Name: 長期増強の非常に安定しており、再現性録音のための改良された準備と海馬マウススライスの保全 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶ マウス海馬スライスの準備と保存法により、8時間以上の安定した長期増強（LTP）記録を95%の成功率で実現する方法。シナプス可塑性の機構解明に有用な電気生理学的手法です。

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我々は技術支援のためにバーナードFoucartに感謝します。この作品は、科学研究のためにベルギーの基金（FRS-FNRS）で医療研究のためのエリザベート王妃基金によってサポートされていました。アニエスヴィレは、科学研究のためにベルギーの基金で研究員です。

全ての動物の手順は、研究における動物のケアと使用のための衛生規制の国立研究所に合わせて、地元の倫理委員会の契約に行った。 1。人工脳脊髄液の調製同メディアは、解剖カットし、休息期間と電気生理学的記録中にスライス（1ml /分）灌流するために使用されます。このメディアは124のNaCl、4.4 mMのKClを、26 mMの炭酸水素ナトリウム、1mMののNaH 2 PO 4、2.5mMのCaCl 2を、1.3のMgSO 4、10mMのD-グルコースから構成されている。 <ol><li>溶液（1 M）に既にあるMgSO 4を除くACSF 2Lのための異なるコンポーネントを重量を量る。標準溶液を使用すると、 硫酸マグネシウム、粉末で吸湿性が高いための Mg 2 +の正確な濃度を確実にすることができます。のCa 2 +：の Mg 2 +比が大幅にLTP誘導とメンテナンスに影響を及ぼす14ので、それらの割合は常に尊重されなければならない。 </li><li>ガラス中のCaCl 2を除いてすべてのコンポーネントを置くには、メスシリンダー、蒸留H 2 Oで2 Lにもたらす</li><li>精力的にかき混ぜる。すべてが溶解するときに、タンク（95％O 2、5％CO 2）に取り付けられた水槽のバブラー、チューブを介してカーボゲンを追加する。数分待ってから、pHは重炭酸塩緩衝液の作用によって7.4に固定されて塩化カルシウムを追加します。 </li><li>冷蔵長方形のガラス皿で600ミリリットルを維持し、°C皿の周りに氷を4にクールダウン。このメディアは、海馬の解剖のために使用されます。 </li><li>残り1400ミリリットルをフィルタリングし、三角フラスコに保つ。 </li></ol> 2。電気生理学的リグと脳スライス記録商工会議所の調製灌流回路は、2蠕動ポンプ、リザーブタンク及びtから他のポンピング使用される流体からの新鮮な流体をポンピングするいずれかの形成されている彼はビンにチャンバーを記録。新鮮な流体は、それが重力（ 図1A）によってインターフェース記録チャンバに到達する前に再酸素化と温め、自家製灌流システムに追加される。インタフェース記録室はFST（ファイン科学ツール、バンクーバー、カナダ、 図1B）によって設計されました。組織切片は、リムーバブルウェル環に結合して不織布​​ネットフィルタ上に配置され、連続的に吸引ウェル針の高さを調整することにより、インターフェイス条件下で維持することができる。自家製プラスチックその端部でブロックチューブと横方向穿孔（0.5 mm）をチャンバ内のレベルの安定性を高めるために、吸引針に固定されている。記録ヘッドは、記録ヘッド（水滴の形成を減少させるため）に偏向口から湿った空気を通過させることによって湿潤環境を維持するのに役立ちガス分散石を含む水浴上に取り付けられている。浴および媒体温度を連続的にDC電流番目のレベルを変えることによって制御される水浴中で荒いシリコーンゴム埋ヒーター素子。水浴と記録ウェルのサーミスタは、チャンバ温度はこれらのサイトに設定し、正確に監視できるようにする。 チャンバの加熱システムは、全体のリグの温度を制御するグローバル加熱システムにより完成される。ソフトウェアは、エジンバラ（大学の研究者によって開発された<a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a> ）モニターと酸素空気の温度、脳切片、電極および長期的録音（ 図1C）のための安定した環境を提供し、残りのリグをイコライズ。マウス海馬スライスに使用温度は28℃です。 <ol><li> 20分の最小用蒸留H 2 Oとのすべての灌流回路をすすぎ、暖房システムを起動します。 </li><li>回路内カーボゲンバブリングを開始します。カーボゲンをfを通して自家製灌流チューブに到着ILTERキャンドルと記録室下水浴した。水浴中の流量は、流量計により制御される。流速が遅すぎる場合、組織が低酸素となる可能性がある。流量が高すぎると逆に、ガスが十分に温められ、そして組織の乾燥につながる加湿ないかもしれない。高いガス流量はまた、浸透圧ショックに至る下水浴から組織の上に噴霧水の可能性を高めることができる。これは、偏向口の出口にナイロンメッシュのビット（100μm）を添加することによって防止することができる。 </li><li>回路を排出し、濾過ACSFでいっぱい。 </li><li>保持チャンバー内のスライスをサポートするリングを置く。 500から750ミクロンの範囲のメッシュ開口部を有する不織布ネットフィルタは、2つの部分から成る樹脂、エポキシ接着剤で引き伸ばされ、リングに取り付けられている。不織布ネットフィルタは87％のポリアミドおよび13％エラスタン（パンティ15デン）で構成されている。接着剤はリンの表面にレリーフの形成を避けるために慎重に適用しなければならないgであった。 </li><li>慎重に回路からすべての気泡を除去。 </li><li>吸引針のネジで記録チャンバー内ACSFのレベルを調整します。蠕動ポンプの速度は、入口ポンプの1ml /分および出口ポンプ用5ml /分に調節される。 </li></ol>灌流システムは、硬質耐振動テーブル上に配置され、ファラデーケージに囲まれている。 3。解剖エリアの調製手術器具：＃11ブレードとメス、小さな標準解剖はさみ、春のはさみ、湾曲したピンセット、2ハイデマンspatulaeとスプーン。 補足資料：ギロチン、underpad、カミソリの刃でマッキルウェーン組織チョッパー、ろ紙、ゴム乳首付ガラスパスツールピペット、2プラスチック製パスツールは広口、ペトリ皿、金属製のシリンダーとのいずれかをピペット直径7mm（ 図2A）。 <ol><l私は&gt;冷たいACSF（ステップ1で調製したもの）でいっぱい解剖皿に、ろ紙に包まれた染色皿から冷蔵ガラス蓋を浸す。慎重に水槽バブラー（ 図2A）を介し気泡や含酸ACSFを削除します。 </li><li>使用のために楽器をレイアウトします。組織チョッパープレートと蒸留水とエーテル（ 図2B）で洗浄し、新しいカミソリの刃でろ紙の三層を追加します。それが紙に触れたときにカミソリの刃を水平にする必要があります。ブレード力が極大値の約3分の1に極大値および速度の半分に調整される。 </li><li>あなたはその後、時間を持っていないので、すべてが（楽器、温度...）準備ができているか注意深く確認してください。 </li><li>冷たいACSFでいっぱいパスツールピペットで解剖を噴霧する誰かを尋ねる。 </li><li>断頭前ネンブタールIP（100 mg / kg）を、マウスを麻酔。ハロタン麻酔を使用することもできる。我々は両方の方法とobtaを比較した同じ結果をINED。断頭を麻酔下で実施する必要がなく、頸椎脱臼を用いることもできる。しかし頸椎脱臼は、動物の苦痛を避けるために、非常に良い練習が必要です。 </li><li>冷たいACSF連続シャワーの下で可能な限り迅速にunderpadに解剖。 </li></ol> 4。脳の取り外し<ol><li>銃口上の1つの手の人差し指と親指で、まだ頭を押さえながら、ギロチンカットのエッジで開始し、前頭骨に吻方ランニング頭の上の真ん中に沿って解剖ハサミで切開をする。 </li><li>完全に頭蓋骨プレートを露出させ、頭の尾側の筋肉を除去するために、ヘッドの各側面に皮膚の筋肉を切って。 </li><li>解剖ハサミで、両側に側頭筋をカットし、側頭プレートに沿って、その後横方向に、途中で正面のプレートをカット。次に、2つのPL間、後頭骨に少しカットをするATES。 </li><li>それぞれの側では、後頭部プレートの尾ベースでカット。 </li><li>春のはさみと矢状縫合に沿ってカットします。 </li><li>鉗子で、お互いからそれらを離れて広めることで頭蓋骨の半分を削除します。 </li><li>メスで、単に嗅球後に横方向にカットし、小脳はその後風邪ACSFと解剖皿に抽出された脳を突入直前。 </li></ol> 5。海馬の解剖<ol><li>脳は解剖皿に漬された後、真ん中に挿入メスで互いに二つの半球を断つ。 </li><li>海馬の解剖は、双眼手術用顕微鏡（X25、 図2A）を通して、視覚的制御下spatulaeを用いて行われる。 1半球では、慎重に側脳室を見て構造を広げた。脳幹と間脳を取り外します。これは、一方の側の前頭皮質でspatulaeを適用することによって、オン間脳で行われます反対側。 spatulaeと海馬に手を触れないようにし、組織切片の間にそれをストレッチしないように注意してください。 </li><li>心室にへらを挿入することによって、優しく皮質（アウェイロール）の海馬を押し出すその後円蓋を断つ。 </li><li>海馬が抽出されると、過剰な皮質組織と残りの血管を取り除く。 </li></ol> 6。スライスの切断<ol><li>広口プラスチック製パスツールピペットを用いて、そのアルベア表面上（凸側）をスプーンで海馬を転送します。 </li><li>標準のプラスチック製パスツールピペットを用いて余分な水分を取り除きます。 </li><li>垂直方向にほぼチョッパーのろ紙（ 図2B）に触れスプーンを先端とその後スプーンを戻す急速にろ紙に触れることによって、スプーンから海馬をオフにドロップします。 </li><li>海馬を配向し、チョッパーと400μmの横断それをスライス（海馬の向きについては、図2C参照カミソリの刃に比べて膿）。できるだけ早く行動する。 </li><li>スライスされた海馬とろ紙を取り出し、スライスを少し広げるために金属製のシリンダーのまわりでそれを包む。その後、ACSFのスプレーとの自由スライスが標準的なプラスチックパスツールピペットを使用しており冷たいACSFでいっぱいペトリ皿にそれらを収集。 </li></ol> 7。インターフェイスにおけるスライスのインキュベーション<ol><li>標準のプラスチック製パスツールピペットでスライスを選択し、迅速に記録室に配置します。スライスは、28でインターフェイスで、直接レコーディング室で解剖のトラウマから回復℃まで</li><li>スライスは、最も可能性の高いシンクします。スライスレベルに達し、それが浮くようにそれを高めるために液面を下げる。 </li><li>レベルを下げながら、正しい位置にスライスを入れます。スライスは常にCA1領域における電極のポジショニング（2刺激と一つの記録電極）を容易にするために、同じように配向されている。 </li><li>時停止流体がインタフェースである。スライスの周りの媒体の &quot;メニスカス&quot;は、メディアの十分なレベルを示す。ネットフィルタは、メディアで飽和したが、完全に水没しないようにする必要があります。 </li><li>穴のあいた蓋の上に置かろ紙で覆わ室に保管してください。 </li><li> 28少なくとも1.5時間スライス休ませ℃に</li></ol> 8。シナプス応答の記録<ol><li>電極を記録：ACSFで満たされたときガラスキャピラリーはMΩ2-5の先端抵抗を得るために引っ張られる。濾紙の小片は、電極の先端の周囲に配置され、骨ワックスを凝縮を低減するために先端に印加される。刺激電極：12.5ミクロン径の白金イリジウムバイポーラクラスタ電極はFHC（USA）から購入する。適切なケアで、各電極（ 図1B）は、少なくとも30回使用することができます。 </li><li> CA1領域の角質放線に電極を置き、すべての電極が並んでアップ（ 図3A）。電極は、ナリシゲのマイクロマニピュレーターとスライスの表面の下で75から150程度に低下する。 2刺激電極はシェーファー側枝2つの別個の束を刺激するために配置されます。電極はスライス上に降下している場合、濾紙は慎重室を閉じ、すべての周りに配置されています。 </li><li>二相性刺激（半波あたり0.08ミリ秒のパルス持続時間）はSIU-V分離ユニットに接続された芝生刺激に一定の電圧で行われる。最大応答は2 Vから最大12 VのフィールドEPSPのに刺激強度を増加することによってチェックさWPI ISO-80アンプで1000倍に増幅し、10 Hzから10 kHzでフィルタリングされます。信号は、次に、ナショナルインスツルメンツ/ D変換器を介してPCに送信される。刺激、データ収集と分析がWinLTPプログラム（使用して実行され<a href="http://www.winltp.com">www.winltp.comを</a> ）。フィールドEPSPを、入力アウトで得られた最大振幅の40％で計上されている曲線を置く。スライスごとに、fEPSP斜面はLTP誘導に先立つ30分かけて平均勾配に対して正規化されています。 </li><li> LTPは、第二の経路は対照として機能し、一方の経路上でのテスト刺激の強度で単一列（100ヘルツ）を適用することによってトリガされる。 </li></ol> 9。セットアップの清掃<ol><li>少なくとも10分間、過酸化水素（H 2 O 2）の3％溶液で全ての回路をすすぎ、その後ドレイン。回路は、注意深く実験を開始する前に、蒸留水でリンスする。他のラボではクリーニングのためにのみ蒸留水を使用しますが、水のみを使用しているとき、我々は配管システム内の暗い残留物の堆積を気づいているように、H 2 O 2を使用することは絶対に必要ではありません。 </li><li>記録室の下に水浴の水を交換してください。 </li><li> 5分間アルコール風呂は刺激電極のヒント。 </li></ol>

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</ol>

利害の衝突は宣言されていない。

我々は我々の研究室で開発され、LTP録音11,17に大きな専門知識を有する他の研究室で使用される方法の組み合わせに起因するプロトコルを開発した。このプロトコルは、成体マウスの海馬に適合され、どの年齢やバックグラウンド遺伝子型の動物において使用することができる。また、アルツハイマー病18,19のような神経変性疾患を開発するトランスジェニックマウスにおけるLTPの分析を行うことができます。 ラット海馬スライスのためにこのプロトコルの使用率は、いくつかの適応を必要とすることができます。例えば、ラットで行われた研究のほとんどは、32℃の代わりに28℃の温度を使用マティスら 20は、老化マウスまたはラットの海馬スライスを調製するための別の方法を提案した。 材料と方法 C57BL/6JマウスはJANVIER SAS（フランス）から来たが、同じ結果がカールからC57BL/6Jマウスを用いて得られる<html>...

今日では、メモリは神経回路レベルで保存し、リコールされている方法の複合体の限られた理解があります。ただし、メモリ記憶の統一仮説が利用可能であり、広く受け入れられている。メモリは、中枢神経系のニューロン間のシナプス結合の強さの変化として記憶される。自分自身で、シナプス可塑性の研究は、主に2画期的な発見の恩恵を受けています。 （1）精実験、ブリスとロモ1では、そのまま麻酔ウサギを使用して、海馬のperforantパスを簡単に高周波数（1秒、100 Hz）での配信は刺激が長続きを引き起こしたことを（いくつかの発見時間）関連のシナプス結合の増加。この魅惑的な現象は、1975年2ダグラスとゴダードによって&quot;長期増強&quot;やLTPと呼ばれていました。 （2）その後、それは人為的にin vitroで生き維持同様の現象が、脳切片（0.6 mm）の中でトリガできることがわかった</eM&gt;。最も広く研究さLTPは、いわゆるCA1領域の錐体ニューロンにおいて誘発生じる電界興奮性シナプス電位を記録しながら、軸索の束（いわゆるシェーファー側枝）に1つまたは複数の破傷風菌を提供することにより、 インビトロで観察された。 LTP誘導のメカニズムは、主に明らかにされている。 AMPA受容体のリン酸化（その効率を増加させる）と、シナプス後膜3に余分なAMPA受容体の組み込み：基本的には、NMDA受容体を介してCa 2 +の流入は、2つの結果を有する酵素を活性化する。対照的に、LTPの維持期のメカニズムは、30〜60分間、より多くの時間スライスのための健康を維持するために、実験的にはるかに困難であるため、特に、不明な点が多い。 研究の多くは、LTPのメカニズムの理解に専念してきており、興味深い理論が年間4-11にわたって詳述されている。しかし、国連ゴマ今、シナプス強度の安定した増加を根底に正確な分子メカニズムは解明されていない。これは、準備のためにさまざまなテクニックを使用して、異なる研究室で以前の結果を再現することが困難と海馬スライスの維持が一因である可能性があります。彼らの方法論の論文では、Sajikumar ら 12は、実験ラット海馬スライスの準備のための条件、安定したLTPの記録の重要性を強調した。このビデオでは、マウス海馬スライスでは非常に安定したLTPを記録することができるように長年にわたって我々の研究室で開発されたすべての最適化手順を提示します。 この最適化は、マウス13、ラット11 LTPのメカニズムを研究する他の研究室が開発し、正常に使用プロトコルから行われている。これは、経験豊富な研究者が成功率が高いと成体マウスでは非常に長期的なLTPを誘導し、記録することができます。 P誘発性LTPのhysiological基礎は慎重にチェックし、14を実証した。この方法論の論文では、解剖の手順が深くスライス興奮性を修正することができますが、温度や酸素のような実験条件のいずれかの変更は、LTPメンテナンスに多大な影響を及ぼす可能性があることを示している。また、すべてのこれらのパラメータの正確な制御が初心者の学生のために数ヶ月の訓練を必要とすることを強調しなければなりません。

<table><tbody><tr><td colspan="4">試薬/材料</strong</td></tr><tr><td>>NaCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>シグマ - Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 1M</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>63126</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Air Liquide (Belgium)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillaries</td><td>WPI, Inc. (UK)</td><td>TW150-4</td><td></td></tr><tr><td>Stimulating Electrodes</td><td>FHC (USA)</td><td>CE2B30</td><td></td></tr><tr><td>手術器具</td><td>FST (ドイツ)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>濾紙 84 g/m2</td><td>Sartorius</td><td>FT-3-105-110</td><td></td></tr><tr><td>Mesh</td><td>Lycra</td><td>15 den</td><td></td></tr><tr><td>Glue</td><td>UHU</td><td>plus endfest300</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Instrument</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>WPI, Inc. (UK)</td><td>ISO-80</td><td></td></tr><tr><td>インターフェース記録室</td><td>FST (ドイツ)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>Gilson (USA)</td><td>Minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>Temperature controller</td><td>University of Edinburgh</td><td><a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Tissue Chopper</td><td>Mcllwain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スティミュレーター</td><td>グラス (アメリカ)</td><td>S88X + SIU-V</td><td></td></tr><tr><td>プログラム解析</td><td>WinLTP</td><td><a href="http://www.winltp.com" target="_blank">www.winltp.com</a></td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>成重</td><td>MM-3 and MMO-220A</td><td></td></tr><tr><td>手術顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A/Dコンバーター</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>NIPCI-6229 Mシリーズ</td><td></td></tr></tbody></table>

長期増強の非常に安定しており、再現性録音のための改良された準備と海馬マウススライスの保全

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

長期増強（LTP）は、シナプスの強さの増加によって特徴付けられるシナプス可塑性の一種であり、メモリ符号化に関与すると考え。 LTPは広く研究されている急性海馬スライスのCA1領域において誘発。しかしこの現象の維持段階の基礎となる分子メカニズムはまだよく理解されていない。これは、異なる研究室で使用されるさまざまな実験条件が一因である可能性があります。確かに、LTPの維持期は酸素、温度や湿度などの外部パラメータに強く依存する。また、解剖後にスライス平面、スライスの生存の向きなどの内部パラメータに依存しています。 すべてのこれらのパラメータの最適化は非常に再現性が非常に安定した長期増強の誘導を可能にします。この方法論は、さらに安定した増加に関与する分子メカニズムを探索するための可能性を提供しています海馬スライスにおけるシナプスの強さである。また、神経生理学的現象のin vitroでの調査での実験条件の重要性を強調しています。

この方法は、成体C57BL/6Jマウス（JANVIER SAS、フランス）14からの急性海馬スライスに誘起長期的な長期増強の特性を分析するために使用されている。驚くべきことに、実験条件の改善がLTPを見るための新しい方法につながっている。我々は、シナプス強度の長期的な増加は、新しいタンパク質の合成を必要としなかったことを示した。 ここでは、LTP誘導がスライスの生存と興奮性に依存することを示す。海馬の解剖が遅すぎたり有害だった、スライスは興奮性が増加し、多シナプス応答は（ 図3B）LTP誘導後に観察することができた。この場合には、LTP誘導はあまり効果的であったと相乗作用が維持されていない。 私たちも、スライスで明らかに健康な、技術的条件は、単一によって誘導されるLTPの期間に大きな影響を持っている、という事実を強調したいと思います刺激の列車。以前の刊行物に、我々のグループは、短時間のLTPがスライス15のリカバリ条件を変更することにより、長期的なも...

本論文では、準備し、維持するために、完全な方法論を提示<em&gt; in vitroで</em成体マウスから&gt;急性海馬スライス。このプロトコルは95％の成功率を8時間より長く非常に安定した長期的な長期増強（LTP）の記録を可能にする。

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

この手順の全体的な目的は、急性海馬スライスにおいて非常に安定し再現性のある長期増強を記録できるようにすることです。まず、顕微鏡下で冷たいA CSFを用いてマウス脳を摘出し、海馬を解剖することでこれを達成します。次に、組織チョッパーを用いて海馬の横断スライスを作成します。次に、切片をインターフェース記録槽に設置し、酸素飽和人工脳脊髄液を灌流させます。最後のステップとして、電極を配置し、海馬のCA1領域におけるシナプス活性を記録します。最終的に、高頻度刺激プロトコルを用いて、非常に安定した長期増強の誘導を示します。本手法を用いることで、シナプス可塑性の根底にあるメカニズムについての知見を得ることができます。また、神経変性疾患や神経系の動物モデル、あるいは免疫疾患などの他の系にも適用可能です。一般的に、本手法に不慣れな方は、すべての操作に高度な技術と多くの練習が必要となるため、習得に苦労すると思われます。まず、灌流回路を蒸留水で最低20分間洗浄します。次に、加熱システムをオンにします。回路内でのカルボジェンのバブリングを開始します。カーボゲンは、記録チャンバー下のウォーターバスにエアディフューザーを通じて供給されます。次に、流量計を用いてウォーターバス内の流量を制御します。その後、回路を排出し、ろ過したA CSFを満たし、気泡を取り除きます。続いて、保持チャンバー内でスライスを支持するためのリングを設置します。回路からすべての気泡を慎重に取り除きます。次に、吸引針のネジを用いて記録室内のA CSFレベルを調整します。この際、流入ポンプの速度は1 mL/minに、流出ポンプは5 mL/minに調整します。解剖を開始する前に、すべての手術器具を準備しておきます。安楽死させたマウスから脳を取り出します。人差し指と親指で頭部を固定し、解剖用ハサミを用いて、ギロチンの切断端から前頭骨に向かって頭頂部の中央に沿って切開します。次に、頭部の両側の皮下筋を切断し、頭蓋骨板を完全に露出させます。次に、頭部の側頭部にある筋肉を除去します。続いて、左右それぞれの側頭筋を側頭板に沿って切除します。その後、前頭板の中央を横方向に切断します。次に、2つのプレートの間にある後頭骨に小さな切開を入れます。両側の後頭骨プレートの底部を切り離します。その後、スプリングシザーを用いて、正中矢状縫合に沿って切開します。最後に、ピンセットで左右半分を外側に広げて、頭蓋骨を取り除きます。次に、メスを用いて小脳の直前と嗅球の直後を横方向に切断し、摘出した脳を冷たい A CSF が入った解剖皿に移します。脳を解剖皿に浸した後、実体顕微鏡下でメスを中央に挿入し、2つの大脳半球を切り離します。一方の半球の構造を慎重に広げ、側脳室を露出させます。一方のスパチュラを前頭皮質に、もう一方を頭部に当てて、脳幹と頭部を除去します。組織切片作成時に、スパチュラで海馬に触れたり、海馬を伸展させたりしないように注意してください。その後、脳弓を切断します。次に、スパチュラを脳室に挿入し、海馬を皮質からそっと押し出します。海馬を取り出した後、過剰な皮質組織と残った血管を広口のプラスチック製パスツールピペットで除去します。海馬をスプーンに載せ、alvi面を上にしてチョッパーのプラットフォームへ移動させます。標準的なプラスチック製パスツールピペットを用いて、スプーンから余分な液体を取り除きます。その後、スプーンを垂直に立て、チョッパー上のフィルターペーパーに触れる直前まで近づけます。フィルターペーパーに素早く接触させ、海馬を落とします。その後、スプーンを取り出します。次に、海馬の向きを調整し、チョッパーを用いて400 micronsの厚さで横断的に切片を作成します。操作はできるだけ迅速に行います。次に、海馬スライスが載ったフィルターペーパーを取り出し、スライスを軽く広げるために金属製シリンダーに巻き付けます。その後、標準的なプラスチック製パスツールピペットを用いてA CSFをスプレーしてスライスを剥離させ、冷やしたCSFを満たしたペトリ皿に回収します。CSFに浸します。選択したスライスを標準的なプラスチック製パステールピペットで記録チャンバーに移します。記録インターフェースチャンバー内にて、28 °Cでスライスを切片作成時のダメージから回復させます。スライスが沈んだ場合は、人工脳脊髄液（A CSF）の水位をスライスの高さまで下げ、その後再びA CSFの水位を上げてスライスを浮かせます。次に、CA1領域への電極配置を容易にする位置にスライスを向けます。A CSFの水位を下げ、界面に達した時点で停止します。スライスの周囲にある培地のメニスカスは、A CSFが十分な量であることを示しています。メッシュは培地で飽和させておく必要がありますが、完全に浸漬させてはいけません。その後、穴あき蓋の上にフィルターペーパーを置き、チャンバーを覆ったままにします。記録を開始する前に、切片を 28 °C で少なくとも1時間30分静置させます。ここでは、同一のニューロン集団に対する2つの独立したシナプス入力（S1 および S2）を示す概略図を提示します。S1経路は LTP を誘導するために使用され、S2経路はコントロールとして機能しました。これらは、赤色のトレースで示されるLTP誘導直前と、青色のトレースで示されるLTP誘導1時間後に記録されたfEPSPのサンプル波形です。こちらが完全に健全なスライスのfEPSPであり、もう一方は、スライスが完全に健全ではなく高い興奮性を示している場合のfEPSPです。多シナプス応答が観察され、fEPSPの傾き（slope）の増強が減少しています。当研究室において2005年、2010年、および2011年に記録された、単一の高頻度刺激列によるLTP誘導後のF-E-P-S-Pスロープの時間経過の比較を以下に示します。塗りつぶされた円で示される最初の実験は2005年に記録されたものです。塗りつぶされた正方形で示されるその後の記録は、改善された解剖手順の恩恵を受けています。現在の結果は、白抜き円で示される電極の標準化に加え、界面の酸素供給と温度制御の最適化によるものです。ここでは、青色の曲線で示されるように、記録室下のウォーターバスにおける酸素流量を0.15から0.25 L/minに増加させると、F-E-P-S-Pの勾配が20%減少することがわかります。一方、温度を28から29 °Cに上げると、緑色の曲線で示されるように、F-E-P-S-Pの勾配が50%以上増加します。本手順を実施する際は、すべてのステップが極めて重要であり、プロトコルの誤りが結果に影響を及ぼす可能性があることに留意してください。このビデオを視聴することで、急性海馬スライスを用いた記録において、非常に安定した長期増強を得る方法について十分な理解を得ることができます。

improved-preparation-preservation-hippocampal-mouse-slices-for-very

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

この記事では、ラットと脳の老化とアルツハイマー病などの加齢に伴う神経変性疾患、関連付けられているシナプスの変化の研究のためのトランスジェニックマウスから海馬切片を調製するための手順の概要を説明します。...

老化とアミロイド病理の間にシナプス変化の研究のためのラットおよびトランスジェニックマウスからの急性海馬スライスの準備

このビデオ記事は、げっ歯類の急性海馬切片を使用したCA1錐体ニューロンのシナプスタグ付け、捕捉、交差タグ付けなど、長期的な可塑性とそれに関連するプロセスを研究するための実験的手順について説明しています。...

げっ歯類からの急性海馬スライスを用いて、シナプスタグ付け/キャプチャとクロス捕獲調査

このプロトコルは、最適化されたNの実装方法を示します-メチル-D-glucamine (NMDG) 保護回復法脳スライス標本。1 つのメディアの定式化は、確実にあらゆる年齢層の様々...

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

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少量循環、血流 - と水没型チャンバー システムで管理急性海馬スライスにおけるシナプス可塑性を記録

我々は、長手方向海馬脳スライスの記録と刺激電極を使用し、生体内の背中海馬における縦方向に位置決めされた記録および刺激電極を用いて、細胞外のポストシナプスの可能性を呼び起こし、実証した。縦方向の中間ラメラCA1に沿った長期シナプス可塑性。...

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これは、経心面灌流と氷冷NMDG-aCSFによるスライス切断を利用して組織への低酸素損傷を軽減する、成体および老化マウス海馬からの急性スライス調製のためのプロトコルである。結果のスライスは、長時間にわたって健康を維持し、長期的なパッチクランプやフィールド記録に適しています。...

成虫マウスおよび老化マウスからの海馬スライスにおける低酸素症の最小化

このプロトコルは、自発的な鋭波波リップル活性を示すマウスからの水平海馬内皮質(HEC)スライスの調製を記述する。スライスは、簡略化されたインターフェース保持室でインキュベートされ、記録は、組織の酸素化とネットワークレベルの活動の自発的な出現を促進するために、流れの速い人工脳脊髄液と水没条件下で行われます。...

急性マウス脳スライスによる、海馬ネットワーク活動の調査

本稿は、マウスの水平海馬脳スライスを得るための体系的なプロトコルを説明することを目的としている。この方法論の目的は、穿角経路や苔むした繊維路などの海馬繊維経路の完全性を維持し、デンテート回関連の神経学的プロセスを評価することである。...

マウス脳の水平海馬スライス

マウスの下-中間海馬からの急性スライスを調製するためのプロトコルを提示する。この横断的な準備を、記録の質と記録されたニューロンの形態学的特徴の保存の観点からコロナスライスと比較する。...

成体マウスのデンテート・ジラスにおける全細胞記録と神経再建のための、逆海馬からの急性スライスの作製

学ぶ マウス海馬スライスの準備と保存法により、8時間以上の安定した長期増強（LTP）記録を95%の成功率で実現する方法。シナプス可塑性の機構解明に有用な電気生理学的手法です。

長期増強の非常に安定しており、再現性録音のための改良された準備と海馬マウススライスの保全

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