長期増強の非常に安定しており、再現性録音のための改良された準備と海馬マウススライスの保全

本論文では、準備し、維持するために、完全な方法論を提示

この手順の全体的な目標は、急性海馬スライスで非常に安定して再現性のある長期増強を記録できるようにすることです。これは、最初にマウスの脳を抽出し、顕微鏡下で冷たいA CSFで海馬を解剖することによって達成されます。2番目のステップは、ティッシュチョッパーで横方向の海馬スライスをカットすることです。

次に、スライスを界面記録チャンバーに入れ、酸素化された人工脳脊髄液で灌流します。最後のステップは、電極を配置し、海馬のCA1つの領域でシナプス活動を記録することです。最終的に、高周波刺激のプロトコルを使用して、非常に安定した長期増強の誘導を示します。

この方法により、シナプス可塑性の根底にあるメカニズムについての洞察を得ることができます。また、神経変性や神経系の動物モデルなどの他のシステムや、免疫疾患にも適用できます。一般的に、この方法に不慣れな個人は、すべての操作に優れたスキルと多くの練習が必要なため、苦労します。

この手順は、灌流回路を蒸留水で最低20分間すすぐことから始めます。次に、暖房システムをオンにします。回路内でカルボゲンバブリングを開始します。

カルボゲンは、エアディフューザーを介して記録チャンバーの下のウォーターバスに供給されます。次に、流量計でウォーターバス内の流量を制御します その後、回路を排水し、ろ過されたA CSFタッピングで満たして気泡を取り除きます。次に、スライスを保持チャンバーに支えるリングを配置します。

回路からすべての気泡を慎重に取り除きます。次に、吸引針のネジで記録チャンバー内のCSFレベルを調整し、入口ポンプの速度を毎分1ミリリットルに調整し、出口ポンプを毎分5ミリリットルに調整します。解剖の前に、すべての手術器具を準備します。

犠牲にされたマウスの脳を取り除くこと。人差し指と親指で頭を持ち、ギロチンの端から始めて、頭のてっぺんの中央に沿って解剖はさみで切開を行い、前頭骨まで丸く切ります。次に、頭の両側の皮膚筋を切開して、頭蓋骨プレートを完全に露出させます。

次に、頭のコドル側の筋肉を取り除きます。続いて、側頭板に沿って両側の側頭筋を切断します。次に、正面プレートの中央を横方向に切ります。

次に、2つのプレートの間の後頭骨に少し切り込みを入れます。両側の後頭板のコドル基部で切ります。次に、スプリングハサミで矢状縫合糸に沿って切ります。

最後に、鉗子で半分を互いに広げて頭蓋骨を取り除きます。次に、メスを小脳の直前と嗅球の直後に切断し、抽出した脳を横方向に冷たいA CSFで解剖皿に移します。脳が解剖皿に現れたら、双眼手術用顕微鏡で中央に挿入されたメスで2つの半球を互いに切断し、1つの半球の構造を慎重に広げて側脳室を明らかにします。

片方のヘラを前頭皮質に、もう片方のヘラを頭蓋に置いて、脳幹と頭蓋を切除します。ヘラで海馬に触れないように、また組織切片の際に海馬を伸ばさないように注意してください。その後、円蓋を切断します。

次に、脳室にへらを挿入して、海馬を皮質からそっと押し出します。海馬を摘出したら、広口プラスチック製のパスチャーピペットで余分な皮質組織と残った血管を取り除きます。海馬をスプーンで、そのアルビ表面を上向きにしてチョッパーのプラットフォームに移します。

標準的なプラスチック製の牧草地用ピペットでスプーンから余分な水分を取り除きます。その後、スプーンを垂直に傾け、チョッパーの濾紙にほぼ触れます。濾紙にすばやく触れて海馬を落とします。

次に、スプーンを引き出します。次に、海馬の向きを合わせてスライスします。チョッパーで横方向に400ミクロンまで。

できるだけ早く手順を実行してください。続いて、海馬のスライスが入った濾紙をはがし、金属製のシリンダーに巻き付けてスライスを少し広げます。次に、標準的なプラスチック製のパストラルピペットを使用してCSFのスプレーでスライスを解放し、冷たく満たされたペトリ皿にそれらを集めます。

CSFです。選択したスライスを、標準的なプラスチック製パストピペットで記録チャンバーに移します。スライスが摂氏28度の録音インターフェースチャンバー内の解剖外傷から回復するのを待ちます。

スライスのシンクで A CSF レベルがスライスレベルまで下がった場合は、再度 A CSF レベルを上げてスライスをフロート状態にします。その後、スライスをCAの1つの領域での電極の位置決めを容易にする位置に向けます。A CSF レベルがインターフェイスにあるときに、その CSF レベルを下げるのをやめます。

スライスの周りのメディアのメニスカスは、A CSFの十分なレベルを示しています。メッシュはメディアで飽和している必要がありますが、完全に水没してはいけません。次に、穴あき蓋の上にチャンバーを濾紙で覆い続けます。

スライスを摂氏28度で少なくとも1時間30分休ませてから録音します。これは、2つの独立したシナプス入力を1つ、Sを2つとして同じニューロン集団に示すスケッチです。S 1つの経路はLTPを誘導するために使用され、S 2つの経路は対照として作用しました。

これらは、赤色のトレースで示されているようにLTP誘導の直前に記録されたサンプルF-E-P-S-Pトレースと、青色のトレースで示されているLDP誘導の1時間後に記録されたものです。これは完全に健康なスライスからのF EPSPであり、スライスが完全に健康でない場合に高レベルの興奮性を示すスライスからのF EPSPです。ポリシナプス応答が観察され、F-E-P-S-Pの傾き増強が減少します。

これは、2005年、2010年、2011年に当研究室で記録された1列の高周波刺激によって誘発されたLTP後のF-E-P-S-Pスロープの時間経過の比較です。最初の実験は2005年に記録され、塗りつぶされた円で示されました。塗りつぶされた正方形で示されたその後の記録は、改善された解剖手順の恩恵を受けました。

現在の結果は、界面の酸素化と温度制御の最適化、および白丸で示されている電極の標準化から生じています。ここでは、青色の曲線で示されているように、記録チャンバーの下のウォーターバス内の酸素流量を毎分0.15リットルから0.25リットルに増加させると、F-E-P-S-Pの傾きが20%減少し、温度が摂氏28度から29度に上昇することを示しています。示されているように、緑色の曲線はF-E-P-S-Pの傾きを50%以上増加させます。

この手順を試みる際には、すべてのステップが重要であり、プロトコルのエラーが異なる結果につながる可能性があることを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、非常に安定した長期増強を得る方法についてよく理解することができます。急性海馬スライスでの記録。