Name: 非侵襲ハイパーサーミアがん治療のための金ナノ粒子と生体系とラジオ波の相互作用を評価するためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-28T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学ぶ金ナノ粒子の13.56MHzラジオ波電場における加熱特性評価法。in vitroおよびin vivoの試験を通じて、非侵襲ハイパーサーミアがん治療への応用可能性を検証するプロトコルです。

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この作品は、NIH（U54CA143837）、NIH、MDアンダーソンがんセンターサポート助成金（CA016672）、V財団（SAC）、およびKanzius研究財団（SAC、エリー、ペンシルバニア州）からの無制限の研究助成金によって賄われていた。私たちは、行政の支援のために、外科腫瘍科、MDアンダーソンがんセンターのクリスティーン·アッシュに感謝します。

完全な実験の概要を図1に示されている。 さらなる詳細は、以下の手順1〜3に示されている。 1。 NPコロイドの高周波加熱を評価する：例としてAuNPs <ol><li>一般に、各NPサンプルが調査され、第一のバックグラウンドイオン及び汚染物を除去するために脱イオン（DI）水を用いて遠心分離フィルターを通して試料を数回洗浄する。すべてのイオンおよび汚染物質が洗い流されている液体が、DI水と同様の高周波加熱速度（時間）がAuNP懸濁液から削除されています。この精製プロセスはまた、得られるNPのより高い濃度を可能にする。なお、この例ではAuNPsを用いているが、基本的な原理は 、他のNPの材料に適用することができることは注目に値する。 </li><li>一例として、直径5nmの市販のAuNPsの500ミリリットル瓶を浄化した後、電気-Fiは13.56MHzのRFフィールドにそれらをさらすELD強度90 kVの/ M。 <ol><li> 〜6 50kDaの遠心フィルターチューブの間に株式AuNPソリューションとスプリットから125ミリリットルを取る。 3,000 rpmで遠心分離する。 2分5秒。より多くの保存溶液で濾過液リフィルフィルタを削除。すべての500ミリリットルがフィルタリングされるまで繰り返します。 </li><li> DI水の同じような量で濾過液を交換し、約8倍（またはフィルタリングされたバッファのRF時間DI水と同等になるまで）を繰り返します。ノート、UV-Visの分析はまた、汚染物質の吸収ピークを監視するために使用することができる。バッファ汚染物質が各フィルタに、ピペットを約0.5ミリリットルのDI水を完全に除去され、繰り返しピペッティングによりAuNPsを再懸濁したら。これは完全にフィルタからAuNPsを削除し、完全な再懸濁を可能にすべきである。 1 15ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブにすべての6懸濁液を兼ね備えています。 </li><li> AuNPsを精製し、濃縮された後、ICP-OES、および/またはICP-MS、UV-VISとconcentratio上のデータのためのゼータ電位を使用してサンプルを分析するnおよびNP安定性であった。 SEMおよび/またはTEM分析は、形態学的データを得るために使用することができる。これらの技術についての詳細なサンプル調製は、文献4に見出すことができる。 </li></ol></li><li> Kanzius高周波これまでの研究8に記載されているシステム、またはこのシステムの導出、（無サンプルプレゼントに）空気中のRF電界がなるように1.3ミリリットルの円筒状の石英キュベットを置く〜キュベット内部の90 kVの/ Mを用い。標準生理食塩水試料（0.9％NaCl）をするための電界は、〜1.1 kVの/ mまで減少するであろう。これらの比較は、異なるシステム間で行われることを可能にするために使用されるおおよその条件である。 <ol><li>ピペット石英キュベットに精製されたAuNPコロイド1,000 mg / Lの試料を1.3ミリリットルとRFフィールドにこれを紹介する。これは、特注のテフロン（登録商標）サンプルホルダーを使用することによって行うことができる。 120秒またはサンプルが電気アークや急激な沸騰を防ぐために、70℃に達するまでの期間、RFフィールドにサンプルを公開しています。カナダ赤外線カメラ·関連ソフトウェアを使用して熱画像データ（および制御領域）pture。この手順を3回繰り返します。 </li><li> DI水バッファからAuNPsを抽出するために別の50 kDaの遠心フィルターを通して試料を濾過する。 3回は再び、RFフィールドにバッファを再公開します。 AuNPコロイドおよび背景DI水バッファ間のHRの差がAuNPs自身のために人事を決定します。 AuNPに〜0.25℃/秒の依存人事を与える〜0.3℃/秒と0.05℃/秒の時間得ることを期待しています。 試験管内/ vivo実験用の1.3ミリリットルの水に、フィルタからの残りAuNPsを再懸濁します。 </li></ol></li></ol> 2。ナノ支援RF誘発性高体温：in vitro試験 <ol><li>これらのインビトロ研究は、2D単層を形成し、癌細胞型の任意のタイプに適用することができる。この実験では、ヒト肝細胞癌は、Hep3B細胞由来の使用。 <ol><li>プレート〜5万CEL増殖培地1mlの12ウェルプレートの前面3つのウェル中のls。 （コントロールとしてのNPの研究と3枚のために3枚を使用してください）​​この6回繰り返します。 NPSを導入する前に24時間、37.5℃でインキュベートする。 5分間のバイオセーフティキャビネット紫外線露光を​​用いて最初にNPSを殺菌する。 </li><li>それぞれにうまく千mg / LのAuNP溶液0.1mlを導入し、さらに24時間のままにしておきます。 3対照細胞プレートの各ウェルに0.1mlの水を加え、さらに24時間のままにしておきます。 </li><li> 24時間後に細胞培地を吸引し、任意の表面に結合したAuNPsを除去してPBSで洗って、合格しています。細胞培地を交換してください。セルは現在、RF被爆の準備ができている。 </li></ol></li><li> RFフィールド内の各12ウェルセルパックを置きます。細胞は31℃に冷却するまで待ちますRF発生器の電源を入れ、3.5分間さらす。細胞培地の最終温度は〜37℃になりますRFフィールドをオフにします。細胞を除去し、分析の前に24時間、インキュベーターに配置します。 <ol> &lt;李&gt;インキュベーターと吸引細胞培地から細胞を取り出します。 MTT試薬の0.4ミリリットルでなく、各ウェルに細胞培地の1.6ミリリットルを追加します。 4時間細胞をインキュベートする。培地を吸引し、ジメチルスルホキシド（DMSO）2mlで置き換える。ベンチロッカーに細胞プレートを配置し、DMSOは、MTT試薬を可溶化することを可能にするために10分間のままにしておきます。最後に、光学的にピペット100 96ウェルプレートにそれぞれの液とは、そのようなSPECTROstarナノプレートリーダーなどのプレートリーダーを用いて570nmでよくお読みください。 </li></ol></li></ol> 3。ナノ支援RF誘発性高体温：in vivo試験 <ol><li>これらのインビボ研究は、同所性または異所性マウスモデルにおいて、固形腫瘍を形成する任意の種類の癌にも適用することができる。この実験は、異所性腫瘍をBALB-CヌードマウスモデルでのHep3B肝癌細胞を使用する。 </li><li>注：すべてのin vivo実験は、関連するすべてのガイドライン、規制、規制当局に準拠して実行されます。また、実証されているプロトコルは、テキサス大学MDアンダーソンがんセンターの施設内動物管理使用委員会（IACUC）の指導と承認の下で行われた。 <ol><li>適切な増殖培地で、組織培養フラスコ中で適切な数の細胞（〜100 k）を成長させる。細胞培養の間、5％CO 2、37℃インキュベーターでインキュベートする。 </li><li>トリプシンで細胞を処理（フラスコから分離するために）、すべての25μlのための200万個の細胞の溶液を生成します。 （氷上）マトリゲル等量を追加し、最終的な注射液を調製し、十分に混合。マウスの背中に所望の位置に、このソリューションを注入し、腫瘍が目的のサイズ（ほとんどの細胞のための2-4週）に成長するために適切な時間を待つ。 RF被曝の前に、BALB-cヌードマウスは、固形腫瘍が子宮外に0.5〜1センチメートル直径を負担する必要があります。 </li></ol></li><li><ol><li> ANAEことにより（この場合、BALB-Cヌードマウス）が使用されたマウスを作製IP注射によるケタミンおよびキシラジンの溶液でそれらをsthetizing。マウスは眠って下落している一方で、37℃に温度制御された室内に保管してください全部で20匹のマウスは、全て同様のサイズ軸受腫瘍を必要とされるであろう。無AuNP注射で両グループ：残りの10匹は、RF-曝露と非RF-曝露のコントロールの間で分割され、一方10匹のマウスを（後者は、PBS注射のみ）と一緒にしてAuNPsせずに使用されます。 </li><li>いったん適切に麻酔、27 Gの針を1-CCの注射器を使用して、腫瘍に直接AuNPsを注入する。 AuNP液をPBSの0.1ミリリットルで200 mg / LでのAuの濃度である必要があります。注射後、血液を吸収し、拭き、アルコールで注射部位を拭くために、外科綿棒を使用しています。 </li><li>次いで、RF発生器の受容頭部に処理されるべきマウスを取り付ける。腫瘍が送信ヘッドに最も近くなるようにマウスを配置しなければならない。処置されるべきされていない領域を遮蔽、ならびに感度銅テープと、目、耳、手足などの分野をTIVE。電荷の蓄積が発生しないように銅テープを適切に接地面と接触していることを確認してください。また、露光領域は、所望の治療部位の大きさよりも少なくとも1cmのギャップを持っている必要があります。 </li><li>位置赤外線熱カメラ、腫瘍および治療領域が表示されるように。 5分間のRFをオンにします。生じた温度曲線を記録します。治療は、直ちに温度を超える42℃の停止処理を実現した場合。 </li></ol></li><li><ol><li>彼らが意識的になるまでのRF曝露後に暖かい室内での麻酔からマウスを回復する。 </li><li> （ - 3.4.1 3.3.1ステップ）48時間後に同じマウスで実験を繰り返す。 </li><li>実験後、制度的なプロトコルと手順に従ってマウスを安楽死させる。腫瘍の重量を記録します。組織学的分析のためにホルマリンを使用して腫瘍を固定し、パラフィンに埋め込む。腫瘍切片は通常、ウィットに染色される例えば Ki-67の時間ヘマトキシリン-および治療 ​​の有効性を測るに関連するターゲットについては、カスパーゼ3 などを切断した。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gannon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanotube-enhanced+thermal+destruction+of+cancer+cells+in+a+noninvasive+radiofrequency+field%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Carbon nanotube-enhanced thermal destruction of cancer cells in a noninvasive radiofrequency field.</a> Cancer. 110, 2654(2007).</li>
<li>Curley, S. A., Cherukuri, P., Briggs, K., Patra, C. R., Upton, M., Dolson, E., Mukherjee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+radiofrequency+field-induced+hyperthermic+cytotoxicity+in+human+cancer+cells+using+cetuximab-targeted+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Ther.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive radiofrequency field-induced hyperthermic cytotoxicity in human cancer cells using cetuximab-targeted gold nanoparticles.</a> J. Exp. Ther. Oncol. 7, 313(2008).</li>
<li>Gannon, C. J., Patra, C. R., Bhattacharya, R., Mukherjee, P., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+gold+nanoparticles+enhance+non-invasive+radiofrequency+thermal+destruction+of+human+gastrointestinal+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Intracellular gold nanoparticles enhance non-invasive radiofrequency thermal destruction of human gastrointestinal cancer cells.</a> Journal of Nanobiotechnology. 6, 2(2008).</li>
<li>Raoof, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+antibody-conjugated+gold+nanoparticles+in+the+endolysosomal+nanoenvironment%3A+implications+for+noninvasive+radiofrequency-based+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Stability of antibody-conjugated gold nanoparticles in the endolysosomal nanoenvironment: implications for noninvasive radiofrequency-based cancer therapy.</a> Nanomedicine. 8, 1096(2012).</li>
<li>Glazer, E. S., Massey, K. L., Zhu, C., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+carcinoma+cells+are+susceptible+to+noninvasive+radio+frequency+fields+after+treatment+with+targeted+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Pancreatic carcinoma cells are susceptible to noninvasive radio frequency fields after treatment with targeted gold nanoparticles.</a> Surgery. 148, 319(2010).</li>
<li>Glazer, E. S., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiofrequency+field-induced+thermal+cytotoxicity+in+cancer+cells+treated+with+fluorescent+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Radiofrequency field-induced thermal cytotoxicity in cancer cells treated with fluorescent nanoparticles.</a> Cancer. 116, 3285(2010).</li>
<li>Glazer, E. S., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+radiofrequency+ablation+of+malignancies+mediated+by+quantum+dots%2C+gold+nanoparticles+and+carbon+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Delivery%22%5BJournal%5D)">Non-invasive radiofrequency ablation of malignancies mediated by quantum dots, gold nanoparticles and carbon nanotubes.</a> Therapeutic Delivery. 2, 1325(2011).</li>
<li>Corr, S. J., Raoof, M., Mackeyev, Y., Phounsavath, S., Cheney, M. A., Cisneros, B. T., Shur, M., Gozin, M., McNally, P. J., Wilson, L. J., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrate-Capped+Gold+Nanoparticle+Electrophoretic+Heat+Production+in+Response+to+a+Time-Varying+Radiofrequency+Electric-Field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Citrate-Capped Gold Nanoparticle Electrophoretic Heat Production in Response to a Time-Varying Radiofrequency Electric-Field.</a> J. Phys. Chem. C. 116, 24380(2012).</li>
<li>Kruse, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Radio-Frequency+Coupling+Network+for+Heating+of+Citrate-Coated+Gold+Nanoparticles+for+Cancer+Therapy%3A+Design+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">A Radio-Frequency Coupling Network for Heating of Citrate-Coated Gold Nanoparticles for Cancer Therapy: Design and Analysis.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 58, 10(2011).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negligible+absorption+of+radiofrequency+radiation+by+colloidal+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid+Interf.+Sci%22%5BJournal%5D)">Negligible absorption of radiofrequency radiation by colloidal gold nanoparticles.</a> J. Colloid Interf. Sci. 358, 47(2011).</li>
<li>Liu, X., Chen, H. J., Chen, X., Parini, C., Wen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+frequency+heating+of+gold+nanoparticle+dispersions+for+non-invasive+thermal+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Low frequency heating of gold nanoparticle dispersions for non-invasive thermal therapies.</a> Nanoscale. , (2012).</li>
<li>Sassaroli, E., Li, K. C. P., O'Neill, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radio+frequency+absorption+in+gold+nanoparticle+suspensions%3A+a+phenomenological+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+D+App.+Phys%22%5BJournal%5D)">Radio frequency absorption in gold nanoparticle suspensions: a phenomenological study.</a> J. Phys. D App. Phys. 45, 075303(2012).</li>
<li>Worle-Knirsch, J. M., Pulskamp, K., Krug, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oops+they+did+it+again%21+Carbon+nanotubes+hoax+scientists+in+viability+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Oops they did it again! Carbon nanotubes hoax scientists in viability assays.</a> Nano Lett. 6, 1261(2006).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

これらのプロトコルは、実験者が完全に（この場合AuNPs）は、癌治療のためのRF誘導性高体温を増加させることができるためにナノ物質程度を分析することを可能にする。第一のプロトコルは、特に高濃度精製AuNPサンプルから熱産生を分析して扱っています。他のグループは、主にAuNPsがAuNPs自身9-11にせずに懸濁させるバッファから熱産生を報告しているが、それらのRFシステムは、直径AuNPs低濃度の&gt; 10ナノメートルだけでなく、と低いRF動 ​​作電力を使用した電気、 AuNPsから顕著な高周波加熱効果を表示することが低い磁場強度&lt;90 kVの/ M。唯一このレポートに記載されているプロトコルおよびパラメータに従って、実験者は、ナノスケールの熱現象を観察することができます。 in vitroのセクションでは、セルラーRF-NPインターフェースの開発、最適化されたRF / NP誘発性高体温のために研究することができます。 BEFAuNPsとRF曝露の鉱石添加は、あなたが（この場合のHep3B）に関連した癌細胞株の生存可能な二次元層...

（それらの固有の電気誘電率）の生体組織によるRFエネルギーの吸収は、最終的には温熱により細胞死をもたらす時間の関数として高められた組織温度をもたらす。それは、癌温熱療法は、癌細胞内に内在化し、隣接する健康な無傷の、正常細胞を残して、RF熱変換体として作用する標的化ナノ材料の使用によって最適化することができると仮定される。いくつかの報告が既にNPの様々な癌壊死1-4助剤として有効なRF熱源として作用することが示されている。 両方のインビトロおよびインビボ RF実験に使用した場合にこれらの点は、金のNP（AuNPs）3-5、カーボンナノチューブ1、及び量子ドット6において、図7は、刺激的な特性を示している。 RF場に露出これらのNPの加熱機構の正確な性質は、依然として、一連の議論されているがAuNPsを使用した基本的な実験は、NPのサイズと集約状態の両方で大きな意義を置いている。これは、RF場8にさらされたときの直径を有するのみAuNPs &lt;10ナノメートルで加熱することが示された。 AuNPsが凝集している場合にも、この加熱機構を大幅に減衰する。この集約状態は、効果的なRF療法4用endolysomal細胞内コンパートメント内AuNPコロイド安定性を最適化する際に重要視しin vitroモデル内で検証されました。ただし、このデータを収集し、評価するために使用される技術及び実験的な原理は、特にNPコロイドからRF熱プロファイルを検証する場合には、問題となる可能性がある。 いくつかの報告のNPが懸濁されているバックグラウンドイオン性懸濁液のジュール加熱は、主RFの熱発生源ではなく、それ自体のNP 9-12であり得ることを示している。私たちの最近の論文8は、Tを検証したが彼は10ナノメートル未満の直径のAuNPsからの熱を生成する際に、RF相互作用の使用は、この記事の中で、より詳細にこれらのプロトコルを記述することを目指しています。 また、in vitroおよび肝臓癌モデルのin vivo実験の両方において高体温の熱AuNPs薬としての有効性を評価するために必要なプロトコルおよび技術を実証する。我々は、クエン酸をかぶったAuNPsの単純なコロイドに主に焦点を当てているが、同技術は、抗体と化学療法 - 共役複合体のような他のAuNPハイブリッドに適用することができます。これらの原則に付着していることで実験者がうまくいけば、急速に効果的なRF誘導感熱温熱剤であることがあらゆるナノ材料の可能性を評価することができるはずです。

<table><tbody><tr><td colspan="4">試薬/材料</td></tr><tr><td>500 ml 金ナノ粒子 (5 nm)</td><td>Ted Pella, INC</td><td>15702-5</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4/-15 Centrifugal Filter Units (50 kDa)</td><td>Millipore</td><td>UFC805024/UFC910096</td><td>(4 ml and 15 ml volumes)</td></tr><tr><td>MEM X1 Cell Culture Media</td><td>Cellgro</td><td>10-101-CV(</td><td>必要に応じて追加の栄養素を追加)</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>シグマ</td><td>F4135-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>銅テープ</td><td>テッドペラ</td><td>16072</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Kanzius RFシステム(13.56 MHZ)</td><td>ThermMed, LLC, Inc.(米国ペンシルベニア州エリー)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IRカメラ</td><td>FLIR SC 6000、FLIR Systems, Inc.(米国マサチューセッツ州ボストン)</td><td>お問い合わせFLIR</td><td></td></tr><tr><td>1.3 ml Quartz Cuvette</td><td>ThermMed, LLC,Inc. (米国ペンシルベニア州エリー)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>テフロンサンプルホルダー</td> with <td>Rotary Stage ThermMed, LLC, Inc. (米国ペンシルベニア州エリー)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPECTROstar Nano Microplate reader</td><td>BGM Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis spectrometer</td><td>Applied Nanofluorescence, Houston, TX)</td><td>NS1 NanoSpectralyzer</td><td></td></tr><tr><td>ICP-&#8211;S</td><td>PerkinElmer</td><td>Optima 4300 DV</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern</td><td>Zen 3600 Zetasizer</td><td></td></tr></tbody></table>

非侵襲ハイパーサーミアがん治療のための金ナノ粒子と生体系とラジオ波の相互作用を評価するためのプロトコル

Protocols for Assessing Radiofrequency Interactions with Gold Nanoparticles and Biological Systems for Non-invasive Hyperthermia Cancer Therapy

既存の対応物よりも毒性および侵襲性癌療法が非常に望ましい。最小限の毒性を引き起こす、身体深部に浸透RF電界フィールドの使用は、現在、非侵襲性癌療法の実行可能な手段として研究されている。これは、内在化ナノ粒子（NPを）有するRFエネルギーの相互作用は、最終的には細胞壊死で終わる、セルの（温熱療法）を引き起こす可能性が過熱する熱を放出することが想定される。 非生物学的システムの場合、我々は、高濃度のNPコロイドによって遊離熱を定量化に関する詳細なプロトコルを提示する。生物系は、in vitro実験の場合には、我々は、効果的に、バルク媒体の加熱アーチファクトが有意にデータを不明瞭にすることなく、RFエネルギーに癌細胞を露出させるために接着されなければならない技術および条件を記載している。最後に、我々は詳細な方法論Fを与えるまたは異所性肝癌腫瘍を用いたin vivoマウスモデルで 。

1。例としてAuNPs：NPコロイドのRF加熱を評価する。 セクション1.1に従った後 - 1.2.3を5 nmおよび10 nmの直径AuNPsの高濃縮、安定し、かつ精製されたソリューションを持っていることを期待しています。として購入したストック溶液を500ミリリットルから1,000ミリグラム/ Lの濃度で溶液の少なくとも4ミリリットルを得ることを期待図2に示されているようにAuNPsこの濃度でのバックグラウンドDI水緩衝液のHRとの間の差は、それぞれ、〜0.25°C /秒、5〜0.1°C /秒から10nm AuNPsであるべきである。 2。ナノ支援RF誘導ハイパーサーミア：in vitro試験結果は、理想的にAuNPsを内面化しているRF電界に曝露された細胞は、非AuNPのRF曝露された細胞よりも小さい実行可能であることを示す必要があります。そのような予想される結果の一例を図...

私たちは、13.56MHzの高周波（RF）の両方の非生物学的および生物学的システムにおける金ナノ粒子コロイドと電気分野（ 試験管内 / 生体内 ）の相互作用を調査するために使用されるプロトコルについて説明します。これらの相互作用は、癌治療における用途のために研究されている。

Cancer therapies  which are less toxic and invasive than their existing counterparts are highly  desirable. The use of RF electric-fields that penetrate ...

本手順の全体的な目的は、13.56 megahertzの高周波電場における金ナノ粒子の発熱特性を、in vitroおよびin vivoで評価することです。まず、石英管を用いて、高濃度金ナノ粒子およびその緩衝液の発熱速度を評価します。次に、培養がん細胞を用いて金ナノ粒子のin vitro毒性試験を行います。第3のステップでは、マウスの異所性がんモデルを用いて金ナノ粒子のin vivo研究を行います。最終的に、懸濁状態のナノ粒子、in vitro、およびin vivoでの分析を通じて、調査したナノ粒子がRF介在性ハイパーサーミアにおいて有効な薬剤となり得るかどうかが明らかになります。この手法は、粒子自体によって加熱が起こるのか、またそれを治療目的で使用できるのかといった、ナノ粒子介在性非侵襲的ラジオ周波数ハイパーサーミア分野における重要な疑問への回答に寄与します。一般的に、この手法に不慣れな方は、この種の実験を行うための確立されたプロトコルが多くないため、苦労することがあります。本手順のデモンストレーションは、リサーチアシスタントのCisneros、ポストドクトラルサイエンティストのStuart Core、およびもう一人のポストドクトラルサイエンティストであるLeila Greenが行います。例として、市販の直径5 nmの金ナノ粒子が入った500 mLボトルから開始します。金ナノ粒子ストック溶液を約125 milliliters取り、6本の50 kilodalton遠心フィルターチューブに等分して入れ、3000 RPMで2分5秒間遠心分離します。ろ過されたバッファーである上清を除去し、各フィルターにさらにストック溶液を補充します。すべてのナノ粒子溶液がろ過されるまで、遠心分離、バッファーの除去、およびチューブへの再充填を繰り返します。最後の添加後、ろ過済みのバッファーを同量の脱イオン水に置き換え、ろ過済みのバッファーサンプルをRF装置にロードした後、同様の工程をさらに約8回繰り返します。赤外線カメラソフトウェアを使用して、QVE上にボックスを作成し、加熱プロファイルをキャプチャします。8回の洗浄後、5 nm金ナノ粒子ろ液の加熱データは、脱イオン水のデータに近づきます。UV-vis解析は、不純物吸収ピークのモニタリングにも利用できます。ここに示したのはクリーンなスペクトルです。バッファー中の不純物が完全に除去されたら、フィルターチューブ内のフィルターからナノ粒子を回収し、0.5 millilitersの脱イオン水に懸濁させます。次に、6つの懸濁液すべてを1本の15 milliliterチューブにまとめます。続いて、UV VISおよびゼータ電位を用いてサンプルを分析し、安定性データを取得します。ナノ粒子濃度を決定するには、I-C-P-O-E-SまたはICP質量分析計を使用してください。Kansas RFシステムまたは負荷の派生系を用い、1.3 milliliterのシリンジクオーツベータ（quartz vete）を使用し、Qベータが配置される空気中のRF電界を約90 kilovolts per meterに設定することで、SEMおよび/またはTEM解析を用いて形態学的データを取得することも可能です。0.9%塩化ナトリウムを含む標準的な生理食塩水サンプルでは、電界は約1.1 kilovolts per meterまで低減します。これらは、異なるRFシステム間での比較を可能にするために用いられる概略条件です。次に、清潔な石英製のキュベットに、濃度 1000 mg/L の精製金ナノ粒子懸濁液を 1.3 mL 分注します。サンプルを RF 電磁場に 120 秒間、またはサンプルの温度が 70 °C に達するまで曝露させます。過剰な曝露は、アーク放電や急激な沸騰を引き起こす可能性があります。IRカメラと関連ソフトウェアを使用して、熱画像データおよびコントロール領域をキャプチャします。同一サンプルに対してこの手順を3回繰り返します。次に、サンプルを別の50 kilodalton遠心フィルターでろ過し、水バッファーから金ナノ粒子を抽出します。次に、バッファーのみを再びRF電界に曝露させます。ここでも、金ナノ粒子コロイドとろ液との間のhrsの差を3倍したものが、金ナノ粒子自体によるHRとなります。最後に、フィルターに残った金ナノ粒子を1.3 millilitersの水に懸濁し、さらなる実験に使用します。これらのin vitro研究は、2Dモノレイヤーを形成するあらゆる種類の癌細胞に適用可能です。本例では、ヒト肝細胞癌由来のHep 3B細胞を用い、12ウェルプレートの3つのウェルに、1 mLの増殖培地と共に約50,000個の細胞を播種します。ナノ粒子研究用に3枚、コントロール用に3枚のプレートがいっぱいになるまで、培地で細胞のローディングを続けます。プレートを37.5 °Cで24時間インキュベートします。翌日、3枚のナノ粒子プレートの各ウェルに、1000 mg/Lの金ナノ粒子溶液を0.1 mLずつ導入し、コントロールプレートと比較します。各ウェルに0.1 milliliterの水を加え、すべてのプレートをさらに24時間インキュベートします。さらに24時間後、細胞培地を吸引し、表面に結合した金ナノ粒子を除去するためにPBSで細胞を洗浄します。その後、細胞培地を補充します。これで細胞をRF照射に供する準備が整いました。各12ウェル細胞パックをRF電場内に設置し、細胞が31 °Cまで冷却されるまで待ちます。わずかに冷却された後、細胞に3.5分間のRF照射を行います。培地の最終温度は約37 °Cになります。細胞をインキュベーターに移し、解析まで24時間待機させます。細胞の準備が整ったら、培地を吸引し、培地で希釈した25%MTT試薬 2 mLと交換します。その後、細胞をさらに4時間インキュベートします。次に、MTT培地を2 mLのDMSOに置換します。細胞プレートをベンチロッカーに載せ、10分間揺らしてMTT試薬をDMSOに溶解させます。最後に、各ウェルから100 µLのサンプルを96ウェルプレートにピペッティングし、570 nmでプレートを光学的に読み取ります。これらのin vivo研究は、正位または異位ミラーリングモデルで固形腫瘍を形成するあらゆる種類の癌に適用可能です。本例では、BPCヌードマウスを用いてHep 3B肝癌細胞を使用しています。約100,000個の細胞から開始し、トリプシン処理した細胞を用いて、25 µLあたり200万個の細胞濃度となる溶液を調製します。細胞懸濁液に同量の氷冷したMatrigelを加え、ピペットで繰り返し吸引して十分に混合します。次に、混合した懸濁液を各動物の背中の所定の位置に注入します。数週間後、腫瘍の直径が0.5～1 cmになった時点でRF治療を開始します。ケタミンとキシラジンの溶液を腹腔内（IP）投与してマウスを麻酔し、保温してください。次に、1 ccシリンジに27または30ゲージの針を装着し、腫瘍の半分に金ナノ粒子を直接注入します。外科用綿棒で血液を吸収させ、アルコール綿で注入部位を拭き取ります。対照群として、腫瘍の残りの半分にPBSのみを注入します。次に、各群の半数のマウスに処置を行います。マウスをRFジェネレーターの受信ヘッドに固定し、目、耳、足の指を含む非処置領域を銅テープで遮蔽します。この実験において最も重要な点は、マウスを適切に接地させることです。適切に接地されていない場合、動物に電荷が蓄積し、熱傷や電気的な皮膚損傷を引き起こす可能性があります。これは容易に防止することが可能です。腫瘍を、希望する治療部位の幅よりも少なくとも1cm以上、送信ヘッドから離れた位置に配置します。次に、腫瘍と治療領域が見えるように赤外線（IR）サーマルカメラを設置します。RFを5分間オンにし、得られた温度曲線を記録します。皮膚表面温度が42°Cを超えた場合は、RF照射後ただちに治療を中止してください。マウスを保温チャンバーに入れ、意識が回復するまで安静にします。この治療を週2回、3週間繰り返します。その後、最終的なRF照射から48時間後にマウスを安楽死させ、腫瘍を処理します。精製ゴールドナノ粒子のRF加熱は、粒子と背景の脱イオン水緩衝液との間の温度差によって決定されました。結果は、5 nmおよび10 nmのナノ粒子の両方において、期待通りでした。精製された金ナノ粒子をヒト肝細胞癌由来のHep 3B細胞に導入しました。これらの細胞をRF（高周波）電場に曝露させると、通常、ナノ粒子を内部に取り込んでいない細胞をRFに曝露させた場合よりも生存率が低下します。図3は、使用した金ナノ粒子単体では毒性が限定的である一方、RF誘発性の優れた細胞毒性を有するという理想的なシナリオを示しています。さまざまな種類のナノ材料を用いたこれまでのin vitroの結果に関する包括的なレビューについては、文献を参照してください。Hep3B肝がん細胞を用いて、バルブドヌードマウスの背部に腫瘍を形成させた。これらの腫瘍にPBS懸濁金ナノ粒子を注入し、続いてRF照射を行った。治療後の解析の結果、本治療が腫瘍の増殖を抑制し、腫瘍重量を減少させたことが明らかになった。このビデオを視聴することで、ナノ粒子のRF応答特性、およびin vitroおよびin vivoでの溶解性を判定することにより、RF介在性ハイパーサーミアに使用するためのナノ粒子をどのように評価するかについて、十分な理解を深めることができます。高出力のRF電界を取り扱うことは非常に危険であることに留意してください。作動中の電界に触れたり、手を近づけたりしないでください。電場の測定を行い、必要に応じてファラデーケージなどの適切な遮蔽装置を使用してください。一般的に、長時間にわたる強電場への曝露は常に最小限に抑えるようにしてください。

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