非侵襲ハイパーサーミアがん治療のための金ナノ粒子と生体系とラジオ波の相互作用を評価するためのプロトコル

この手順の全体的な目標は、in vitroおよびin vivoで、13.56メガヘルツの無線周波数電界における金ナノ粒子の加熱特性を評価することです。これは、まず、クォーツ獣根で濃縮された金ナノ粒子とそのバッファーの昇温速度を評価することによって達成されます。手順の2番目のステップは、培養がん細胞を用いた金ナノ粒子のin vitro毒性試験を実施することです。

第3のステップは、異所性マウスがんモデルにおける金ナノ粒子のin vivo研究を行うことです。最終的に、結果は、懸濁液中、in vitro、およびin vivo中のナノ粒子の分析を通じて、調査されたナノ粒子がRF媒介温療法で使用する効果的な薬剤であるかどうかを示すことができます。この方法は、ナノ粒子を介した非侵襲的無線周波低体温症の分野における重要な疑問、例えば、粒子自体による加熱や治療目的への使用など、重要な疑問に答えるのに役立ちます。

一般的に、このタイプの実験を実施するための確立されたプロトコルがあまりないため、この方法に不慣れな人は苦労するでしょう。この手順を実演するのは、研究助手のシスネロス、ポスドク科学者のスチュアート・コア、もう一人のポスドク科学者のレイラ・グリーンです。例として、直径5ナノメートルの金ナノ粒子の市販の500ミリリットルボトルから始めます。

ストック金ナノ粒子溶液の約125ミリリットルを取り、それを6本の50キロダルトン遠心分離フィルターチューブに分割し、ナノ粒子を3000RPMで2分5秒間遠心分離します。フィルターにかけられたバッファーである上清を取り除き、各フィルターを補充します。より多くのストックソリューションで。

遠心分離を続け、バッファーを取り外し、チューブを再装填して、すべてのナノ粒子溶液をろ過します。最後の添加後、ろ過されたバッファーを同量の脱イオン水と交換し、ろ過されたバッファーサンプルをRFマシンにロードした後、このプロセスをさらに約8回繰り返します。赤外線カメラソフトウェアを使用して、QVE上にボックスを作成し、加熱プロファイルをキャプチャ 8回の洗浄後、5ナノメートルの金ナノ粒子濾液の加熱データは脱イオン水の加熱データに近づいています。

UV/VIS分析は、汚染物質の吸収を監視するためにも使用できます。ピーク。ここに示されているのは、クリーンなスペクトルです。バッファーの汚染物質が完全に除去されたら、フィルターチューブ内の0.5ミリリットルの脱イオン水にナノ粒子を懸濁させ、フィルターからナノ粒子を除去します。

次に、6つのサスペンションすべてを1つの15ミリリットルチューブに組み合わせます。次に、安定性データを得るために、UVVISとゼータ電位を使用してサンプルを分析します。I-C-P-O-E-Sおよび/またはICP質量分析を使用して、ナノ粒子濃度を測定します。

SEMおよび/またはTEMの分析はまたKansas RFシステムまたは負荷の導出、1.3ミリリットルのシリンジの石英veteを使用して形態学的なデータを得るために使用し、RF電界をQのveteが常駐する空気中のメートルあたり約90キロボルトに設定するために使用することができる。0.9%塩化ナトリウムを含む標準的な生理食塩水サンプルの場合、電界は1メートルあたり約1.1キロボルトに減少します。これらは、異なるRFシステム間で比較を行うために使用されるおおよその条件です。

次に、きれいな石英獣医に1.3ミリリットルの精製金ナノ粒子懸濁液を1リットルあたり1000ミリグラムの濃度でロードします。サンプルをRFフィールドに120秒間、またはサンプルが摂氏70度に達するまでさらします。過度の露出は、電気アーク放電や急速な沸騰につながる可能性があります。

赤外線カメラと関連ソフトウェアを使用して、赤外線画像データと制御領域をキャプチャします。同じサンプルでこの手順を3回繰り返します。次に、別の50キロダルトンの遠心分離フィルターでサンプルをろ過し、水バッファーから金ナノ粒子を抽出します。

次に、バッファのみをRFフィールドに再度露光します。ここでも、金ナノ粒子コロイドと濾液との間のhrsの3倍の差が、金ナノ粒子自体によるHRを決定する。最後に、フィルターから残った金ナノ粒子を1.3ミリリットルの水に懸濁させて、さらなる実験を行います。

これらのin vitro研究は、2D単分子膜を形成するあらゆるタイプのがん細胞に適用できます。この例では、ヒト肝細胞癌由来のHep 3 B細胞を約50,000個の細胞にプレートして使用する。1ミリリットルの成長を伴う12ウェルプレートの3つのウェル。

培地は、ナノ粒子研究のために3つのプレートが充填され、コントロールとして3つのプレートが充填されるまで、細胞をロードし続けます。プレートを摂氏37.5度で24時間インキュベートします。翌日、1リットルあたり1000ミリグラムの金ナノ粒子溶液の0.1ミリリットルを、3つのナノ粒子プレートの各ウェルにコントロールプレートに導入します。

それぞれに0.1ミリリットルの水を入れ、すべてのプレートをさらに24時間よくインキュベートします。さらに24時間後、細胞培地を吸引し、細胞をPBSで洗浄して、表面に結合した金ナノ粒子を除去します。その後、セル培地を交換します。

これで、セルはRF曝露の準備が整いました。各12ウェルセルパックをRFフィールド内に置き、セルが摂氏31度に冷却されるまで待ちます。わずかに冷却したら、細胞を3.5分間のrfにさらします。

細胞培地の最終温度は約37°Cになります。細胞をインキュベーターに移し、24時間待ってから分析します。細胞の準備ができたら、培地を吸引し、培地中の2ミリリットルの25%MTT試薬と交換します。

その後、細胞をさらに4時間インキュベートします。次に、MTTメディアを2ミリリットルのDMSOと交換します。セルプレートをベンチロッカーに10分間置き、DMSOがMTT試薬を可溶化させます。

最後に、各ウェルから100マイクロリットルのサンプルを96ウェルプレートにピペットで移し、570ナノメートルでプレートを光学的に読み取ります。これらのin vivo研究は、同所性または異所性ミラーリングモデルで固形腫瘍を形成するあらゆるタイプのがんに適用できます。この例では、Hep three B肝がん細胞をBPCヌードマウスとともに使用する。

約100、000細胞トリプシンから始めて、細胞を氷で冷やし、25マイクロリットルあたり200万個の細胞の溶液を生成します。細胞懸濁液に等量の氷冷マトリゲルを加え、ピペットで繰り返し吸引して完全に混合します。次に、混合懸濁液を各動物の背中の所望の位置に注入します。

数週間後、この時点で腫瘍は半から1センチメートルの丸みを帯び、RF治療を開始し、IP注射でケタミンとキシラジンの溶液でマウスを麻酔し、マウスを暖かく保ちます。次に、27ゲージまたは30ゲージの針が付いた1ccの注射器を使用して、金ナノ粒子を腫瘍の半分に直接注入します。外科用スワブを使用して血液を吸収し、アルコールワイプで注射部位を拭きます。

対照として、腫瘍の残りの半分にPBSのみを注入します。次に、各グループの半分のマウスを扱います。マウスをRFジェネレーターの受信ヘッドに取り付け、目、耳、つま先などの未処理の領域を銅テープでシールドします。

この実験で最も重要な部分は、マウスを適切に接地することです。適切な接地を行わないと、動物に電荷が蓄積すると、皮膚熱傷害または皮膚電気損傷を引き起こす可能性があります。これは簡単に防ぐことができます。

腫瘍を透過頭部から離して、目的の治療部位の幅より少なくとも1センチメートル大きく配置します。次に、腫瘍と治療領域が見えるようにIRサーマルカメラを配置します。RFを5分間オンにし、結果の温度曲線を記録します。

皮膚表面温度が摂氏42度以上に上昇した場合は、RF曝露後すぐに治療を中止してください。マウスが意識を持つまで、暖かい部屋で回復させます。治療を週に2回、3週間繰り返します。

次に、最終的なRF曝露の48時間後にマウスを安楽死させ、腫瘍を処理します。精製された金ナノ粒子のRF加熱は、それらとバックグラウンドの脱イオン水緩衝液との間の時間差によって決定されました。結果は、5ナノメートルと10ナノメートルの両方のナノ粒子で予想通りの結果でした。

ヒト肝細胞がんに組み込まれた精製された金ナノ粒子は、Hep three B細胞を誘導しました。このような細胞がRFフィールドにさらされると、通常、内部化されたナノ粒子なしでRFにさらされた細胞よりも生存率が低下します。図3は、使用される金ナノ粒子自体の毒性は限定的であるが、優れたRF開始細胞毒性特性が文献を参照して、さまざまな種類のナノ材料を使用したこれまでのin vitro結果を包括的にレビューするという理想的なシナリオを示しています。

Hep three B.Liverがん細胞を使用して、バブシヌードマウスの背中に腫瘍を作製しました。これらの腫瘍にPBS懸濁金ナノ粒子を注入し、続いてRF曝露を行いました。トーマス解析後の治療により、治療が腫瘍の成長を制御し、腫瘍量の減少が明らかになりました。

このビデオを見れば、ナノ粒子のRF応答特性とin vitroおよびin vivoでの溶液を決定することにより、RF媒介性低体温症で使用するナノ粒子を評価する方法について十分に理解できるはずです。高出力RF電界での作業は非常に危険であることを忘れないでください。活性電界内で触れたり、手を伸ばしたりしないでください。

電界を測定し、必要に応じてファラデーケージのような適切なシールドを使用してください。一般に、持続的な高強度電界への曝露は常に最小限に抑えてください。