Name: 文化における分化したヒト神経前駆細胞からの神経細胞のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: 学ぶレーザーキャプチャーマイクロダイセクションによるヒト神経前駆細胞からの純粋な神経細胞の単離法。神経栄養因子を用いた分化培養と免疫蛍光染色を組み合わせ、遺伝子発現解析のための神経細胞集団を正確に取得する技術を解説します。

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1。人間のNPCの拡大（ 図1） <ol><li> 、増殖サプリメントを含有する神経基礎培地でニューロスフェア（ 図1A）のように、T-75フラスコ中の懸濁液中の胎児の脳（ロンザ、ウォーカー、MD、USA）と文化からそれらを人間のNPCの凍結ストックを復活させるEGF（10 ng / mL）をし、 FGF（10 ng / mL）を。 </li><li>培養3日後、5分間、500rpmで15mlチューブと遠心分離機に神経球を移す。 </li><li>細胞ペレットの上に〜100μlの培地を残して上清を捨て、エッペンドルフチュー​​ブに移す。 100μlの細胞ペレットを2 T-75フラスコに分割するのに十分である。神経前駆細胞が薄い分割した場合に増殖することができないように少なく、フラスコの数を減らした場合。 </li><li>チューブの底部に200μlの先端を保持しながら200μlの先端50Xでペレットを粉砕する。二つの部分に均等に細胞懸濁液を分割し、2のT-75フラスコ（1-2スプリット）、継続のための1に追加します差別化のための拡張および他の。 </li><li>ニューロスフェアは、300〜500ミクロンの元のサイズになるまで4〜5日毎に培地を変更することで、拡張のための神経前駆細胞の培養（第一フラスコ）を継続。 （500 rpmで、5分間）遠心分離により培地を変更し、古い培地を廃棄し、新しいメディアを追加します。 </li></ol> 2。ニューロンに富んだ文化に人間のNPCの分化（ 図2） <ol><li>神経豊かな文化への神経前駆細胞の分化のために、各ウェルに500μLを添加することにより、ポリ-L-リジン100μgの/ mlの24ウェルプレートとコートの各ウェルに、単一のカバーガラスを配置します。室温で30分間料理をインキュベートする。 </li><li>ポリ-L-リジンソリューションを吸引し、滅菌水でプレートをすすぐ。 </li><li>次に、5μg/ mlのマウスラミニン500μlでコートプレートのウェルを、30分間インキュベートする。インキュベーション後、PBSでウェルを洗浄する。 </li><li> 4日後にsplitti細胞（ステップ1.4）にNGの24ウェルプレートのウェルあたり〜500ニューロスフェアの密度でコーティングされた皿に「差別化のため」とラベル付けされたフラスコの小さなニューロスフェアを転送します。 </li><li> 6時間後、ニューロスフェアは、皿に付着した場合、増殖培地を除去し、神経基礎培地からなる分化培地を追加し、B27サプリメント、NGF（20 ng / mL）を、BDNF（10 ng / mL）を、DBC（100mm）に、レチノイン酸（2μM）。 </li></ol> 3。差別化されたNPCの免疫蛍光染色（ 図3） <ol><li> 2週間の神経分化培地中で神経前駆細胞の培養に続いて、神経細胞に富む培養物が得られる。 PBSで1回ニューロンを洗い流してから30分間、4％パラホルムアルデヒドで固定します。固定したら、PBSで細胞を3回すすいでください。 </li><li> 60分間室温で透過化緩衝液（5％BSAおよびPBS中の0.2％トリトンX-100）で細胞をインキュベートする。 </li><li> 4℃のIでの料理のO / Nインキュベート;アセチルコリンエステラーゼ（1:500）とシナプトフィジン（1:250）; BDNF（1のNeuN（1:250）およびシナプシン（1:250）：PBS中の3％BSA中のポリクローナルおよびモノクローナル抗体の組み合せでシェーカーNA ：500）およびGAP43（1:250）; STAT3（1:500）およびGFAP（1:1,000）。 </li><li>カバーガラスをPBSで3回洗浄し、次いで、90分間、暗所でRTにて抗ウサギCy3および抗マウスFITC二次抗体でそれらをインキュベートする。インキュベーション後、PBSでカバーグラスを3回洗浄する。 </li><li>ピンセットで培養皿からカバーグラスを取り出し、封入剤に逆さに置き、スライドガラス上に封入剤を10μlを置きます。やさしく、余分な封入剤を乾いた布で拭き取ってくださいとマニキュアでエッジを封印。 </li><li>蛍光顕微鏡での免疫染色されたニューロンを調査します。 </li></ol> 4。ニューロンのレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ 図4） <ol><li> PEN膜スライド上に神経細胞に富んだ文化にNPCのを差別図2に記載の手順に従って、ポリ-L-リジンおよびマウスラミニンで被覆sの。 </li><li> RNA分解酵素を含まない条件下で、以降のすべてのステップを実行します。 </li><li>細胞を可視化するためにHistoGeneステイン（アルクトゥルス）を使用して、文化を染色。 </li><li>ベリタスLCMシステムとスライド全体のロードマップイメージを使用して、アストロサイトを欠い純粋なニューロン集団の領域を見つける。描画ツールを使用して神経細胞をマーク。 </li><li> 2段階のプロセスでコンピュータ制御の精度と自動化を使用して、これらの領域のレーザーキャプチャーを実行します。まず、IR（赤外線）は、膜がキャップに付着し得るために70 Mwおよび2500秒のパルスのレーザーパワー設定で複数のスポットで焼成する。次に、マークされた領域は10 mVでの低レベル設定でUV切削工具を用いて切除される。 </li><li>これらのプロセスの組み合わせを選択的CapSure LCMマクロのキャップの上にペン膜からマークされた領域をキャプチャします。キャップが持ち上げられると、Nとメンブレンeuronsがキャップに付着している。 </li><li>のPicoPure RNA単離キット（アルクトゥルス）を使用してLCMサンプルから全RNAを分離し、DNA分解酵素で処理する。 </li><li>キットの指示に従ってRiboAMP RNA増幅キットを使用して単離されたRNAを増幅する。 </li><li>人間の神経フィラメント重鎖（hNFHc）を検出するためのTaqManプローブを用いたリアルタイムRT-PCR解析を行う。 </li></ol>略語： AD、アルツハイマー病、BDNF、脳由来神経栄養因子、CREB、サイクリックAMP応答エレメント結合タンパク質; DBC、ジブチリル環状AMP、EGF、上皮成長因子、FGF、線維芽細胞増殖因子、GFAP、グリア線維性酸性タンパク質、LCM、レーザマイクロダイセクションをキャプチャ、NGF、神経成長因子、NPC、神経前駆細胞、ペン、ポリエチレンナフタレート。

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<li>Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells: an overview.</a> Circ. Res. 92, 598-608 (2003).</li>
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<li>Dworkin, S., Mantamadiotis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+CREB+signalling+in+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Ther.+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting CREB signalling in neurogenesis.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).</li>
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<li>Pugazhenthi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Varicella-zoster+virus+infection+of+differentiated+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells.</a> J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).</li>
<li>Kamme, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1%3A+demonstration+and+validation+of+cellular+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity.</a> J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).</li>
</ol>

宣言するためには、特別の利害関係。

我々は、この研究において自己複製ヒト神経前駆細胞の分化による神経細胞に富む細胞培養モデルおよびレーザーキャプチャーマイクロダイセクションによってニューロンの純粋な集団を単離する方法を記載している。我々は、NGF、BDNF、DBCとのNPCの神経分化のためのレチノイン酸の組み合わせを使用している。 DBCはCREB、神経発生12を強化する転写因子を活性化するために使用される。レチノイン酸は、細胞周期の終了を誘導し、グリア人口13減少します。この研究に記載されている方法は、我々の以前の報告14以上の修正が組み込まれています。我々は先に、単一の細胞懸濁液にニューロスフェアを粉砕する、その後、コーティングされた皿で、それを播種する工程を使用していた。これは、低密度（ 図2E）の分野での非効率的な神経分化につながることができます。我々は今、差異間の接触を保証するために、4日齢の小さなロスフェア（ 図1B）を播種する手順を紹介していますティンニューロン（ 図1C）。</stron...

生涯神経新生は、側脳室の脳室下帯にと大人の哺乳類の脳1の歯状回の顆粒下の層に発生することが知られている。神経前駆細胞（NPCの）は、これらの地域から発信は、ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト2に分化することができる多能性細胞である。 NPCがあるため、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、脳卒中およびアルツハイマー病（AD）3を含む種々の神経変性障害を有する患者に移植されるべき潜在能力の関心を生成した。 NPCを用いた研究は、一般的に、この移植角度に焦点を当てているが、神経変性の機構を決定するための細胞培養モデルとしてNPC由来のニューロンの電位が十分に利用されていない。以前の研究は、一般的にそうでないように、各実験のために単離する必要が齧歯類の脳組織から単離した有糸分裂後ニューロンを使用している自己再生。 SH-SY5Y、およびSK-N-MC細胞を含むヒト神経芽腫細胞株を拡大することができるが、それらは一次ニューロンの特性を持っていない。彼らは複数の継代のために拡張することができ、一次ニューロン4,5の特性を有する細胞集団を生成するために分化させることができるので、人間のNPCは、一方、両方の利点を提供する。現在の研究では、ヒト胎児脳から単離されたNPCから商業的に入手可能な一貫性のあるニューロンの豊富な集団を得るための新たな分化プロトコールを記載する。これらの培養は、グリア細胞の小さな割合を含んでいないため、我々は、分子特性のために神経細胞の純粋な集団を単離するための追加のメソッドを必要としています。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）は、組織切片からの細胞の均質な集団を選択的遺伝子発現解析のために6捕捉することのできる新規な技術である。脳は、ニューロン、グリアおよび他の細胞TYからなる異質な組織であるPES。 LCMは、ニューロン特異的遺伝子発現を決定するために使用されている7-10を解析する。我々は以前に具体的に海馬ニューロン11において減少サイクリックAMP応答エレメント結合タンパク質の発現（CREB）およびBDNFを示すためにAD（のTg2576）マウス脳切片から海馬ニューロンのLCMを行った。本研究では、PEN膜スライド上で培養した神経細胞を単離するための、人間のNPCの拡大、神経分化、神経細胞のマーカーの免疫蛍光染色およびLCMのための手順について説明します。

<table><tbody><tr><td>ニューロプロデニター細胞(NPC) </td><td>ロンザ</td><td>PT-2599</td><td></td></tr><tr><td>ニューロカルト NS-A ヒト基礎培地</td><td>幹細胞技術</td><td>5750</td><td></td></tr><tr><td>ニューロカルト NS-A 増殖サプリメント</td><td>幹細胞技術</td><td>5753</td><td></td></tr><tr><td>ニューロカルト NS-A 分化サプリメント</td><td>幹細胞技術</td><td>5754</td><td></td></tr><tr><td>B-27 サプリメント (50x) </td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>ヒト上皮成長因子</td><td>幹細胞技術</td><td>2633</td><td></td></tr><tr><td>線維芽細胞成長因子 </td><td>Σ</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>脳由来神経栄養因子 </td><td>細胞シグナル伝達</td><td>3897S</td><td></td></tr><tr><td>神経成長因子 </td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>ジブチリル環状増幅</td><td>Σ</td><td>D-0627</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine </td><td>Sigma</td><td>P-5899</td><td></td></tr><tr><td>マウスラミニン </td><td></td><td>Sigma L-2020</td><td></td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>Sigma</td><td>R-2625</td><td></td></tr><tr><td>STAT3抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9132</td><td></td></tr><tr><td>GFAP抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>3670</td><td></td></tr><tr><td>GAP43抗体</td><td>形質導入研究室</td><td>612262</td><td></td></tr><tr><td>BDNF抗体</td><td>ミリポア</td><td>AB1534SP</td><td></td></tr><tr><td>アセチルコリンエステラーゼ抗体 </td><td>Santz cruz</td><td>Sc-11409</td><td></td></tr><tr><td>シナプトフィジン抗体</td><td>Abcam</td><td>ab18008-50</td><td></td></tr><tr><td>NeuN抗体</td><td>Chemicon</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Synapsin抗体</td><td>Novus</td><td>NB300-104</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスFITC</td><td>Jackson Immuno</td><td>115-095-146</td><td></td></tr><tr><td></td><td>研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti Rabbit Cy3</td><td>Jackson Immuno</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td></td><td>研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1653</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Acros</td><td>21568-2500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehye </td><td>Fisher</td><td>4042</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ(ビッグサークルカバースリップ)</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-102</td><td></td></tr><tr><td>封入剤(Prolong Gold)</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Pen membrane</td><td>Applied biosystems</td><td>LCM0521</td><td></td></tr><tr><td>Histogene LCM 凍結切片染色キット</td><td>Applied biosystems</td><td>KIT0401</td><td></td></tr><tr><td>RiboAmp RNA Amplification kit</td><td>Applied biosystems</td><td>KIT0201</td><td></td></tr><tr><td>Picopure RNA Isolation kit</td><td>Applied biosystems</td><td>KIT0202</td><td></td></tr><tr><td>CapsureMacro LCM caps</td><td>Applied biosystems</td><td>LCM0211</td><td></td></tr></tbody></table>

文化における分化したヒト神経前駆細胞からの神経細胞のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

ヒト胎児脳から単離された神経前駆細胞（NPCの）は、上皮成長因子（EGF）、細胞の豊富な供給を提供するために、線維芽細胞増殖因子（FGF）の存在下で増殖条件下で増殖させた。のNPCは、ニューロンを得るために、ポリ-L-リジンおよびマウスラミニンでコーティングしたディッシュ上で、神経成長因子（NGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）の新しい組み合わせの存在下で分化ジブチリルcAMPの（DBC）およびレチノイン酸た豊富な文化。 NPCはまた、ニューロトロフィンの非存在下、DBC及びレチノイン酸およびアストロサイトに富む培養物を得た毛様体神経栄養因子（CNTF）の存在下で分化させた。差別化されたNPCはNeuNを、シナプシン、アセチルコリンエステラーゼ、シナプトフィジンとGAP43を含む神経細胞のマーカーのパネルのための免疫蛍光染色によって特徴付けられた。グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）及びSTAT3、星状細胞マーカーは、分化したNPCの10〜15％で検出された。促進するために、細胞型特異的分子特性は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、ポリエチレンナフタレート（PEN）膜スライド上で培養したニューロンを単離するために実施した。この研究に記載された方法は、神経変性の分子機構の理解を進めるための貴重なツールを提供しています。

NPCは拡大します（ 図1） ニューロスフェアは、粉砕により単一細胞懸濁液に分解されるときに、ピペットチップは、懸濁液を上下にピペットである程度の抵抗があるように、チューブの底に触れる必要がある。トリチュレーションの回数は、個人や顕微鏡下で得られた細胞懸濁液を検査することによって、試行錯誤によって決定される必要がある間で変化する。 NPCに近い接触すると増殖が速い速度であろうので、細胞懸濁液の十分な密度を提供することが重要である。 NPCには成長しない場合、細胞密度はフラスコの数を減らすことにより増加されるべきである。我々は、最大10から15継代のニューロスフェアを拡張することができました。従って、ヒトのNPCの豊富な供給は、ヒト胎児組織の使用を低減する、生成することができる。 NPCのニューロンの継続的な供給のためには、3〜4継代し、その後のために、最初にそれらを展開することが望ましい、のNPCの半分は、ニューロスフェアのように展開することができ、他の半分は、進行中の実験のために分化させることができる。あるいは、NPCはまた、複数の通路のために展開株...

人間の神経前駆細胞（NPCの）が増殖している条件の下で拡大した。のNPCは、ニューロトロフィンの組み合わせの存在下での神経細胞が豊富な培養物に分化させた。ニューロンのマーカーは、免疫蛍光染色により検出した。ニューロンの純粋な集団を単離するために、PENのNPCは、メンブレンスライドに分化し、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを行った。

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

本実験の全体的な目的は、ヒト神経細胞培養モデルを構築し、神経細胞マーカーを特定し、遺伝子発現解析のために純度の高い神経細胞集団を単離することである。まず、ヒト神経前駆細胞を増殖させることで、前駆細胞を継続的に供給できるようにする。次に、接着因子でコーティングしたディッシュ内で、分化サプリメントおよび神経栄養成長因子を添加して、神経前駆細胞を培養する。次に、分化させた神経前駆細胞の運命を決定するために、神経マーカーの免疫蛍光染色を行います。最後に、ニューロン特異的な遺伝子発現解析を容易にするため、PEN膜スライド上で培養したニューロンのレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを実施します。その結果、分化した神経前駆細胞が主にニューロンの性質を持つことが示されました。免疫蛍光染色およびニューロンの回収に基づいた手法です。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）を用いることで、ヒト神経前駆細胞を増殖させ、ニューロンが豊富な培養系へと分化させることが可能です。これらの培養系にはグリア細胞が含まれているため、in vitro 研究においては、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを用いて純粋なニューロン集団を単離して使用することができます。これらの手順を実演するのは、顕微鏡コアファシリティのシニアリサーチアソシエイトであるRon Bouchardです。まず、胎児脳から単離されたヒト神経前駆細胞の凍結ストックを、速やかに37 °Cまで加温して復元させ、10 ng/mLのEGFおよびFGFを添加し、あらかじめ加温した15 mLの神経基底培地を含むT 75フラスコに分注します。細胞を3日間培養した後、ニューロスフィアを15 mLチューブに移し、1000 RPMで5分間遠心分離してペレット化します。遠心分離後、上清を除去し、約100 µLの培地を残して、細胞ペレットをエペン دورーフチューブに移します。100 µLの細胞ペレットがあれば、2本のT 75フラスコに分注するのに十分です。それ以下の量である場合は、神経前駆細胞が十分に増殖しないため、フラスコの数を減らしてください。希釈して分注する場合は、200 µLのチップをチューブの底に当てたまま50回ピペッティングし、ニューロスフィアを完全に分散させて単一細胞懸濁液にしてください。顕微鏡を用いて視覚的に経過を確認し、ニューロスフィアが解離していることを確かめます。次に、細胞懸濁液を等量に分け、2本のT 75フラスコに分注します。1本は継続的な拡大培養用、もう1本は分化誘導用に使用します。その後、フラスコをインキュベートします。拡大用にマークしたフラスコ内の神経前駆細胞の培地を、遠心分離により交換します。まず古い培地を除去し、新しい培地を添加します。ニューロスフィアが元のサイズである 300 to 500 microns に達するまで、4〜5日ごとに培地を交換します。神経前駆細胞をニューロンに富んだ培養へと分化させるには、24ウェルプレートの各ウェルにカバーガラスを1枚ずつ配置し、100 micrograms per milliliter のポリLリジンを 500 microliters ずつ加えてコーティングします。プレートを室温で 30 minutes インキュベートした後、ポリLリジン溶液を吸引除去します。プレートを脱イオン滅菌水で洗浄し、再度吸引します。次に、プレートのウェルに5 µg/mLのマウスラミニンを500 µLずつコーティングし、30分間インキュベートします。インキュベート後、ウェルをPBSで洗浄して再度吸引し、組織培養フード内で乾燥させます。細胞を播種して4日後、分化用としてラベル付けしたフラスコから小さなニューロスフィアをコーティング済みの24ウェルプレートに移します。1ウェルあたり約500個の密度でニューロスフィアを添加します。6時間のインキュベーション後、ニューロスフィアがディッシュに接着したことを確認し、増殖培地を除去して分化培地を添加します。分化培地は、neuro basal medium、B 27 supplement、N-G-F-B-D-N-F-D-B-C、およびレチノイン酸で構成されます。プレートをインキュベーターに戻します。神経前駆細胞を神経分化培地で2週間培養すると、ニューロンが豊富な培養物が得られます。ニューロンをPBSで1回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで30分間固定します。固定後、細胞をPBSで3回洗浄します。次に、透過化バッファーを用いて室温で60分間インキュベートし、免疫染色の準備を行います。次に、PBSで希釈した3% BSA溶液中のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体をウェルに加えます。各ウェルに異なる抗体ペアを加え、シェーカーを用いて4°Cで一晩インキュベートします。翌朝、カバースリップをPBSで3回洗浄し、その後、抗ウサギ $\text{P SI}_3$ および抗 $\text{US fitzy}$ 二次抗体を用いて、室温・暗所にて90分間インキュベートします。カバースリップをPBSで3回洗浄します。次に、ガラススライド上に封入剤を10 µL滴下します。培養皿からカバースリップを取り出し、封入剤の上に裏返して載せます。過剰な封入剤を優しく拭き取り、エッジをマニキュアで密封します。マイクロダイセクションに向けて細胞を準備するには、まずPENメンブレン上で神経前駆細胞を分化させ、ニューロンに富む培養液を作成します。スライドにはpoly L lysineとlamininがコーティングされています。以降のすべての工程は、RNAフリー条件下で実施してください。次に、細胞を可視化するために、Histo-Gene染色を用いて培養物を染色します。Histo-Gene染色は核を紫色に、細胞質を淡いピンク色に染色するため、形態学的特徴に基づいてニューロンとグリア細胞を容易に区別できます。スライドを75% ethanolおよび脱イオン滅菌水に30秒間浸してください。次に、スライドをキムワイプの上に置きます。histo geneを200 µL加え、20秒間待ちます。続いて、脱イオン滅菌水、75% ethanol、95% ethanol、100% ethanolの順に、それぞれ30秒間ずつスライドを浸します。その後、キシレンに5分間浸し、キムワイプの上で5分間乾燥させます。次に、通常のスライドガラスの上にPENメンブレンスライドを重ね、Veritasレーザーキャプチャーマイクロダイセクションシステム（LCM）にセットし、ソフトウェアを起動します。ロードマップ画像を撮影し、アストロサイトを含まない純粋なニューロン集団の領域を確認します。描画ツールを使用して、これらのニューロンをマークします。次に、コンピュータ制御による精密な自動操作を用いて、2段階のプロセスでこれらの領域のレーザーキャプチャーを行います。まず、膜をキャップに付着させるため、レーザー出力を70 milliwatts、パルス幅を2,500 microsecondsに設定し、複数のスポットにIRを照射します。次に、10 millivoltsの低レベル設定のUVカッティングツールを用いて、標識領域を切り出します。これらの工程を組み合わせることで、標識領域を選択的にLCMマクロキャップに回収できます。100個以上のニューロンが回収されたら、顕微鏡を用いてキャップから膜を取り除き、チューブに入れます。P OPU RNA分離キットを用いてLCMサンプルから全RNAを抽出し、DNase処理を行います。次に、ribo amp RNA増幅キットを用い、キットの指示に従って抽出したRNAを増幅させます。最後に、TAQMAnプローブを用いたリアルタイムRT-PCR解析を行い、ヒト神経フィラメント重鎖を検出します。4日齢のニューロスフィアを、ポリL-リジンおよびラミニンでコーティングした表面を用い、分化特異的な成長因子と組み合わせて分化させることで、ニューロンに富んだ培養物が得られます。2週間後、低密度領域において、ここに示されるようなニューロンに富んだ培養物が得られます。細胞は、ここに示されるようなアストロサイトへと分化することがあります。アストロサイトへの分化は、ニューロン分化に使用するものとは別に、成長因子CNTFを用いることで誘導することも可能です。ニューロン分化は、特異的なニューロンマーカーであるNeuNおよびシナプシン、アセチルコリンエステラーゼおよびシナプトフィジン、さらにBDNFおよびGAP 43に対する抗体を用いて同定できます。陽性染色は、分化した細胞が一次ニューロンの特性を有している証拠となります。さらに、アストロサイトはStat3およびGFAPの免疫染色陽性によって同定できます。ニューロンのレーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、ポリLリシンおよびラミニンでコーティングされたPENメンブレン上で分化させた細胞に対して行われます。ここに示しているのは、組織染色を施したニューロンです。細胞を可視化した後、レーザーを用いて目的の細胞を囲むようにトレースします。これによりPENメンブレンが融解し、上部に配置したキャプチャーキャップに付着します。最終的に、多数の細胞をトレースして同一のキャップに回収し、DNAまたはRNA解析に供することが可能です。このビデオを視聴することで、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを用いてニューロンを単離する方法について十分に理解できるはずです。

laser-capture-microdissection-neurons-from-differentiated-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

体外で分離された神経細胞を操作するためのレーザーピンセットを使用して

このビデオ、記事では、単一または複数単離するための方法を提示...

のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションショウジョウバエ末梢ニューロン

出典: Palma-Tortosa, S., et.al.ヒト幹細胞移植と検証のためのex vivoモデルとしての成人ヒト皮質の器官型培養J. Vis.

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マウス神経新生時のノッチシグナル伝達ダイナミクスのリアルタイム生物発光イメージング

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ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

ヒト誘導多能性由来のアストロサイトとニューロンおよびそれらの共培養を電気生理学的記録のために脊髄に分化させる方法を記載する。...

領域特異的ヒト多能性幹細胞由来アストロサイトおよびニューロンを用いたALSモデリングのための電気生理学的基盤の確立

学ぶレーザーキャプチャーマイクロダイセクションによるヒト神経前駆細胞からの純粋な神経細胞の単離法。神経栄養因子を用いた分化培養と免疫蛍光染色を組み合わせ、遺伝子発現解析のための神経細胞集団を正確に取得する技術を解説します。

文化における分化したヒト神経前駆細胞からの神経細胞のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

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