文化における分化したヒト神経前駆細胞からの神経細胞のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

本実験の全体的な目的は、ヒト神経細胞培養モデルを構築し、神経細胞マーカーを特定し、遺伝子発現解析のために純度の高い神経細胞集団を単離することである。まず、ヒト神経前駆細胞を増殖させることで、前駆細胞を継続的に供給できるようにする。次に、接着因子でコーティングしたディッシュ内で、分化サプリメントおよび神経栄養成長因子を添加して、神経前駆細胞を培養する。

次に、分化させた神経前駆細胞の運命を決定するために、神経マーカーの免疫蛍光染色を行います。最後に、ニューロン特異的な遺伝子発現解析を容易にするため、PEN膜スライド上で培養したニューロンのレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを実施します。その結果、分化した神経前駆細胞が主にニューロンの性質を持つことが示されました。

免疫蛍光染色およびニューロンの回収に基づいた手法です。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）を用いることで、ヒト神経前駆細胞を増殖させ、ニューロンが豊富な培養系へと分化させることが可能です。これらの培養系にはグリア細胞が含まれているため、in vitro 研究においては、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを用いて純粋なニューロン集団を単離して使用することができます。

これらの手順を実演するのは、顕微鏡コアファシリティのシニアリサーチアソシエイトであるRon Bouchardです。まず、胎児脳から単離されたヒト神経前駆細胞の凍結ストックを、速やかに37 °Cまで加温して復元させ、10 ng/mLのEGFおよびFGFを添加し、あらかじめ加温した15 mLの神経基底培地を含むT 75フラスコに分注します。細胞を3日間培養した後、ニューロスフィアを15 mLチューブに移し、1000 RPMで5分間遠心分離してペレット化します。遠心分離後、上清を除去し、約100 µLの培地を残して、細胞ペレットをエペン دورーフチューブに移します。

100 µLの細胞ペレットがあれば、2本のT 75フラスコに分注するのに十分です。それ以下の量である場合は、神経前駆細胞が十分に増殖しないため、フラスコの数を減らしてください。希釈して分注する場合は、200 µLのチップをチューブの底に当てたまま50回ピペッティングし、ニューロスフィアを完全に分散させて単一細胞懸濁液にしてください。

顕微鏡を用いて視覚的に経過を確認し、ニューロスフィアが解離していることを確かめます。次に、細胞懸濁液を等量に分け、2本のT 75フラスコに分注します。1本は継続的な拡大培養用、もう1本は分化誘導用に使用します。

その後、フラスコをインキュベートします。拡大用にマークしたフラスコ内の神経前駆細胞の培地を、遠心分離により交換します。まず古い培地を除去し、新しい培地を添加します。

ニューロスフィアが元のサイズである 300 to 500 microns に達するまで、4〜5日ごとに培地を交換します。神経前駆細胞をニューロンに富んだ培養へと分化させるには、24ウェルプレートの各ウェルにカバーガラスを1枚ずつ配置し、100 micrograms per milliliter のポリLリジンを 500 microliters ずつ加えてコーティングします。プレートを室温で 30 minutes インキュベートした後、ポリLリジン溶液を吸引除去します。

プレートを脱イオン滅菌水で洗浄し、再度吸引します。次に、プレートのウェルに5 µg/mLのマウスラミニンを500 µLずつコーティングし、30分間インキュベートします。インキュベート後、ウェルをPBSで洗浄して再度吸引し、組織培養フード内で乾燥させます。細胞を播種して4日後、分化用としてラベル付けしたフラスコから小さなニューロスフィアをコーティング済みの24ウェルプレートに移します。

1ウェルあたり約500個の密度でニューロスフィアを添加します。6時間のインキュベーション後、ニューロスフィアがディッシュに接着したことを確認し、増殖培地を除去して分化培地を添加します。分化培地は、neuro basal medium、B 27 supplement、N-G-F-B-D-N-F-D-B-C、およびレチノイン酸で構成されます。プレートをインキュベーターに戻します。神経前駆細胞を神経分化培地で2週間培養すると、ニューロンが豊富な培養物が得られます。

ニューロンをPBSで1回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで30分間固定します。固定後、細胞をPBSで3回洗浄します。次に、透過化バッファーを用いて室温で60分間インキュベートし、免疫染色の準備を行います。

次に、PBSで希釈した3% BSA溶液中のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体をウェルに加えます。各ウェルに異なる抗体ペアを加え、シェーカーを用いて4°Cで一晩インキュベートします。翌朝、カバースリップをPBSで3回洗浄し、その後、抗ウサギ $\text{P SI}_3$ および抗 $\text{US fitzy}$ 二次抗体を用いて、室温・暗所にて90分間インキュベートします。

カバースリップをPBSで3回洗浄します。次に、ガラススライド上に封入剤を10 µL滴下します。培養皿からカバースリップを取り出し、封入剤の上に裏返して載せます。

過剰な封入剤を優しく拭き取り、エッジをマニキュアで密封します。マイクロダイセクションに向けて細胞を準備するには、まずPENメンブレン上で神経前駆細胞を分化させ、ニューロンに富む培養液を作成します。スライドにはpoly L lysineとlamininがコーティングされています。

以降のすべての工程は、RNAフリー条件下で実施してください。次に、細胞を可視化するために、Histo-Gene染色を用いて培養物を染色します。Histo-Gene染色は核を紫色に、細胞質を淡いピンク色に染色するため、形態学的特徴に基づいてニューロンとグリア細胞を容易に区別できます。スライドを75% ethanolおよび脱イオン滅菌水に30秒間浸してください。

次に、スライドをキムワイプの上に置きます。histo geneを200 µL加え、20秒間待ちます。続いて、脱イオン滅菌水、75% ethanol、95% ethanol、100% ethanolの順に、それぞれ30秒間ずつスライドを浸します。

その後、キシレンに5分間浸し、キムワイプの上で5分間乾燥させます。次に、通常のスライドガラスの上にPENメンブレンスライドを重ね、Veritasレーザーキャプチャーマイクロダイセクションシステム（LCM）にセットし、ソフトウェアを起動します。ロードマップ画像を撮影し、アストロサイトを含まない純粋なニューロン集団の領域を確認します。

描画ツールを使用して、これらのニューロンをマークします。次に、コンピュータ制御による精密な自動操作を用いて、2段階のプロセスでこれらの領域のレーザーキャプチャーを行います。まず、膜をキャップに付着させるため、レーザー出力を70 milliwatts、パルス幅を2,500 microsecondsに設定し、複数のスポットにIRを照射します。

次に、10 millivoltsの低レベル設定のUVカッティングツールを用いて、標識領域を切り出します。これらの工程を組み合わせることで、標識領域を選択的にLCMマクロキャップに回収できます。100個以上のニューロンが回収されたら、顕微鏡を用いてキャップから膜を取り除き、チューブに入れます。

P OPU RNA分離キットを用いてLCMサンプルから全RNAを抽出し、DNase処理を行います。次に、ribo amp RNA増幅キットを用い、キットの指示に従って抽出したRNAを増幅させます。最後に、TAQMAnプローブを用いたリアルタイムRT-PCR解析を行い、ヒト神経フィラメント重鎖を検出します。

4日齢のニューロスフィアを、ポリL-リジンおよびラミニンでコーティングした表面を用い、分化特異的な成長因子と組み合わせて分化させることで、ニューロンに富んだ培養物が得られます。2週間後、低密度領域において、ここに示されるようなニューロンに富んだ培養物が得られます。細胞は、ここに示されるようなアストロサイトへと分化することがあります。

アストロサイトへの分化は、ニューロン分化に使用するものとは別に、成長因子CNTFを用いることで誘導することも可能です。ニューロン分化は、特異的なニューロンマーカーであるNeuNおよびシナプシン、アセチルコリンエステラーゼおよびシナプトフィジン、さらにBDNFおよびGAP 43に対する抗体を用いて同定できます。陽性染色は、分化した細胞が一次ニューロンの特性を有している証拠となります。さらに、アストロサイトはStat3およびGFAPの免疫染色陽性によって同定できます。

ニューロンのレーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、ポリLリシンおよびラミニンでコーティングされたPENメンブレン上で分化させた細胞に対して行われます。ここに示しているのは、組織染色を施したニューロンです。細胞を可視化した後、レーザーを用いて目的の細胞を囲むようにトレースします。これによりPENメンブレンが融解し、上部に配置したキャプチャーキャップに付着します。最終的に、多数の細胞をトレースして同一のキャップに回収し、DNAまたはRNA解析に供することが可能です。

このビデオを視聴することで、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを用いてニューロンを単離する方法について十分に理解できるはずです。