は、細胞治療や生物学的製剤を用いた臨床的に重要な免疫調節プロトコルの検証において、信頼性と再現性の高いモデルであることが示されました。VCAのイヌや非ヒト霊長類モデルなどの既存モデルに対する本手法の主な利点は、費用対効果が高く、人獣共通感染症のリスクが極めて低いこと、そしてSLAが定義されたドナー株およびレシピエント株が存在することです。この手法は、血管付き骨髄の特異な免疫特権的性質に関する再建移植分野における重要な疑問への回答に寄与し、免疫抑制を最小限に抑える臨床的に有用な免疫調節プロトコルの開発への道を開くものです。私たちは約20年前に、肢体同種移植片のさまざまな構成要素の免疫原性を検証し、スプリット・トレランス（分割耐性）現象を実証したこの移植モデルの概念を最初に開発しました。同種移植肢体を採取する前に、ドナー豚を鎮静させ、処置全体を通してイソフルラン、フルーレン、および酸素を投与するために人工呼吸器に接続します。手術部位の除毛、洗浄および消毒を行った後、ドナー動物を手術台の上に仰臥位で配置し、滅菌ドレープで覆います。次に、近赤外線レーザー血管造影を用いて、中間皮膚への穿通枝を特定します。その後、末梢血管アクセスから生理食塩水で希釈したインドシアニングリーンを注入します。約10秒後、近赤外線記録を30秒から2分間行います。次に、特定された穿通枝に基づき、後に免疫モニタリングに使用するスキンパドルのための皮膚領域にマーキングを行います。眼瞼反射および趾つまみ反射によって動物の麻酔深度を確認した後、メスを用いてマーキングに沿って鼠径部の皮膚を切開します。皮膚領域を温存しながら、皮膚および皮下組織を剥離し、スキンパドルを作成します。フラップ採取時の収縮を防ぐため、皮膚の端を下層の筋肉に縫合します。次に大腿血管を同定し、鼠径靭帯より近位で単離します。皮膚パドルまで遠位の分枝をすべて結紮し、往復のこぎりを用いて4 cmの最適な長さを確保します。足関節の直上で骨切り術を行います。次に、電気焼灼器を用いて大腿近位部の筋肉を切開します。ドナーの大腿骨を骨幹の中央レベルで切断し、血管付き皮膚パドル上の骨筋皮弁を作成します。この皮弁には、皮膚パドル、その下の大腿筋、大腿骨下部および膝関節、脛骨上部が含まれており、したがって血管が維持された骨髄がそのまま保持されています。ドナー移植片は特有の免疫学的特徴を持つため、レシピエントの大腿血管の準備が整うまで、血管茎を介して灌流を維持してください。ドナーへの切開を開始した直後に、レシピエントの豚を人工呼吸器に接続し、ドナー豚と同様にイソフルラン麻酔を開始します。生理食塩水投与用のカテーテルを挿入し、先制的なブプレノルフィンおよび予防的抗菌剤を投与します。動物を仰臥位に固定し、背外側表面を十分に露出させ、麻酔深度を確認します。次に、鼠径部を切開して大腿血管を露出し、鼠径靭帯のレベルから遠位および近位に3〜4cmにわたって血管を単離します。その後、グラフトを挿入するために、鼠径部から腹壁背外側にかけて皮下ポケットを作成します。次にドナー血管を結紮し、ヒスチジン・トリプトファン・ケトグルタル酸（HTK）溶液を用いて移植組織をフラッシュします。これがドナーからの最終的な採取である場合は、動物実験プロトコルに従って直ちに動物を安楽死させ、グラフトの挿入を行います。血管カップリングデバイスを用いて血管に緊張がかからない状態で吻合できるよう、大腿動脈の切断端が適切に向くように逆向きに配置します。利用可能な場合は、静脈吻合を準備します。このデバイスにより、虚血時間を大幅に短縮できます。次に、血管の開通を確認した後、8-0縫合糸と標準的な縫合技術を用いて動脈吻合を行います。免疫モニタリングのため、3本のOPDS縫合糸を用いて、移植片の筋肉を受容者の腹壁筋に縫い付け、移植片を固定します。背外側のスキンパドルを外方へ展開します。次に、3-0 Vicryl縫合糸で深層を縫合し、4-0 モノフィラメント吸収性縫合糸を用いて、組織を受容者の皮膚に結節縫合で固定します。最後に、3-0 Vicrylを用いて皮下を層状に縫合し、続いて4-0吸収性モノフィラメント糸を用いて皮膚を結節縫合で閉じます。術後の鎮痛のため、動物が覚醒し自力で快適に呼吸できるようになった時点で、50 µg/hのフェンタニルパッチを貼付します。動物をケージに戻し、自由摂取で餌と水を与えます。最初の24時間は4時間ごとに、その後は1日2回、痛みや苦痛の兆候がないか動物を観察します。我々の改良法を用いて、19例のMHC定義豚後肢異種移植を実施しました。これらの移植は、VCAにおける免疫寛容を誘導するための治療戦略を開発することを目的として実施されました。このモデルは、長期拒絶反応を伴うVCAの免疫寛容に向けた新たな治療戦略の開発に有効に活用されました。従来の免疫抑制剤の中止により、拒絶反応のない生存対照群において移植片拒絶の加速が認められました。習得すれば、適切に行った場合、ドナー肢1本につき1〜2時間、レシピエントの手術1回につき2〜3時間で完了させることができます。この手順を行う際は、ドナーの対側肢をレシピエントの腹壁ポケットに移植し、右肢を左鼠径部に、左肢を右鼠径部に移植することを忘れないことが重要です。この手法は、再建移植分野の研究者が、生涯にわたる免疫抑制の必要性を最小限に抑え、それによってこの革新的な治療法のリスクとベネフィットのバランスを改善し得る、新しい免疫調節プロトコルを探索するための道を切り開きました。このビデオを視聴することで、血管新生した骨髄を保持した異所性後肢移植の技術的側面について十分に理解できるはずです。この信頼性と再現性の高い肢移植モデルは、慢性的かつ多剤併用による免疫抑制の必要性を最小限に抑え、潜在的に排除することを可能にする、新しい免疫調節プロトコルの開発に寄与します。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

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