Name: プロテインWISDOM：ベンチ用インシリコでデノボデザイン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 学ぶProtein WISDOMを用いた計算的手法によるデノボタンパク質設計。構造アップロード、変異制約の定義、配列最適化を通じて、安定性と結合親和性が向上したタンパク質を設計・検証する方法を解説。

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CAFは、NSF、NIH(R01 GM52032;R24 GM069 736)、および米国環境保護庁、EPA(R 832721-010)です。この研究の一部は、国防総省(Air Force Office of Scientific Research)の政府の支援を受けて実現しました。JSはNIH(P50GM071508-06)からの支援に感謝しています。 MLBPは、National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship(32 CFR 168a)からの支援に感謝します。GAKは、米国国立科学財団大学院研究フェローシップ(助成金番号DGE-1148900)からの支援に感謝します。

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

de novoタンパク質設計フレームワークは、配列選択段階と検証段階の2つの段階で構成されています。このフレームワークは、剛性と柔軟性のあるデザインテンプレートを処理するのに十分な堅牢性を備えており、単一のタンパク質デザインまたは複雑なタンパク質デザインに適用できます。このフレームワークは、数十の疾患に応用できる多数のタンパク質システムへの適用に成功しています。多くのデザインが実験的に検証されており、これまでに発見されたいくつかのタンパク質の最も強力な阻害剤またはアゴニストを提供しています。このフレームワークは、Protein WISDOMを介して学術コミュニティに提供されるようになりました。
この方法には 3 つの重要なステップがあります。1つ目は、タンパク質設計にグローバル最適化技術を採用した配列選択段階です。タンパク質設計問題は、非常に複雑な問題です(n個の変異可能な位置に対して20個の可能な配列)。この数は、実験計画法で考慮できる可能なシーケンス数よりも大幅に多くなります。突然変異と生物学的制約をさらに組み込むことで...

De novoタンパク質設計は、改善された特性または機能を持つ望ましい三次構造を生成するタンパク質配列の同定です。タンパク質のネイティブフォールドは自由エネルギー最小値にあるコンフォメーションであるため、de novoタンパク質設計では、ターゲットフォールドに自由エネルギー最小値を持つ配列を探します。この問題は、Drexler1 と Pabo2 によって最初に記述され、"逆折り畳み問題" と呼ばれました。しかし、1つの配列が1つのフォールディング構造解しか得られないタンパク質フォールディング問題とは異なり、de novoタンパク質設計問題では縮退が見られます。多くの異なるアミノ酸配列は、同じ三次構造と機能をもたらすことができます。
タンパク質設計は伝統的に合理的な設計と指向性進化を通じて実験的に行われてきましたが、最近では、実験方法に固有の限られた探索空間を克服するために計算方法が採用されています。決定論的手法、確率論的手法、確率論的手法など、さまざまな計算手法が使用されています。3,4 初期の計算方法では、固定バックボーンテンプレートを使用して、問題を解決しやすくしました。5-7 より高速なプロセッサ、高性能コンピューティング、およびより効率的なアルゴリズムの出現により、バックボーンの柔軟性は、固定バックボーンテンプレートのアンサンブル8-14を使用することによって、または原子間距離と二面角の範囲の観点からテンプレートを表現することによって真のバックボーンの柔軟性を組み込むことによって組み込まれるようになった。15,16
この論文では、Protein WISDOMについて詳細に説明しています。これは、私たちの計算de novoタンパク質設計フレームワークを利用するために学術コミュニティに利用可能になったオンラインツールです。このフレームワークは、HIV、がん、補体疾患、その他の自己免疫疾患などの疾患を標的とした治療用途のために、多数のタンパク質の設計に適用されています。予測されたペプチドの多くが実験的に検証され、この方法の威力が実証されました。表1は、タンパク質またはペプチドのサイズ、予測数、実験検証など、設計されたさまざまなタンパク質の概要を示しています。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>タンパク質設計</td>
			<td>タンパク質の長さ</td>
			<td># 計算予測の数</td>
			<td># の実験的検証</td>
			<td>参考</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ヒトβ-defensin-2の全配列設計</td>
			<td>41</td>名
			<td>340</td>名
			<td> </td>
			<td>(17)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ヒトC3のコンプスタチン阻害剤</td>
			<td>13</td>名
			<td>28</td>名
			<td>3月3日</td>
			<td>(18、19)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ラットC3cに結合するコンプスタチン類似体</td>
			<td>13</td>名
			<td>5</td>
			<td> </td>
			<td>△ 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ジセリン伸長を伴うコンプスタチン類似体</td>
			<td>15</td>名
			<td>8</td>名
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>コンプスタチンアナログW4A9の安定化構造</td>
			<td>13</td>名
			<td>18</td>名
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C3a受容体アゴニストおよびアンタゴニスト</td>
			<td>77</td>名
			<td>20</td>名
			<td>4月7日</td>
			<td>(21)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C5a受容体作動薬およびアンタゴニスト</td>
			<td>74</td>名
			<td>61</td>名
			<td>61年2月</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 gp14阻害剤</td>
			<td>12</td>名
			<td>6</td>
			<td>4月5</td>日
			<td>(22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 gp120阻害剤</td>
			<td>9</td>
			<td>14</td>名
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bcl-x LおよびBcl-2のBak阻害剤</td>
			<td>16-18</td>歳
			<td>10</td>名
			<td>5月5日</td>
			<td>(23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK2の阻害剤</td>
			<td>11</td>名
			<td>25</td>名
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZH2の阻害剤</td>
			<td>21</td>名
			<td>17</td>名
			<td>10月10日</td>
			<td>(24)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSD1およびLSD2の阻害剤</td>
			<td>16</td>名
			<td>41</td>名
			<td>20月17日</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR1の阻害剤</td>
			<td>13</td>名
			<td>6</td>
			<td> </td>
			<td>(25)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNPの阻害剤</td>
			<td>5</td>
			<td>13</td>名
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1.de novoタンパク質設計フレームワークを使用して設計されたタンパク質およびペプチドの要約。計算予測の#は、好ましい予測の数として表されます(つまり、特定のカットオフを超える特異性、またはネイティブシーケンスよりも大きい近似結合親和性)。実験検証の#は2つの数値を示します:1つ目は実験的に検証された予測の数、2つ目は実験的にテストされた予測の総数です。
ペプチドの抗菌特性を高めるために、ヒト-β-ディフェンシン-2(hβD-2)の設計を行いました。17 このデザインでは、1)hβD-2に沿った最大10の変異、および2)システインを除くすべてのhβD-2残基位置のフルシーケンスデザイン(8、15、20、30、37、および38)の2つのケースを考慮しました。このデザインでは、3つの異なるデザインテンプレートと3つの異なるシーケンス選択モデルが使用されました。10個の突然変異デザインと全配列デザインの両方について、加重平均モデルと距離ビンモデルの間で、突然変異の類似性が高いレベルが観察されました。さらに、多数の配列が、ネイティブ配列よりも有利に計算されたフォールド特異性値を持つことがわかりました。
補体系阻害剤(C3、C3a、C5a)は、脳卒中、心臓発作、アルツハイマー病、喘息、関節リウマチ、異種移植の拒絶反応、成人呼吸器疾患、乾癬、クローン病などの多くの免疫疾患と戦うために設計されました。タンパク質設計フレームワークによって予測されたC3cの3つのコンプスタチン阻害剤と合理的に設計された3つの配列が、天然のコンプスタチンよりも優れた結合剤であることが実験的に検証されました。18,19
さらなる研究では、非霊長類のC3cに対するコンプスタチンの活性の喪失を調べ、ラットとマウスのC3c阻害剤の候補をいくつか設計しました。5つの配列は、C3cを阻害することが知られているW4A9コンプスタチン変異体よりもラットC3cとの良好な関連自由エネルギーを持っていることが示されました。これは、Arg1による新たな塩橋形成によるものです。20 N末端伸長を有する8つの配列は、ジセリン伸長を有するW4A9よりも優れた結合剤であると予測された。最後に、18のコンプスタチン配列がW4A9の結合したコンフォメーションを安定化すると予測され、霊長類および非霊長類のC3c阻害剤の強力な候補を提供しました。
C3c阻害剤に加えて、C3aおよびC5a受容体アゴニストおよびアンタゴニストは、C3aおよびC5aの構造に基づいて設計されました。モデルによって予測された7つのC3a配列を実験的にテストしました。配列のうち2つは強力なアゴニストであり、他の2つは部分的なアゴニストでした。21 2つの強力なアゴニストは、以前に発見された「スーパーアゴニスト」よりも58倍の改善を示しました。C5a受容体アゴニストおよびアンタゴニストの設計により、61の配列のセットが提供されました。すべての配列が合成され、2つが新規のC5aアゴニストであることがわかりました。
HIV-1の融合阻害剤は、HIV-1が細胞に感染するのを防ぐために設計されました。最初の設計は、HIV-1のエンベロープ糖タンパク質であるgp41を対象としていました。タンパク質設計フレームワークは、ネイティブ配列よりも優れた結合剤である6つの配列を予測しました。これらの予測配列のうち4つは、HIV-1を阻害することが実験的に検証され、最良の配列はIC50が29μMと低かった。この配列は、天然配列よりも3〜15倍の改善を示し、エンフビルチド耐性ウイルス株に対する活性の損失はありませんでした。22 2番目のデザインは、HIV-1の別のエンベロープ糖タンパク質であるgp120を対象としていました。14の配列はgp120の結合剤であり、HIV-1の追加の潜在的な融合阻害剤を提供すると予測されました。
がんに関連する多数のタンパク質が、がん治療の有望な標的を提供しました。Bcl-2およびBcl-xLは、細胞死を防ぐ抗アポトーシスタンパク質です。これら2つのタンパク質の阻害剤は、がん細胞の細胞死を誘導するように設計されました。10の配列がネイティブよりも優れた結合剤であると予測され、これらの結果は以前の実験結果と突然変異誘発結果を捉えました。23 別の標的タンパク質であるERK2は、シグナル伝達カスケードに関与しており、抗増殖性がん治療の有望な標的となっています。25の配列がERK2の阻害剤であると予測されました。
ヒストンメチルトランスフェラーゼと脱メチル化酵素は、前立腺、乳がん、リンパ腫、骨髄腫、膀胱、結腸、皮膚、肝臓、子宮内膜、肺、胃など、多くのがん種に関連するヒストンメチル化を動的に制御します。de novoタンパク質設計フレームワークにより、EZH2(リジンメチルトランスフェラーゼ)の17の阻害剤が特定され、実験的にテストされた10のすべてがEZH2を阻害することがわかりました。24 最も強力なペプチドは、約13μMのIC50を有し、酵素濃度の上昇に対しても同等に効果的であり、補因子と競合しませんでした。これらのペプチドは、EZH2の阻害剤の最初のセットでした。フレームワークにより、LSD1(デメチラーゼ)の阻害剤53が予測され、実験的に試験された20の阻害剤のうち、17がLSD1の阻害剤、18がLSD2の阻害剤であった。最も優れた阻害剤は、IC50の値が1 μM未満であったため、これまでに発見されたペプチド阻害剤の中で最も強力です。
最後の2つのタンパク質システムは、セリアック病、1型糖尿病、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、チャーグ・シュトラウス症候群、橋本甲状腺炎、バセドウ病、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、アレルギーなど、さまざまな自己免疫疾患の治療に標的を提供しました。これらの潜在的な阻害剤はいずれも実験的に検証されていませんが、フレームワークはHLA-DR1に結合する6つの配列とPNPに結合する13の配列を予測しました。
表2は、de novoタンパク質設計フレームワークを使用して予測された実験的に検証された阻害剤とアゴニストをまとめたものです。近似結合親和性指標は、9つの配列(ヒトC3c、HIV-1 gp41、EZH2、LSD1、およびLSD2の阻害剤)を予測するために使用され、フォールド特異度指標は、4つの配列(C3aRのアゴニスト/アンタゴニスト)を同定するために使用されました。これらのペプチドは、de novoタンパク質設計フレームワークの成功、特に追加された近似結合親和性指標を浮き彫りにしています。このフレームワークは、その適用性において非常に用途が広いです。25の異なる疾患に関連する6つの異なるタンパク質が成功裏に設計され、実験的に検証されました。
<table border =" 1" cellpadding =" 1" cellspacing =" 1" height =" 147" width =" 856">
	<tbody>
		<tr>
			<td>名前</td>
			<td>IC50</td>
			<td>EC50</td>の
			<td>タンパク質ターゲット</td>
			<td>該当する病気</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ027</td>
			<td>0.94 μM</td>
			<td> </td>
			<td>ヒトC3c</td>
			<td colspan="1" rowspan="7">脳卒中、心臓発作、アルツハイマー病、喘息、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、I型糖尿病、クローン病、膵炎、嚢胞性線維症</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ086</td>
			<td>1.98 μM</td>
			<td> </td>
			<td>ヒトC3c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ059</td>
			<td>4.73 μM</td>
			<td> </td>
			<td>ヒトC3c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ110-4</td>
			<td> </td>
			<td>15.2 nM</td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ060-4</td>
			<td> </td>
			<td>36.4 nM</td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ007-5</td>
			<td>15.4 nM</td>
			<td> </td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ002-5</td>
			<td>26.1 nM</td>
			<td> </td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ435</td>
			<td>29 - 253 μM</td>
			<td> </td>
			<td>HIV-1 GP41</td>
			<td>エイズ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ037</td>
			<td>13.57 μM</td>
			<td> </td>
			<td>EZH2</td>の
			<td colspan="1" rowspan="5">前立腺がん、乳がん、リンパ腫、骨髄腫、膀胱がん、結腸がん、皮膚がん、肝臓がん、子宮内膜がん、肺がん、胃がん</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ011-1</td>
			<td>0.521 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD1</td>の
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ016-1</td>
			<td>0.249 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD1</td>の
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ026-1</td>
			<td>2.51 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD2</td>の
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ015-1</td>
			<td>1.332 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD2</td>の
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 2.さまざまな疾患を標的とする計算予測および実験的に検証されたペプチド。

プロテインwisdom：ベンチ用<em&gt;インシリコで</em&gt;<em&gt;デノボ</em生体分子の&gt;デザイン

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

デノボタンパク質設計の目的は、天然の配列に対して、例えば結合親和性、アゴニストまたはアンタゴニストの動作、又は安定性などの特定の性質、所望の改善を持つ3次元構造に折り畳まになるアミノ酸配列を見つけることである。タンパク質の設計には、現在の進歩の薬物設計と発見の中心に位置しています。だけでなく、タンパク質の設計は潜在的に有用な薬物標的の予測を提供し、それはまた、タンパク質の折り畳みプロセスおよびタンパク質 - タンパク質相互作用の理解を高めるない。このような定方向進化のような実験方法は、タンパク質の設計の成功を示している。しかし、そのような方法はtractably検索できる限られた配列空間によって制限されています。対照的に、計算設計戦略は、特性及び機能の様々な被覆配列の非常に大きなセットのスクリーニングを可能にする。我々は、計算のde novoタンパク質設計メトキシの範囲を開発しているタンパク質設計のいくつかの重要な分野に取り組むことのできるDS。これらには、増大した結合親和性のために増加した安定性との複合体のための単量体のタンパク質の設計が含まれています。 より広範な使用のためのこれらの方法我々現在のタンパク質WISDOM（普及に<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a> ）、タンパク質設計に関するさまざまな問題のために自動化された方法を提供するツールです。構造テンプレートは、設計プロセスを初期化するために提出されます。設計の第一段階は、シーケンス空間にポテンシャルエネルギーの最小化を介して安定性を改善することを目的とする最適化シーケンスを選択する段階である。選択された配列は、その後、折り目特異ステージと結合親和性の段階を介して実行されています。プロセスの各ステップのための配列のランク順序付きリストは、関連する設計された構造に加えて、設計の包括的な定量的評価をユーザに提供します。ここでは詳細をOを提供fは、それぞれ設計方法、並びに方法の使用によって達成いくつかの注目すべき実験成功。

De Novo 設計によるHIV-1進入阻害剤の作製
Protein WISDOMに実装されたde novo設計フレームワークは、いくつかの重要な治療システムの阻害ペプチド設計に使用されてきました（表1および2）。特筆すべきシステムの一つに、宿主細胞受容体CD4へのHIV-1侵入を阻害するペプチドの設計があり、ここではProtein WISDOMインターフェースの実用的な使用を実証するための代表的なシステムとして用います。これらのペプチドは、宿主Tヘルパー細胞へのHIV-1の融合および侵入において重要な役割を果たす膜貫通サブユニットgp41を標的とするよう設計されました。なお、結果は必ずしも元の論文に提示されたものと同一になるとは限りません。これは、本手法のこの部分で使用されるRosetta法の確率論的な性質と、元の論文発表以降にRosetta2.3からRosetta3.4へアップデートされたことによるものです。
ジョブを開始するには、ユーザーが有効なタンパク質設...

私たちは、タンパク質設計のいくつかの重要な領域に取り組むことができる計算de novoタンパク質設計法を開発しました。これらの手法を普及させるために、タンパク質設計のためのオンラインツールであるProtein WISDOMを紹介します(<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>)。構造テンプレートから始めて、安定性を高めるための単量体タンパク質の設計と、結合親和性を高めるための複合体の設計を行うことができます。

プロテインWISDOM：ベンチ用<em&gt;インシリコで</em&gt;<em&gt;デノボ</em生体分子の&gt;デザイン

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

本実験の全体的な目的は、フォールディング、結合能、または機能的特性を向上させたタンパク質またはペプチドを設計することです。これは、タンパク質または複合体の構造をアップロードし、変異および生物学的制約を定義することで達成されます。第2ステップとして設計目標を定義するために、配列選択の最適化を行い、安定性と相互作用特性が向上した多数の候補タンパク質またはペプチド配列を生成します。次に、フォールド（折り畳み）を行います。設計したタンパク質やペプチドが目的の改善された特性を備えているかを検証するため、設計した配列に対して特異性および／または近似的な結合親和性の算出を行います。本手順を通じて生成された構造の計算解析に基づき、設計した配列の特性が向上していることを示す結果が得られます。本プロトコルは、プリンストン大学のフルート奏者であるChris Doles教授の研究室で開発されました。この汎用的な計算的de novoタンパク質設計プロトコルは、タンパク質設計におけるいくつかの重要な領域に取り組むことが可能です。これには、安定性を向上させた単量体タンパク質の設計や、結合親和性を高めた複合体の設計が含まれます。我々は、H-I-V-G-P 41阻害剤、がん治療薬を標的とするEZH two阻害剤、補体成分C3 Aを標的とする阻害剤など、さまざまな治療領域においていくつかの顕著な設計成功例を得ています。このタンパク質設計手法をより広範な学術コミュニティで利用できるようにするため、我々はProtein Wisdomというウェブインターフェースを開発しました。このインターフェースにより、ユーザーはテンプレートの送信、設計制約の定義、および手法パラメータの指定を完全に制御でき、多種多様な設計問題に対して設計手法を容易に適用することが可能です。テキストプロトコルに従ってprotein wisdomウェブサイトでユーザー登録を行った後、ユーザーログインボタンをクリックして、タンパク質配列とテンプレート構造を送信してください。タンパク質設計実験を開始すると、ユーザーホームページが表示されます。ここには、送信済みのジョブ数、アップロード済みの構造数、およびこれまでにアップロードされた構造の一覧が表示されます。新しい設計ジョブを開始してください。「create new job」をクリックすると、ジョブ送信ページに移動します。ジョブに名前を付け、それが以前のジョブに基づいているかどうかを指定してください。「continue」をクリックします。設計テンプレートのタンパク質構造をアップロードしてください。このテンプレートは、標準的なプロテインデータバンク（PDB）形式である必要があります。すべての原子に1組の座標を持つ剛体テンプレート、またはNMR溶液構造から得られるような複数のモデルを持つ柔軟なテンプレートのいずれでも可能です。単一タンパク質を設計する場合、チェーンは1つのみとなります。テンプレートでは、新しいテンプレートをアップロードするか、以前にアップロードした既存のテンプレートから選択できます。複数のテンプレートをアップロードする場合は、各モデルがmodel numberで始まり、end modelで終わっていることを確認してください。すべての残基が天然アミノ酸で指定されていることを確認してください。「continue」をクリックします。テンプレートのアップロードと確認が正常に完了すると、メインコントロールページに移動します。このページでは、ジョブのステータスを確認し、変異セットと生物学的制約を変更して、ステージ1の配列選択ジョブを送信できます。現時点では、ステージ1が完了していないため、ステージ2のオプションは表示されません。これらはステージ1の結果が利用可能になると表示されます。次に、メインコントロールページのmutation sets（変異セット）リンクをクリックして変異セットを定義し、どの残基に変異を許可するか、およびそれらがどのアミノ酸に変異することを許可するかを選択します。デフォルトでは、各ポジションで許容されるアミノ酸は、溶媒接触表面積（SSA）変異セットに基づいて選択されます。変異セットを選択した後、save changes（変更を保存）をクリックしてください。解決すべき最適化の計算複雑性に注意してください。許容される計算複雑性の上限は20の25乗です。次に、メインコントロールページの「biological constraints」リンクをクリックして生物学的制約を定義し、タンパク質全体またはタンパク質の限定的な領域における電荷またはアミノ酸含有量の制約を指定します。必要に応じて許容される変異の総数であり、生物学的制約は任意です。完了後、メインコントロールページに戻ってください。「ステージ1を開始」リンクをクリックすると、ユーザーはステージ1の送信ページに移動します。距離依存性力場およびモデル計算を生成するための配列数を設計するために、チェーンを選択します。これらの選択に関する詳細は、テキストプロトコルで確認できます。ジョブを送信すると、ユーザーはメインコントロールページに戻ります。ジョブのステータスは、現在の進捗状況を示すように更新されます。ジョブは送信後、編集不可（ロック状態）となります。ジョブが完了すると、設計された配列のリストを含む結果がユーザーにメールで送信されます。結果はメインコントロールページでも確認できます。ページ上に「stage two fold specificity」のボックスが表示され、ユーザーはこの検証を実行できます。「begin stage two fold specificity」をクリックしてください。build stage twoページに入るには、テンプレートの柔軟性係数を、距離のパーセンテージまたは固定距離として指定することで、上端および下端のalpha carbon、alpha carbon距離の境界を定義します。次に、PHIおよびサイドダイヘドラル角の上限値と下限値を定義します。テンプレートの柔軟性係数をパーセンテージで指定し、送信ボタンをクリックして、1配列あたりに生成する構造数を指定して「Continue」をクリックしてください。なお、1配列あたりに生成できる構造数の上限は500個であることに注意してください。次に、「continue」をクリックして、フォールド検証への送信を確定します。ステージ1とステージ2は、ステージ2が完了するまで編集不可となります。ジョブが完了すると、結果を記載したメールがユーザーに送信されます。また、結果はメインコントロールページでも確認可能です。ここでは、設計された配列、ステージ1の対応するエネルギー値、およびステージ2のフォールド特異性値を含むテキストファイルを確認およびダウンロードできます。さらに、「結果を表示（view results）」リンクをクリックすると、ステージ1のランクとエネルギー値、およびステージ2のランクとフォールド特異性値を示す表がブラウザに表示されます。設計されたリガンドタンパク質またはペプチドと、複合体の残りの部分との親和性を決定するために、近似結合親和性計算が用いられています。これらの計算は、ステージ1の直後、またはフォールド特異性の計算が完了した後に実行できます。まず、配列番号をクリックして配列を選択してください。近似結合親和性の計算を開始すると、設計配列のリストと、それぞれの配列選択およびフォールド特異性のランクが表示される配列選択ページに誘導されます。配列を選択して保存すると、ユーザーはメインコントロールページにリダイレクトされます。次に、[Begin stage two, approximate binding affinity]をクリックしてジョブを送信します。完了後、配列番号、近似結合親和性、および分配関数の値を含む添付ファイルがユーザーにメールで送信されます。以降の近似結合親和性ジョブにおいて、このファイルには完了したすべての配列の結果が含まれます。また、表示されているジョブのメインコントロールページにアクセスすることで、完全な結果を確認することも可能です。ここでは、HIV-1の進入阻害剤のデザインテンプレートである、GP41コアと複合体を形成したC14リンクmidの14残基架橋ペプチドの結晶構造を示します。このテンプレートペプチドは強力な阻害剤として知られており、架橋剤を除去した状態で提出されています。設計入力が定義され、システムがステージ1の配列選択に提出された後、ソートされた配列選択の結果は、メインジョブページの「結果を表示（view results）」リンクからアクセスできます。このリンクからは、特定のシステムに対して算出されたすべての結果の読みやすいサマリーを確認でき、いずれのステージ結果によってもソートが可能です。迅速な解析を行うために、配列結果（sequence results）リンクを通じて結果を可視化することも可能です。ここでは、選択された配列のサマリーが3文字のアミノ酸コードで表示されます。結果にアクセスする3つ目のオプションはエネルギー結果（energy results）リンクであり、ここでは選択された配列を用いた最適化モデルの実行サマリー、それぞれのエネルギー、および解を導き出すためにモデルの計算に要した時間が表示されます。ステージ1の配列選択および、ステージ2のフォールド特異性と近似結合親和性法の申請が完了した後、サマリービュー結果セクションで結果にアクセスし、ソートすることができます。あるいは、「fold Specificity Results」セクションで個別に確認することも可能です。このセクションでは、配列番号とfold specificity値が配列として提供されます。サンプルの近似結合親和性計算の結果は、ソート可能なリストとして提示されます。「view results」セクションでは、近似結合親和性計算が実行されたすべての配列の「view」列にハイライトされたリンクが表示されます。この「view」リンクをクリックすると、ユーザーは設計情報ページに移動します。このページでは、使用されたすべての複合体およびペプチド構造のダウンロード可能なzipファイルを提供しています。複合体構造とペプチド構造の両方における最終的な構造設計ステップでは、エネルギーが低い順に上位10個の構造がランキング形式のリストで提供されます。各構造にはビューリンクがあり、ユーザーはインタラクティブなJM O環境で構造を確認することができます。ユーザーが各構造を個別にダウンロードできるよう、ダウンロードリンクも提供されています。結果の詳細については、「近似結合親和性結果」のセクションに記載されています。このセクションでは、ペプチド、タンパク質、および複合体の分配関数の値と、最終的な近似結合親和性の値が示されています。protein wisdomを使用する際は、設計制約の選択が全体的な設計結果に大きな影響を与える可能性があることを念頭に置くことが重要です。設計制約は、最適化アルゴリズムが探索すべき配列空間の量を制限することで全体の探索速度を向上させるだけでなく、実験情報から導き出された最適化制約を利用することで、生物学的に妥当なタンパク質設計を得ることにつながります。ウェブインターフェースであるprotein wisdomを通じてこれらの設計手法が利用可能になることで、設計手法のより幅広い活用につながることを期待しています。私たちは設計手法の機能拡張と開発を継続しており、近い将来、このフレームワークを多量体システム、タンパク質-DNA相互作用、および翻訳後修飾や非天然アミノ酸を用いた設計にまで一般化することを目指しています。拡張が行われるたびに、Protein Wisdomを通じてこれらの手法が提供されることで、学術コミュニティによる容易かつ効率的な適用が可能になります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

コンセンサスモチーフに基づく合成タンパク質配列は、通常、相互作用依存性(IPD)を示唆する共進化残基を無視します。 IPDはアクティビティに不可欠であり、IPDを無視する設計は最適でない結果をもたらす可能性があります。...

合成タンパク質の最適化：中間物挿入依存関係の同定構造的インジケートおよび/または機能的に連結された残基

X線結晶学によるNEMOのIKK結合ドメインの構造決定のためのプロトコルについて説明する。この方法には、タンパク質発現、精製および特性評価、ならびに結晶最適化を成功させるための戦略および非結合形態のタンパク質の構造決定が含まれる。...

NEMOのIKK結合ドメインの生産・結晶化・構造決定

クライオ電子顕微鏡における単粒子分析は、高分解能での生体アンサンブルの構造を決定するために使用される主な技術の1つです。Scipionは、顕微鏡で取得した情報を処理し、生物学的標本の3D再構成を達成するためのパイプライン全体を作成するためのツールを提供します。...

クリオEMとシピオンによる単粒子分析

生体分子モデリングの重要なスキルは、タンパク質中の活性部位の表示とコメント付けです。この技術は、高分子視覚化のための4つの一般的なフリープログラムを使用して実証されています: iCn3D, Jmol, PyMOL, および UCSF ChimeraX.

分子可視化フリーウェアを用いた酵素活性部位のモデリング

このプロトコルは、実験計画構成における主観的な選択を最小限に抑える、混合、連続、およびカテゴリカル研究要因に対する定式化最適化へのアプローチを提供します。解析フェーズでは、効果的で使いやすいモデリングフィッティング手順が採用されます。...

設計された混合プロセス実験と自己検証アンサンブルモデル(SVEM)を使用した脂質ナノ粒子(LNP)製剤最適化のワークフロー

このプロトコールでは、高分子のクライオ電子顕微鏡マップで低分子リガンドをモデル化するために利用可能なツールを紹介します。...

クライオ電子顕微鏡法から得られたマップへの配位子のモデリング

タンパク質設計には、アミノ酸配列の構築と、機能的なバリアントを作成するための特定のモチーフの組み込みが含まれます。このアプローチは、抗生物質耐性病原体と戦うための抗菌ペプチド(AMP)の開発に不可欠です。この論文では、さまざまなバイオインフォマティクスツールを使用したタンパク質構築の手順を示します。...

I TASSER、trRosetta、UCSF Chimera、HADDOCKサーバー、HEX loriaの De Novo および In Silico Design of Proteinsへの応用

このプロトコルは、自動化支援による遺伝子ライブラリの生成と評価を通じて、遺伝的にコードされたバイオセンサーの体系的なグローバル最適化のための方法を提供します。これは、実験を合理化し、特定の設計結果に合わせてバイオセンサーを調整するための遺伝的成分の選択を可能にする実験計画法と組み合わされます。...

実験計画法と自動化ワークフローで実現された遺伝子コード化されたバイオセンサー設計空間の効率的なサンプリング

我々は、金の微小電極とシリコン基板上にポリ（エチレングリコール）自己組織化単分子膜を（PEG - SAM）を形成するための手順を示します。 PEG -...

パターニングの生体分子の微小電極上に自己組織膜を汚

付属のビデオでは、分子量に基づいてGELFREE...

液相の回復と分子量ベース画用GELFREE 8100分別システムの使用

学ぶProtein WISDOMを用いた計算的手法によるデノボタンパク質設計。構造アップロード、変異制約の定義、配列最適化を通じて、安定性と結合親和性が向上したタンパク質を設計・検証する方法を解説。

プロテインWISDOM：ベンチ用

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