Name: プロテインWISDOM：ベンチ用インシリコでデノボデザイン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 学ぶProtein WISDOMを用いた計算的手法によるデノボタンパク質設計。構造アップロード、変異制約の定義、配列最適化を通じて、安定性と結合親和性が向上したタンパク質を設計・検証する方法を解説。

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CAFは、NSF、NIH(R01 GM52032;R24 GM069 736)、および米国環境保護庁、EPA(R 832721-010)です。この研究の一部は、国防総省(Air Force Office of Scientific Research)の政府の支援を受けて実現しました。JSはNIH(P50GM071508-06)からの支援に感謝しています。 MLBPは、National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship(32 CFR 168a)からの支援に感謝します。GAKは、米国国立科学財団大学院研究フェローシップ(助成金番号DGE-1148900)からの支援に感謝します。

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

de novoタンパク質設計フレームワークは、配列選択段階と検証段階の2つの段階で構成されています。このフレームワークは、剛性と柔軟性のあるデザインテンプレートを処理するのに十分な堅牢性を備えており、単一のタンパク質デザインまたは複雑なタンパク質デザインに適用できます。このフレームワークは、数十の疾患に応用できる多数のタンパク質システムへの適用に成功しています。多くのデザインが実験的に検証されており、これまでに発見されたいくつかのタンパク質の最も強力な阻害剤またはアゴニストを提供しています。このフレームワークは、Protein WISDOMを介して学術コミュニティに提供されるようになりました。
この方法には 3 つの重要なステップがあります。1つ目は、タンパク質設計にグローバル最適化技術を採用した配列選択段階です。タンパク質設計問題は、非常に複雑な問題です(n個の変異可能な位置に対して20個の可能な配列)。この数は、実験計画法で考慮できる可能なシーケンス数よりも大幅に多くなります。突然変異と生物学的制約をさらに組み込むことで...

De novoタンパク質設計は、改善された特性または機能を持つ望ましい三次構造を生成するタンパク質配列の同定です。タンパク質のネイティブフォールドは自由エネルギー最小値にあるコンフォメーションであるため、de novoタンパク質設計では、ターゲットフォールドに自由エネルギー最小値を持つ配列を探します。この問題は、Drexler1 と Pabo2 によって最初に記述され、"逆折り畳み問題" と呼ばれました。しかし、1つの配列が1つのフォールディング構造解しか得られないタンパク質フォールディング問題とは異なり、de novoタンパク質設計問題では縮退が見られます。多くの異なるアミノ酸配列は、同じ三次構造と機能をもたらすことができます。
タンパク質設計は伝統的に合理的な設計と指向性進化を通じて実験的に行われてきましたが、最近では、実験方法に固有の限られた探索空間を克服するために計算方法が採用されています。決定論的手法、確率論的手法、確率論的手法など、さまざまな計算手法が使用されています。3,4 初期の計算方法では、固定バックボーンテンプレートを使用して、問題を解決しやすくしました。5-7 より高速なプロセッサ、高性能コンピューティング、およびより効率的なアルゴリズムの出現により、バックボーンの柔軟性は、固定バックボーンテンプレートのアンサンブル8-14を使用することによって、または原子間距離と二面角の範囲の観点からテンプレートを表現することによって真のバックボーンの柔軟性を組み込むことによって組み込まれるようになった。15,16
この論文では、Protein WISDOMについて詳細に説明しています。これは、私たちの計算de novoタンパク質設計フレームワークを利用するために学術コミュニティに利用可能になったオンラインツールです。このフレームワークは、HIV、がん、補体疾患、その他の自己免疫疾患などの疾患を標的とした治療用途のために、多数のタンパク質の設計に適用されています。予測されたペプチドの多くが実験的に検証され、この方法の威力が実証されました。表1は、タンパク質またはペプチドのサイズ、予測数、実験検証など、設計されたさまざまなタンパク質の概要を示しています。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>タンパク質設計</td>
			<td>タンパク質の長さ</td>
			<td># 計算予測の数</td>
			<td># の実験的検証</td>
			<td>参考</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ヒトβ-defensin-2の全配列設計</td>
			<td>41</td>名
			<td>340</td>名
			<td> </td>
			<td>(17)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ヒトC3のコンプスタチン阻害剤</td>
			<td>13</td>名
			<td>28</td>名
			<td>3月3日</td>
			<td>(18、19)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ラットC3cに結合するコンプスタチン類似体</td>
			<td>13</td>名
			<td>5</td>
			<td> </td>
			<td>△ 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ジセリン伸長を伴うコンプスタチン類似体</td>
			<td>15</td>名
			<td>8</td>名
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>コンプスタチンアナログW4A9の安定化構造</td>
			<td>13</td>名
			<td>18</td>名
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C3a受容体アゴニストおよびアンタゴニスト</td>
			<td>77</td>名
			<td>20</td>名
			<td>4月7日</td>
			<td>(21)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C5a受容体作動薬およびアンタゴニスト</td>
			<td>74</td>名
			<td>61</td>名
			<td>61年2月</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 gp14阻害剤</td>
			<td>12</td>名
			<td>6</td>
			<td>4月5</td>日
			<td>(22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 gp120阻害剤</td>
			<td>9</td>
			<td>14</td>名
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bcl-x LおよびBcl-2のBak阻害剤</td>
			<td>16-18</td>歳
			<td>10</td>名
			<td>5月5日</td>
			<td>(23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK2の阻害剤</td>
			<td>11</td>名
			<td>25</td>名
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZH2の阻害剤</td>
			<td>21</td>名
			<td>17</td>名
			<td>10月10日</td>
			<td>(24)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSD1およびLSD2の阻害剤</td>
			<td>16</td>名
			<td>41</td>名
			<td>20月17日</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR1の阻害剤</td>
			<td>13</td>名
			<td>6</td>
			<td> </td>
			<td>(25)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNPの阻害剤</td>
			<td>5</td>
			<td>13</td>名
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1.de novoタンパク質設計フレームワークを使用して設計されたタンパク質およびペプチドの要約。計算予測の#は、好ましい予測の数として表されます(つまり、特定のカットオフを超える特異性、またはネイティブシーケンスよりも大きい近似結合親和性)。実験検証の#は2つの数値を示します:1つ目は実験的に検証された予測の数、2つ目は実験的にテストされた予測の総数です。
ペプチドの抗菌特性を高めるために、ヒト-β-ディフェンシン-2(hβD-2)の設計を行いました。17 このデザインでは、1)hβD-2に沿った最大10の変異、および2)システインを除くすべてのhβD-2残基位置のフルシーケンスデザイン(8、15、20、30、37、および38)の2つのケースを考慮しました。このデザインでは、3つの異なるデザインテンプレートと3つの異なるシーケンス選択モデルが使用されました。10個の突然変異デザインと全配列デザインの両方について、加重平均モデルと距離ビンモデルの間で、突然変異の類似性が高いレベルが観察されました。さらに、多数の配列が、ネイティブ配列よりも有利に計算されたフォールド特異性値を持つことがわかりました。
補体系阻害剤(C3、C3a、C5a)は、脳卒中、心臓発作、アルツハイマー病、喘息、関節リウマチ、異種移植の拒絶反応、成人呼吸器疾患、乾癬、クローン病などの多くの免疫疾患と戦うために設計されました。タンパク質設計フレームワークによって予測されたC3cの3つのコンプスタチン阻害剤と合理的に設計された3つの配列が、天然のコンプスタチンよりも優れた結合剤であることが実験的に検証されました。18,19
さらなる研究では、非霊長類のC3cに対するコンプスタチンの活性の喪失を調べ、ラットとマウスのC3c阻害剤の候補をいくつか設計しました。5つの配列は、C3cを阻害することが知られているW4A9コンプスタチン変異体よりもラットC3cとの良好な関連自由エネルギーを持っていることが示されました。これは、Arg1による新たな塩橋形成によるものです。20 N末端伸長を有する8つの配列は、ジセリン伸長を有するW4A9よりも優れた結合剤であると予測された。最後に、18のコンプスタチン配列がW4A9の結合したコンフォメーションを安定化すると予測され、霊長類および非霊長類のC3c阻害剤の強力な候補を提供しました。
C3c阻害剤に加えて、C3aおよびC5a受容体アゴニストおよびアンタゴニストは、C3aおよびC5aの構造に基づいて設計されました。モデルによって予測された7つのC3a配列を実験的にテストしました。配列のうち2つは強力なアゴニストであり、他の2つは部分的なアゴニストでした。21 2つの強力なアゴニストは、以前に発見された「スーパーアゴニスト」よりも58倍の改善を示しました。C5a受容体アゴニストおよびアンタゴニストの設計により、61の配列のセットが提供されました。すべての配列が合成され、2つが新規のC5aアゴニストであることがわかりました。
HIV-1の融合阻害剤は、HIV-1が細胞に感染するのを防ぐために設計されました。最初の設計は、HIV-1のエンベロープ糖タンパク質であるgp41を対象としていました。タンパク質設計フレームワークは、ネイティブ配列よりも優れた結合剤である6つの配列を予測しました。これらの予測配列のうち4つは、HIV-1を阻害することが実験的に検証され、最良の配列はIC50が29μMと低かった。この配列は、天然配列よりも3〜15倍の改善を示し、エンフビルチド耐性ウイルス株に対する活性の損失はありませんでした。22 2番目のデザインは、HIV-1の別のエンベロープ糖タンパク質であるgp120を対象としていました。14の配列はgp120の結合剤であり、HIV-1の追加の潜在的な融合阻害剤を提供すると予測されました。
がんに関連する多数のタンパク質が、がん治療の有望な標的を提供しました。Bcl-2およびBcl-xLは、細胞死を防ぐ抗アポトーシスタンパク質です。これら2つのタンパク質の阻害剤は、がん細胞の細胞死を誘導するように設計されました。10の配列がネイティブよりも優れた結合剤であると予測され、これらの結果は以前の実験結果と突然変異誘発結果を捉えました。23 別の標的タンパク質であるERK2は、シグナル伝達カスケードに関与しており、抗増殖性がん治療の有望な標的となっています。25の配列がERK2の阻害剤であると予測されました。
ヒストンメチルトランスフェラーゼと脱メチル化酵素は、前立腺、乳がん、リンパ腫、骨髄腫、膀胱、結腸、皮膚、肝臓、子宮内膜、肺、胃など、多くのがん種に関連するヒストンメチル化を動的に制御します。de novoタンパク質設計フレームワークにより、EZH2(リジンメチルトランスフェラーゼ)の17の阻害剤が特定され、実験的にテストされた10のすべてがEZH2を阻害することがわかりました。24 最も強力なペプチドは、約13μMのIC50を有し、酵素濃度の上昇に対しても同等に効果的であり、補因子と競合しませんでした。これらのペプチドは、EZH2の阻害剤の最初のセットでした。フレームワークにより、LSD1(デメチラーゼ)の阻害剤53が予測され、実験的に試験された20の阻害剤のうち、17がLSD1の阻害剤、18がLSD2の阻害剤であった。最も優れた阻害剤は、IC50の値が1 μM未満であったため、これまでに発見されたペプチド阻害剤の中で最も強力です。
最後の2つのタンパク質システムは、セリアック病、1型糖尿病、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、チャーグ・シュトラウス症候群、橋本甲状腺炎、バセドウ病、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、アレルギーなど、さまざまな自己免疫疾患の治療に標的を提供しました。これらの潜在的な阻害剤はいずれも実験的に検証されていませんが、フレームワークはHLA-DR1に結合する6つの配列とPNPに結合する13の配列を予測しました。
表2は、de novoタンパク質設計フレームワークを使用して予測された実験的に検証された阻害剤とアゴニストをまとめたものです。近似結合親和性指標は、9つの配列(ヒトC3c、HIV-1 gp41、EZH2、LSD1、およびLSD2の阻害剤)を予測するために使用され、フォールド特異度指標は、4つの配列(C3aRのアゴニスト/アンタゴニスト)を同定するために使用されました。これらのペプチドは、de novoタンパク質設計フレームワークの成功、特に追加された近似結合親和性指標を浮き彫りにしています。このフレームワークは、その適用性において非常に用途が広いです。25の異なる疾患に関連する6つの異なるタンパク質が成功裏に設計され、実験的に検証されました。
<table border =" 1" cellpadding =" 1" cellspacing =" 1" height =" 147" width =" 856">
	<tbody>
		<tr>
			<td>名前</td>
			<td>IC50</td>
			<td>EC50</td>の
			<td>タンパク質ターゲット</td>
			<td>該当する病気</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ027</td>
			<td>0.94 μM</td>
			<td> </td>
			<td>ヒトC3c</td>
			<td colspan="1" rowspan="7">脳卒中、心臓発作、アルツハイマー病、喘息、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、I型糖尿病、クローン病、膵炎、嚢胞性線維症</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ086</td>
			<td>1.98 μM</td>
			<td> </td>
			<td>ヒトC3c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ059</td>
			<td>4.73 μM</td>
			<td> </td>
			<td>ヒトC3c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ110-4</td>
			<td> </td>
			<td>15.2 nM</td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ060-4</td>
			<td> </td>
			<td>36.4 nM</td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ007-5</td>
			<td>15.4 nM</td>
			<td> </td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ002-5</td>
			<td>26.1 nM</td>
			<td> </td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ435</td>
			<td>29 - 253 μM</td>
			<td> </td>
			<td>HIV-1 GP41</td>
			<td>エイズ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ037</td>
			<td>13.57 μM</td>
			<td> </td>
			<td>EZH2</td>の
			<td colspan="1" rowspan="5">前立腺がん、乳がん、リンパ腫、骨髄腫、膀胱がん、結腸がん、皮膚がん、肝臓がん、子宮内膜がん、肺がん、胃がん</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ011-1</td>
			<td>0.521 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD1</td>の
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ016-1</td>
			<td>0.249 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD1</td>の
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ026-1</td>
			<td>2.51 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD2</td>の
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ015-1</td>
			<td>1.332 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD2</td>の
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 2.さまざまな疾患を標的とする計算予測および実験的に検証されたペプチド。

プロテインwisdom：ベンチ用<em&gt;インシリコで</em&gt;<em&gt;デノボ</em生体分子の&gt;デザイン

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

デノボタンパク質設計の目的は、天然の配列に対して、例えば結合親和性、アゴニストまたはアンタゴニストの動作、又は安定性などの特定の性質、所望の改善を持つ3次元構造に折り畳まになるアミノ酸配列を見つけることである。タンパク質の設計には、現在の進歩の薬物設計と発見の中心に位置しています。だけでなく、タンパク質の設計は潜在的に有用な薬物標的の予測を提供し、それはまた、タンパク質の折り畳みプロセスおよびタンパク質 - タンパク質相互作用の理解を高めるない。このような定方向進化のような実験方法は、タンパク質の設計の成功を示している。しかし、そのような方法はtractably検索できる限られた配列空間によって制限されています。対照的に、計算設計戦略は、特性及び機能の様々な被覆配列の非常に大きなセットのスクリーニングを可能にする。我々は、計算のde novoタンパク質設計メトキシの範囲を開発しているタンパク質設計のいくつかの重要な分野に取り組むことのできるDS。これらには、増大した結合親和性のために増加した安定性との複合体のための単量体のタンパク質の設計が含まれています。 より広範な使用のためのこれらの方法我々現在のタンパク質WISDOM（普及に<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a> ）、タンパク質設計に関するさまざまな問題のために自動化された方法を提供するツールです。構造テンプレートは、設計プロセスを初期化するために提出されます。設計の第一段階は、シーケンス空間にポテンシャルエネルギーの最小化を介して安定性を改善することを目的とする最適化シーケンスを選択する段階である。選択された配列は、その後、折り目特異ステージと結合親和性の段階を介して実行されています。プロセスの各ステップのための配列のランク順序付きリストは、関連する設計された構造に加えて、設計の包括的な定量的評価をユーザに提供します。ここでは詳細をOを提供fは、それぞれ設計方法、並びに方法の使用によって達成いくつかの注目すべき実験成功。

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プロテインWISDOM：ベンチ用<em&gt;インシリコで</em&gt;<em&gt;デノボ</em生体分子の&gt;デザイン

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本実験の全体的な目的は、フォールディング、結合能、または機能的特性を向上させたタンパク質またはペプチドを設計することです。これは、タンパク質または複合体の構造をアップロードし、変異および生物学的制約を定義することで達成されます。第2ステップとして設計目標を定義するために、配列選択の最適化を行い、安定性と相互作用特性が向上した多数の候補タンパク質またはペプチド配列を生成します。次に、フォールド（折り畳み）を行います。設計したタンパク質やペプチドが目的の改善された特性を備えているかを検証するため、設計した配列に対して特異性および／または近似的な結合親和性の算出を行います。本手順を通じて生成された構造の計算解析に基づき、設計した配列の特性が向上していることを示す結果が得られます。本プロトコルは、プリンストン大学のフルート奏者であるChris Doles教授の研究室で開発されました。この汎用的な計算的de novoタンパク質設計プロトコルは、タンパク質設計におけるいくつかの重要な領域に取り組むことが可能です。これには、安定性を向上させた単量体タンパク質の設計や、結合親和性を高めた複合体の設計が含まれます。我々は、H-I-V-G-P 41阻害剤、がん治療薬を標的とするEZH two阻害剤、補体成分C3 Aを標的とする阻害剤など、さまざまな治療領域においていくつかの顕著な設計成功例を得ています。このタンパク質設計手法をより広範な学術コミュニティで利用できるようにするため、我々はProtein Wisdomというウェブインターフェースを開発しました。このインターフェースにより、ユーザーはテンプレートの送信、設計制約の定義、および手法パラメータの指定を完全に制御でき、多種多様な設計問題に対して設計手法を容易に適用することが可能です。テキストプロトコルに従ってprotein wisdomウェブサイトでユーザー登録を行った後、ユーザーログインボタンをクリックして、タンパク質配列とテンプレート構造を送信してください。タンパク質設計実験を開始すると、ユーザーホームページが表示されます。ここには、送信済みのジョブ数、アップロード済みの構造数、およびこれまでにアップロードされた構造の一覧が表示されます。新しい設計ジョブを開始してください。「create new job」をクリックすると、ジョブ送信ページに移動します。ジョブに名前を付け、それが以前のジョブに基づいているかどうかを指定してください。「continue」をクリックします。設計テンプレートのタンパク質構造をアップロードしてください。このテンプレートは、標準的なプロテインデータバンク（PDB）形式である必要があります。すべての原子に1組の座標を持つ剛体テンプレート、またはNMR溶液構造から得られるような複数のモデルを持つ柔軟なテ

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