トリプシン消化プロトコルモデルマウスの網膜血管系を分析する

この手順の全体的な目的は、網膜血管ネットワークを単離することです。これは、まず単離した網膜に対して一連の水洗を行うことで達成されます。次に、網膜の大きさに応じて、37 °Cのトリプシンで約1時間から1時間半かけて消化させます。

次に、追加の水洗浄と顕微鏡下での解剖により、血管系を単離します。最終的に、微小動脈瘤、毛細血管の変性、および内皮細胞と寄生虫の比率の異常などの病理学的な血管変化を可視化できます。したがって、網膜フラットマウントの作製などの既存の手法に対するtry and digest法の主な利点は、血管ネットワーク全体を非常に鮮明に強調できることです。

一般的に、この手法に不慣れな人は、技術的な難易度が高く、一貫した操作を行うことが困難であるため、苦労することになります。血管分離のステップは言葉だけでは習得することが難しいため、この手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要です。これは、糖尿病網膜症などの疾患を含む網膜血管生物学の研究を行っているあらゆる研究室にとって非常に価値のあるツールです。このテクニックのデモンストレーションは、私の研究室の有能な医学生であるJonathan Chowが行います。

摘出したマウスの眼球を10%中性緩衝ホルマリンで24時間固定した後、眼球をペトリ皿に入れ、少量の水で満たします。まず、解剖用はさみを用いて、角膜に慎重に最初の切り込みを入れ、解剖を開始します。次に、切り込みを入れた箇所をストレートピンセットで保持しながら、はさみで角膜と強膜の境界に沿って切り、角膜を除去します。

次に、極細の曲鉗子および直鉗子を使用します。強膜と脈絡膜を、視神経に向かって網膜からゆっくりと慎重に剥離させます。その後、水晶体、および過剰な虹彩やデブリを網膜から除去し、神経網膜層を血管から分離しやすくします。

24ウェルプレートの各ウェルに、45 µmフィルターを通した水を約500 µL加え、網膜をウェルに入れて室温で4〜5時間緩やかに振盪させ、30〜60分ごとに水を交換する。そのまま室温で緩やかに振盪させながら、一晩水中で網膜の洗浄を継続する。翌日、水を取り除き、3% trypsinを添加し、顕微鏡下でウェル内にデブリがないことを確認する。血管が付着するのを避けるため、組織を37 °Cで、緩やかな振盪または振盪なしで1〜1.5時間インキュベートする。

組織に崩壊の兆候が見え始めたら、プレートを顕微鏡ステージに置き、網膜を避けて慎重にトリプシンを除去して血管系を分離させます。まず、ピンセットを用いて網膜にろ過水を加えます。

薄く透明な層として現れる内境界膜を剥離します。プレートを軽く揺らして撹拌します。5分後、プレートを再び顕微鏡ステージに置き、網膜に損傷を与えないよう注意しながら慎重に水を入れ替え、血管ネットワークを付着した網膜組織から分離しやすくします。

デモンストレーションで行ったように、最後の洗浄後の水にデブリがほとんど、あるいは全く残らなくなるまで、網膜を洗浄します。通常、非血管組織をすべて除去することが、この手順で最も困難な部分となります。血管ネットワークの単離を容易にするために、以下の手法を順次、あるいは個別に使用することができます。重要なコツの一つは、網膜を操作する前に、すべての器具とトリプシンを浸しておくことです。

これにより、組織が器具に付着するのを防ぐことができます。200 µLのマイクロピペットチップに保存しておいたトリプシンを塗り、網膜血管に隣接して血管方向に向かって慎重に水をピペッティングし、穏やかに撹拌させます。非血管性組織が依然として中心部で除去しにくい場合は、視神経にトリプシンを塗布したマイクロピペットチップを当て、血管ネットワーク全体を慎重に上下にピペッティングして、非血管性組織の分解を促進します。

最後に、ピンセットを用いて血管系を水から静かに持ち上げ、血管以外の付着物を除去します。最終的に、破片のない完全な網膜血管ネットワークが得られるはずです。

血管系を可視化するには、まず清潔なスライドガラスの上に水滴を1滴落とします。次に、顕微鏡で確認しながら、消化した血管を水滴の中へ移します。VAのフラップマウントが折りたたまれているか開いているかを確認してください。血管が折りたたまれていると、視認性が低下します。

染色時に組織に折り畳みがある場合は、水をさらに加え、スライドを静かに揺らして広げやすくします。その後、マイクロピペットを使用して、余分な水をゆっくりと取り除きます。手順が成功すると、マウス網膜血管ネットワーク全体の構造が維持されたまま平坦に展開され、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色された最終産物が得られます。

ここで示されているように、またこの画像に見られるように、網膜において内皮細胞とペリサイトの明確な分化が観察されます。白矢印で示される内皮細胞の核は卵形または長楕円形で、完全に血管壁の内部に位置しています。黒矢印で示される寄生虫の核は小さく球形であり、濃染しており、一般に毛細血管壁に沿って突出した位置にあります。

トリプシン消化法は、糖尿病動物モデルにおける血管病変を解析するために一般的に用いられる手法です。この画像は、2型糖尿病モデルであるDB DBマウスで観察された毛細血管変性の例を白矢印で示しています。この手法はマウスの網膜用に最適化されていますが、ラットの網膜においても同様の結果を得ることができます。

これらの画像に示されているように、ラットの網膜はマウスの網膜よりも大きく、24ウェルプレートではなく12ウェルプレートが必要であることに注意してください。また、ラット網膜の血管ネットワークは、マウスのそれよりも脆弱ではありません。非血管組織を可能な限り多く除去することが極めて重要です。

残留物があると非特異的な染色が起こり、血管系の可視化が不十分になります。例えば、この画像では、非血管組織の除去が不完全であった様子が確認できます。同様に、血管系の可視化を向上させるためには、封入時に網膜を十分に展開させておくことも重要です。

この画像は、血管フラットマウントの展開に失敗した例を示しています。この技術的に困難な手順を習得すれば、トリップス（切断）および消化法は、血管ネットワーク全体を詳細に可視化できる極めて有用な手法となります。

マウスの眼において本手法を改良することで、研究者は遺伝子改変マウスを活用して、網膜血管系を制御し得るさまざまな経路を研究でき、さまざまな網膜疾患の病態生理を理解することが可能になります。その結果、糖尿病網膜症などの疾患の病理に対する理解を深めることができます。DVDBマウスのようなマウスモデルを研究することにより、最終的には網膜血管系を標的とした新たな潜在的治療介入法を見出す機会を得られる可能性があります。