弱散乱被験者のデジタルインラインホログラフィ顕微鏡（DIHM）
2014年2月8日
弱散乱物体の三次元位置が一意的に標準的な顕微鏡に軽微な改変を伴うデジタルインラインホログラフィック顕微鏡法（DIHM）を用いて同定することができる。当社のソフトウェアは、微細な位相物体の3次元位置と形状を得るためにレイリー·ゾンマーフェルトバックプロパゲーションと相まって、簡単な画像処理、ヒューリスティックを使用しています。
次の実験の全体的な目標は、遊泳する細菌細胞の連鎖の幾何学における3D位置を再構築することです。これは、まず細菌細胞を正しい濃度まで増殖させ、イメージングに適したサンプルを提供することによって達成されます。第2のステップとして、LED光源をセットアップして位置合わせし、ホログラフィック画像を取得できるようにします。
次に、再構築ソフトウェアを使用して、細菌細胞の鎖の3D座標を取得します。その結果、ホログラフィックイメージングに基づいて細菌細胞の3D位置と形状を再構築する能力が示されました。この手法が共焦点顕微鏡のような既存の方法よりも優れている点は、高フレームレートでラベルフリーの体積イメージングが可能であることです。
接種を開始するには、連鎖球菌株V 4 0 5 1 1 97の凍結ストックからの氷結晶を含む10ミリリットルのKTY培地を、ロータリーシェーカーで摂氏35度、150RPMで一晩スターター培養をインキュベートします。成長したら、飽和スターター培養から500マイクロリットルの新鮮なKTY培地10ミリリットルを接種します。細胞が0.8〜1.0の波長600ナノメートルの光学密度に達するまで、摂氏35度、150RPMで3.5時間インキュベー
トします。これは、ミリリットルあたり10〜8番目のセルの約5倍に相当します。次に、細胞を新鮮な培地で1〜400に希釈して、1ミリリットルあたり約100万個の細胞の最終濃度を得ます。次に、注射器にワセリンを入れ、顕微鏡スライド上に高さ1mmのグリースの輪を作ります。
次に、サンプル溶液を中央に一滴垂らします。サンプルの上にカバーガラスをそっと置き、ガラスを軽く押して端をシールし、液体がスライドとカバーガラスの両方に接触していることを確認します。結果として得られるサンプルチャンバーは、深さが100〜200マイクロメートルになります。
60 x オイル浸漬レンズを所定の位置に回転させ、オイルを一滴加えます。次に、サンプルチャンバーをカバーガラスを下にして顕微鏡ステージに置きます。ガラスカバースリップとレンズの間に気泡が形成されていないことを確認してください。
サンプルチャンバーの底面に焦点を合わせてから、コンデンサーに焦点を合わせます。次に、標準照明をオフにし、LEDヘッドを顕微鏡のコンデンサー開口部の後ろに置きます。コンデンサーが明視野モードに設定されていることを確認し、LED電源を最大出力に設定します。
次に、コンデンサーの絞りを最大限閉じ、照明が対物レンズの絞りの中心に来るまで、マウント内のLEDを微調整します。コンピューターのスイッチを入れてから、光路を顕微鏡のカメラポートにリダイレクトします。画像取得ソフトウェアで、フレームレートを30フレーム/秒に調整し、画像サイズを5 12 x 5 12ピクセルに調整します。
画像強度ヒストグラムをチェックして、画像のどの部分も飽和したり露出不足になっていないことを確認します。フレームの露光時間は、良好なコントラストを維持しながら、できるだけ短くする必要があります。細胞が界面の近くに集まった場合は、顕微鏡の焦点を合わせ直して、細菌細胞の焦点がわずかにぼけるようにします。
細胞は、最適な再構成のために焦点面から約10〜30ミクロンの位置にある必要があります。ピントを合わせ直した後、一連のビデオフレームを集録し、非圧縮のVIファイルとして保存します。次に、無料でダウンロードできるDIHMソフトウェアを起動して、ビデオフレームを数値で焦点を合わせ直した画像スタックに変換します。
再構築を開始するためのサンプルフレームがソフトウェアに付属しています。関心のあるフレームとその背景を別々の画像ファイルとしてボックスに入力します。背景画像は、ホログラムがない場合のビデオの背景を公正に表し、ホログラフィックのローカリゼーションと分析を妨げる可能性のある固定パターン ノイズを抑制するために使用されます。
次に、グローバル設定ボックスに出力スタックパラメータを入力します。まず、スタートフォーカスの最初のフレームの軸位置を入力します。次に、再構築されたスタック内のスライスの数をステップ数で入力し、最後に、スタック内の各スライス間の実際の距離をステップサイズで入力します。
ステップ サイズを横方向のピクセル間隔と同じになるように設定すると、サンプル データを使用して正しい比率でオブジェクトを再構築できます。この値は 0.233 マイクロメートルである必要があります。次に、カメラの照明、波長、中屈折率、および横方向のサンプリング周波数を入力します。
ピクセル/ミクロンのボックスでは、対物レンズの倍率をカメラセンサーのピクセルサイズで割ることにより、カメラの横方向のサンプリング周波数を見つけることができます。サンプル データを使用すると、数値は 60 x 14 マイクロメートルで割ると、4.29 ピクセル/ミクロンになります。次に、ホログラムでオブジェクトの中心が暗い場合は、Z グラデーションの反転ボタンを押します。
これにより、元のサンプルの焦点面の下にあるオブジェクトを抽出するフィルターが適用されます。次に、画像へのノイズの多いピクセルの寄与を抑制する役割を担うバンドパスフィルターをオンにします。これは、生成直後に各画像スライスに適用されます。
次に、中間出力スイッチがオンオフ状態になり、オンになっていることを確認します。これらのスイッチがオンの場合、2つのビデオが作成されます。最初の出力は、ファイル名がスタック a V で終わる再フォーカス スタックです。2 番目のスタックは、ファイル名がグラデーション a VI で終わる実際のグラデーション操作です。理想的には、この 2 番目のスタックには、暗い背景に対して明るいオブジェクトとして強調表示された対象オブジェクトが含まれます。
すべてのパラメータを設定したら、メインウィンドウで実行を押してコマンドを実行します。選択したフレームがソフトウェアのメインボックスに表示されます。次に、画像の左側にあるツールバーにある虫眼鏡ツールを使用して、ズームインおよびズームアウトします。
四角形ツールを使用して、関心領域または ROI を選択し、四角形の内側にできるだけ多くのホログラム フリンジをキャプチャして、再構築を最適化します。最後に、処理ボタンを押して、2つの別々の画像スタックを生成します。このWebサイトで入手可能な画像Jを使用して、結果のスタックを検査します。
目的のオブジェクトがグラデーション画像スタックにはっきりと見える場合は、レンダリングセクションに進んでオブジェクト座標を抽出します。レンダリングを開始するには、フィーチャ抽出ボタンを押して、X、Y、Z 座標位置機能を有効にします。次に、出力座標ファイルのパスと拡張子を入力し、出力座標スタイルボックスでPOVレイスタイルを選択します。
これにより、プログラムは、このWebサイトから入手できる無料のPOVレイ追跡ソフトウェアパッケージを使用して視覚化できるオブジェクトファイルを書き込み、画像を再処理してオブジェクトの座標を抽出します。プログラムは、出力コードボックスのファイル名に書き込まれた、選択したROIの一連のX、Y、Z座標を提供します。オブジェクト座標の抽出は、スタックの生成よりも大幅に時間がかかります。
再構築コードと共に提供されるサンプルPOV光線ファイルが、出力座標ファイルと同じフォルダに存在することを確認してください。サンプルのドットPOVファイルを編集し、行上の逆カンマ内のファイル名を置き換えます。再構築コードによって生成されたデータ ファイルの名前を持つ my ファイル NC を含めます。
次に、POV ray でカメラの位置、照明、テクスチャ、レンダリング オプションをカスタマイズします。終了したら、実行ボタンをクリックしてビットマップ画像をレンダリングします。これは、連鎖球菌の鎖が一瞬向きを変えたイメージです。
焦点面まで終了します。この構成のオブジェクトは再構築が難しく、通常は焦点面の近くにブロブを生成します。ここに示されているのは、チェーンが光軸に沿って直接向き付けられていないこのシリーズのほとんどのフレームを代表する、適切にレンダリングされたイメージです。
オブジェクトの形状と位置は、右側のパネルに示すように、レンダリングで忠実に再現されています。このテクニックを習得すれば、数分で完了します。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本研究では、デジタルインラインホログラフィック顕微鏡（DIHM）を用いて、遊泳する細菌細胞の三次元的な位置および形状を再構成する方法を実証します。この手法により、ラベルフリーでの高速フレームレートによるボリュームイメージングが可能となり、従来の手法に対して大きな利点が得られます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物物理学
- イメージング技術
背景
- デジタルインラインホログラフィック顕微鏡法（DIHM）は、改良された顕微鏡技術です。
- これにより、弱散乱体を3次元的に一意に識別することが可能になります。
- ホログラフィックイメージングは、ダイナミックなプロセスをリアルタイムで捉えることができます。
- 共焦点顕微鏡などの既存の手法では、多くの場合ラベル付けが必要であり、それが生物学的サンプルの挙動を変化させることがあります。
研究目的
- 遊泳する細菌細胞の3次元的な位置と形状を再構成すること。
- 生細胞のダイナミクスを捉える上でのDIHMの有効性を実証すること。
- 従来のイメージング手法に対するDIHMの利点を比較すること。
使用した手法
- 適切な濃度の細菌細胞培養液の調製。
- 最適なホログラフィックイメージングのためのLED光源の光軸調整。
- 再構成ソフトウェアを用いた3次元座標の取得。
- 得られたホログラフィック画像の解析による細胞構成の評価。
主要な結果
- 細菌細胞の3D座標の再構築に成功した。
- 本手法は、ラベルを必要とせず、高フレームレートでのイメージングが可能であることを示した。
- その結果、イメージング速度とサンプルの完全性の観点から、共焦点顕微鏡法に対して明確な優位性があることが示された。
- ホログラフィックイメージングは、動的な生物学的プロセスの観察に有効であることが証明された。
結論
- DIHMは、生存細菌細胞のダイナミクスを研究するための強力なツールです。
- この手法により、試料を変化させることなく詳細な3Dイメージングが可能になります。
- 本技術は、さまざまな生物学研究分野に適用できる可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
デジタルインラインホログラフィック顕微鏡法（DIHM）は、弱散乱の生物学的試料のラベルフリーな体積イメージングを高フレームレートで実現し、従来のライブセルイメージングにおける「標識が必要である」または「3D空間分解能が不足している」という主要な制限を解消します。この機能により、自然な条件下での細胞の位置と形状の定量的かつモデルフリーな測定が可能となり、ターゲットバリデーションや表現型スクリーニングにおけるメカニズムの曖昧さを軽減し、早期創薬ワークフローを支援します。本手法は標準的なイメージングハードウェアとの互換性があり、スケールアップ可能な試料量を扱うことができるため、ディスカバリーバイオロジーにおける治療仮説のリスク低減に寄与する再利用可能なプラットフォームとして位置付けられます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見とターゲットバリデーション
- 科学的価値： 外来標識を用いることなく、顕微鏡試料中の物体の位置と形状をモデルフリーで曖昧さなく測定することを可能にし、治療仮説の検証を支援します。
- 運用的価値： 標準的なCMOS/CCDカメラおよびLEDまたはレーザー照明を使用するため、特殊な試薬を用いることなく既存の顕微鏡ワークフローに統合できます。
- 予測的価値： 細胞構造の定量的な3D座標を提供し、天然のダイナミクスの直接観察を通じて、機能的ターゲットの検証および生物学的リスクの低減を促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 3D再構成のための深度情報を含む干渉パターンを捕捉し、複雑な微小環境における細胞応答のラベルフリーな評価を可能にする。
- 運用上の価値： カメラセンサーサイズと照明のコヒーレンスによってアクセス可能な試料体積を定義し、レーザー照明を用いることで最大 5 mm³ の体積においてプラットフォーム間の標準化をサポートする。
- 予測的価値： Rayleigh-Sommerfeld逆伝播とGouy位相異常のヒューリスティックを採用し、アッセイの準備状態とスケーラビリティに関する再現性のある定量的な出力を生成する。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：疾患に関連する系においてダイナミックな生物学的プロセスのリアルタイム観察を可能にすることで、発見から前臨床検証までの連続性を支援します。
- 運用的価値：サンプルの改変なしに高フレームレートでのイメージングを可能にし、前臨床モデルにおける縦断的追跡のための本来の挙動を維持します。
- 予測的価値：細胞の幾何学的形状や配置における曖昧さを低減することでメカニズム的なリスク軽減を実現し、リスク調整後の進展判断に寄与します。
パイプラインおよびワークフローの統合
DIHMは、初期生物学における仮説検証からリード化合物の同定および前臨床検証に至る探索のコンティニュアムに適合し、特に実験条件を比較するためにラベルフリーで体積的かつダイナミックなイメージングが必要とされる場合に有用です。
- 探索生物学：細菌細胞や細胞内構造などの弱散乱物体のモデルフリーな3D局在化を提供することで、仮説検証やパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：定量的なリフォーカス画像スタックにより、異なる条件下での細胞構成の比較が可能となり、アッセイの準備を効率化します。
- アナリティクス：特徴抽出を通じてX、Y、Z座標を出力し、空間分布や運動パターンの統計解析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：動的プロセスの経時的なイメージングにおいてサンプルの完全性を維持することで、前臨床への連続性を確保します。
- エンタープライズでの再利用：無料の再構成ソフトウェアと標準的なハードウェアを活用し、単発的な手法ではなく、再利用可能なイメージング機能として機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ラベルフリーおよびモデルフリーな物体の形状と位置の3D再構成による、予測精度の向上。
- 運用的価値：数値的な再フォーカスおよび背景減算による固定パターンノイズ抑制を通じた、標準化と再現性の確保。
- 戦略的価値：天然の細胞ダイナミクスの早期かつ高忠実度な観察により、後段階の生物学的リスクを低減し、より的確なgo/no-go判断を実現。
- ポートフォリオへの影響：ターゲットへの信頼性とリード化合物の選択に寄与する定量的空間データによる、リスク調整後の優先順位付け。
実施上の考慮事項
- ホログラフィック画像の取得およびRayleigh-Sommerfeld逆伝搬を用いた数値再構成に関する専門知識が必要です。
- 平面波照明および、規定のフレームレートと解像度でのCMOS/CCD画像キャプチャが可能な装置が必要です。
- 再現性のある3D再構成を行うには、照明のコヒーレンス、ステップサイズ、および横方向のサンプリング周波数のチーム間での標準化が求められます。
- 実験スケールおよび倍率に合わせて、出力スタックパラメータ（開始焦点、ステップ数、ステップサイズ）を適応させる必要があります。
- 実用上の制限：最適な再構成には、物体が焦点面から10–30 micronsの範囲にあることが必要であり、精密な試料調製とフォーカシングが不可欠です。
