Name: トリプシン消化プロトコルモデルマウスの網膜血管系を分析する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 学ぶトリプシン消化法によるマウス網膜血管網の分離と可視化技術。病理変化を明確に観察し、糖尿病性網膜症などの血管性疾患の病態理解に貢献する研究方法です。

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この作品は、部分的にNIH RO1-EY019951（AAF）、失明予防のためのイリノイ学会（JCC、AAF）、盲目（RPB）を防止するための研究から眼科への無制限の資金、NYとRPB医学生フェローシップグラントによってサポートされていました（JCC）。

1。網膜準備<ol><li>マウスの目を摘出。片手を使用して、目が見えるようにまぶたを開く。もう一方の手で、湾曲した鉗子（湾曲した上向き）を使用して、軌道の優れたと劣る面に圧力を適用する地球儀突出まで。ゆっくり目の後部側面に鉗子を閉じ、目を摘出するための連続動作で持ち上げます。 </li><li>中性の10％は、少なくとも24時間緩衝ホルマリンで目を修正。 </li><li>小さなペトリ皿にPBS溶液に置き目。 </li><li>大きな涙を誘発しないように注意しながら、慎重に顕微鏡下で網膜を解剖する。解剖ハサミで角膜の初期カットを作成します。その後、ストレートピンセットでカットエリアを保持しながら、角膜を除去し、角膜と強膜の境界線に沿ってカットするはさみを使用しています。離れて視神経に向かって網膜から強膜と脈絡膜はがし慎重に、細かい曲線状とストレート鉗子を使用。このステップは次のように忍耐を必要とするすぐに網膜を解放すると、涙につながることができます。レンズと網膜16から余分なアイリスやゴミを取り除きます。 </li></ol> 2。水洗<ol><li>水で24ウェルディッシュ、カバーに置き網膜（約500μlの、少なくとも45μmのフィルターで濾過）。 </li><li> 30分ごとに1時間、少なくとも4〜5回水を変える。 </li><li>室温で穏やかに振盪しながら水に一晩にしておきます。 </li></ol> 注： 彼らは血管から神経網膜層を分離手助けとしての洗浄工程が非常に重要です。 3。トリプシン消化<ol><li>水を除去し、37℃で0.1 Mトリス緩衝液（pH 7.8）で3％トリプシン（Difco社製1:250）°ない揺れに優しいとCの溶液中に網膜をインキュベート。組織が崩壊の兆し（約1.5時間）を示す開始したときにトリプシン消化が完了します。 注意： 急激な揺れを避けるこのような血管系を損傷する可能性があります。 </li><li>慎重に、網膜に触れないように顕微鏡を用いて十分に個別にトリプシンをピペット。ステップ4.3で、顕微鏡下で血管を操作するときにこの過剰トリプシンは、後で使用することができます。 </li></ol> 4。血管系を分離<ol><li>網膜にろ過された水を追加します。その後、必要に応じて、ハサミを使用して、ピンセットで内境界膜剥離を試みる。 5分間穏やかな攪拌しながら振る。慎重に、網膜の損傷を防ぐために、顕微鏡下で水をピペット。 </li><li>付着網膜組織から血管のフリーネットワークを支援するため、水洗浄します（5分間ずつ）を繰り返します。洗浄した後に水中に残存しないデブリはほとんどがある場合に、水洗浄が完了する。 </li><li>解剖顕微鏡下で慎重な操作は今血管網を解放促進するために必要とされている。以下の配列又はインドールで使用することができるいくつかの有用な技術があるividually技術的な好みに基づいて、所望の結果を達成するために： <ol class="lalpha"><li> 200μlのピペットを用いて、丁寧に穏やかに撹拌を引き起こし、船で水を吹いて、血管に隣接する水をピペットで上下。 </li><li> 200μlのピペットを用いて、ピペットのコートの壁を助けるため上下トリプシンをピペット。その後、よく非血管組織を打破するための一回ダウン血管ネットワーク全体をピペット。 注： 視神経ではなく血管網の端にピペットチップをセンタリングすることも先端に付着血管系を防ぐことができます。 </li><li>優しく非血管コンポーネントを取り除くために水のうち細かい鉗子で血管系を持ち上げます。 </li><li>上記の手順が機能しない場合は、組織を打破し、数分間37℃でインキュベートし網膜にトリプシンを追加します。その後、トリプシンを削除し、手順4.1から4.3を繰り返します。 </li></ol></li></ol> &lt;強い&gt;注意： トリプシン（例えばピペットチップ、鉗子）で血管と接触するすべての楽器をコーティングすることを確認してください。これは、機器に血管系の付着を防ぐことができます。 5。血管系の可視化<ol><li>きれいなスライド上に一滴の水を置きます。 200μlのピペットまたは鉗子を使用して、水の中に消化された血管を転送します。確認し血管フラットマウントが展開されています。 水の表面張力が今透けて見える血管網を展開するのに役立ちます。組織が ​​展開されない場合は、追加の水を追加して、優しく展開容易にするスライドを横に振る。 </li><li>ペーパータオルをピペッティングまたは使用することにより非常にゆっくりと余分な水分を取り除きます。 </li><li>スライドが完全に乾燥することができます。 </li><li> PAS /ヘマトキシリン​​またはH＆E染色のいずれかと、適切なプロトコルを介してスライドを染色する。 注：PAS /ヘマトキシリン、血管壁や細胞核を同定するために有用であり、H＆Eは、Dのために便利ですRBCのemonstration同様。 </li><li>脱水とマウント（パーマウントはメディアをマウント）。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

トリプシン消化は、網膜の血管系を評価するための標準的な方法です。残念ながら、それは技術的に困難であると正しく実行されていない場合、試料の損失率の高さになることがあります。また、手順は眼疾患の一般的に使用される遺伝子動物モデルにおいて、この技術の適用を制限することができる、マウスでは特に困難である。本稿では、マウスの目に効果的かつ一貫して手順を実行する方法についてのガイダンスを提供しています。 プロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。まず、網膜は血管網がそのまま残ることを保証するために、任意の大規模な涙を避けるために慎重に切開することが重要です。それはトリプシン消化後に容易に分離を容易に血管からneuroretinal層を別のに役立ちますように第二に、ろ過された水で網膜を洗浄して一晩重要です。プロセスを促進することができる一つの変更は、トライ1％に網膜を配置することであろうトンX-100は、1〜2時間のためにろ過された水に混入。その後、トリプシン消化物を水の一連の後の同じ日にトリトンXを除去するために洗浄を行うことができます<p class="jove_conten...

網膜の血管系を可視化することは、糖尿病性網膜症などの様々な眼疾患のメカニズムを分析するための極めて重要なアプローチである。それは1つが瘤、毛細血管変性、および周皮細胞損失8,9含めて早い血管の異常を、評価することができます。現在までに、網膜血管構造を分析するために開発されたいくつかの手法がありました。種々の染料の灌流は、血管を強調するために使用されてきたが、すべてが同様の制限を共有している。船舶1を破裂し、損傷リスクが高い圧力で与えられない限り、注射はめったに全体網膜血管構造を強調していません。蛍光色素で標識されたGのB4イソレクチン（; I21413、インビトロジェン、共役アレクサフルーア594 1:100希釈）と血管内皮の免疫染色と網膜のフラットマウントすると、血管の全体的なアーキテクチャを強調するが、毛細血管の詳細な可視化、基底膜と周皮なしですることができます。それはによって指摘されたFriedenwaldその容器はヨウ素酸シッフ（PAS）またはヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色10と網膜のフラットマウントを染色することによって強調することができます。しかし、染色は血管に非特異的であったと同様に、非血管組織を強調し、それが困難な血管を区別すること。 1960年代に、コーガンと桑原は、簡単に網膜1の非血管の成分を消化することによって網膜の血管系を可視化するために作られたトリプシン消化法を開発しました。その時以来、トリプシン消化は、網膜2-5の血管系を分析する中で、金の標準的な方法となっています。しかしながら、脈管構造を分離する他の代替技術が記載されていることに留意することが重要である。浸透圧溶解の使用は脈管構造を分離し、組織11,12の生化学的研究を可能にするために使用されてきたが、手順は、解剖学的研究のための主要な方法として使用されていない。組織プリント方法がされている微小血管系の大きなセグメントを分離するために使用され、血管系13の電気緊張アーキテクチャを研究する能力を可能にします。理論的に、この技術はまた、容器の品質が高いほど、解剖学的変化を研究するために使用することができる。しかし、それだけで血管系ネットワーク全体のセグメントを単離することができる。これらの方法はトリプシン消化を置き換えることはできないが、それは、異なる利点および欠点を持っており、この点で相補的であることに注意することが重要である。 トリプシン消化方法は技術的に困難であり、常に6,7を行うことが困難である。さらに、それは、一欲望網膜6,7の全体的な血管のアーキテクチャを維持する場合は特に、トリプシン消化は、マウスモデルでは特に困難であることが指摘されている。課題は必要とする（1）脈管構造ならびに非血管組織の両方の損失を引き起こす網膜の過剰消化、（2）下の消化を含むにおける血管床の損傷にリードを回すことができる大規模な機械的な解剖、非特異的染色につながる血管系から非血管組織（3）貧しい分離。いくつかの原稿では、これらの課題を強調しているが、どれも彼らに14,15を克服するための詳細かつ一貫性のあるプロトコルを提供していない。本稿では、特に難しい手順の取り扱い上の特定のヒントを、マウスとラットの網膜にトリプシン消化を実行するための手法を詳述し、ステップバイステップの方法論を紹介します。概略図を図1に示されている。

<table><tbody><tr><td colspan="4">試薬</td></tr><tr><td>10% 中性緩衝ホルマリン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン (1:250)</td><td>Amresco</td><td>0458-50G</td><td>0.1 M トリストリズマベースで 3% トリプシンを作る トリス</td></tr><tr><td>マ</td> ベース <td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>0.1 M トリス緩衝液 (pH 7.8 @ 37 &deg;C)</td></tr><tr><td>TRIZMA</td><td>Sigma</td><td>T3253-500G</td><td></td></tr><tr><td>Steritop 滅菌真空ボトル</td><td>ミリポア</td><td>SCGPS05RE</td><td>ろ過水</td></tr><tr>を作成します<td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td></td><td></td> 網<td>膜を良好に視覚化できる顕微鏡であれば、どれでも十分です。(作動距離24mmで10倍で十分です)</td></tr><tr><td>ストレートはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15024-10</td><td>刃先:8 mm;先端径:0.2 mm;10 cm</td></tr><tr><td>ストレート鉗子 (Inox)</td><td>Dumont #5</td><td>11252-20</td><td>Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm</td></tr><tr><td>Curved Forcepts (Dumostar)</td><td>Dumont #7</td><td>11297-10</td><td>Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm</td></tr><tr><td>Dubnoff Metabolic Shaker Incubator</td><td>Precision Scientific</td><td>BDG59442</td><td>Shaker オプション</td></tr><tr><td>24-well dish</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>VWRの</td><td>82027-132</td><td></td></tr></tbody></table>

トリプシン消化プロトコルモデルマウスの網膜血管系を分析する

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

トリプシン消化は、網膜血管系1-5を分析するための金標準的な方法です。これは、網膜の非血管成分の消化後に相互接続された脈管の二次元の平らなマウントを作成することによって複雑な三次元網膜血管および毛細血管のネットワーク全体の可視化を可能にする。これは、1つは、このような瘤などの様々な病的血管の変化、キャピラリー変性、および周皮細胞の比率に異常な内皮を勉強することができます。しかし、この方法は、原因遺伝子操作の容易6,7の網膜を研究するために最も広く利用できる動物モデルとなってきた、特にマウスでは、技術的に困難である。マウスの眼では、網膜血管の全体的なアーキテクチャを維持しながら、完全に非血管性成分を除去することが特に困難である。現在までに、詳細にトリプシンダイジェスト技術が記載文学の不足があるInのマウス。また困難な手順のトラブルシューティングに関するヒントを提供しながら、本稿では、マウス網膜におけるトリプシン消化物の詳細なステップバイステップの方法論を提供します。

成功した手順の最終製品は、 図2-4に示すようなアーキテクチャは、PAS /ヘマトキシリンまたはH＆Eのどちらかで染色し、維持したまま、マウスの網膜血管系のネットワーク全体のフラットマウントです。 図3に示すように、内皮細胞および周皮細胞の明確な区別が分かる。網膜では、内皮細胞の核は楕円形または細長いあり、血管壁内に完全にうそをつく。周皮細胞核が小さく、球状、密集染色、一般毛細血管壁に沿って盛り上がった位置を持っている。 トリプシン消化は、糖尿病動物モデルで血管病変を分析するための一般的な手順である。このような瘤、周皮細胞幽霊（周皮細胞損失の証拠）、無細胞毛細血管と毛細血管変性などの病的血管病変が記載されている。 図4は、DB / DBマウスで見られるキャピラリー変性、種類のモデルの例を示しています<html> II型糖尿病。手順は、マウスの網膜のために最適化されていたが、図5に示すように、同様の結果はまた、ラットの網膜で得られた。これは、ラットの...

トリプシン消化は、網膜血管系を分析するために最も一般的に使用される方法の1つである。本稿では、技術を最適化し、船舶の全体的なアーキテクチャを維持しながら、非血管組織を除去するための重要な変化を含めて詳細に方法を説明します。

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

この手順の全体的な目的は、網膜血管ネットワークを単離することです。これは、まず単離した網膜に対して一連の水洗を行うことで達成されます。次に、網膜の大きさに応じて、37 °Cのトリプシンで約1時間から1時間半かけて消化させます。次に、追加の水洗浄と顕微鏡下での解剖により、血管系を単離します。最終的に、微小動脈瘤、毛細血管の変性、および内皮細胞と寄生虫の比率の異常などの病理学的な血管変化を可視化できます。したがって、網膜フラットマウントの作製などの既存の手法に対するtry and digest法の主な利点は、血管ネットワーク全体を非常に鮮明に強調できることです。一般的に、この手法に不慣れな人は、技術的な難易度が高く、一貫した操作を行うことが困難であるため、苦労することになります。血管分離のステップは言葉だけでは習得することが難しいため、この手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要です。これは、糖尿病網膜症などの疾患を含む網膜血管生物学の研究を行っているあらゆる研究室にとって非常に価値のあるツールです。このテクニックのデモンストレーションは、私の研究室の有能な医学生であるJonathan Chowが行います。摘出したマウスの眼球を10%中性緩衝ホルマリンで24時間固定した後、眼球をペトリ皿に入れ、少量の水で満たします。まず、解剖用はさみを用いて、角膜に慎重に最初の切り込みを入れ、解剖を開始します。次に、切り込みを入れた箇所をストレートピンセットで保持しながら、はさみで角膜と強膜の境界に沿って切り、角膜を除去します。次に、極細の曲鉗子および直鉗子を使用します。強膜と脈絡膜を、視神経に向かって網膜からゆっくりと慎重に剥離させます。その後、水晶体、および過剰な虹彩やデブリを網膜から除去し、神経網膜層を血管から分離しやすくします。24ウェルプレートの各ウェルに、45 µmフィルターを通した水を約500 µL加え、網膜をウェルに入れて室温で4〜5時間緩やかに振盪させ、30〜60分ごとに水を交換する。そのまま室温で緩やかに振盪させながら、一晩水中で網膜の洗浄を継続する。翌日、水を取り除き、3% trypsinを添加し、顕微鏡下でウェル内にデブリがないことを確認する。血管が付着するのを避けるため、組織を37 °Cで、緩やかな振盪または振盪なしで1〜1.5時間インキュベートする。組織に崩壊の兆候が見え始めたら、プレートを顕微鏡ステージに置き、網膜を避けて慎重にトリプシンを除去して血管系を分離させます。まず、ピンセットを用いて網膜にろ過水を加えます。薄く透明な層として現れる内境界膜を剥離します。プレートを軽く揺らして撹拌します。5分後、プレートを再び顕微鏡ステージに置き、網膜に損傷を与えないよう注意しながら慎重に水を入れ替え、血管ネットワークを付着した網膜組織から分離しやすくします。デモンストレーションで行ったように、最後の洗浄後の水にデブリがほとんど、あるいは全く残らなくなるまで、網膜を洗浄します。通常、非血管組織をすべて除去することが、この手順で最も困難な部分となります。血管ネットワークの単離を容易にするために、以下の手法を順次、あるいは個別に使用することができます。重要なコツの一つは、網膜を操作する前に、すべての器具とトリプシンを浸しておくことです。これにより、組織が器具に付着するのを防ぐことができます。200 µLのマイクロピペットチップに保存しておいたトリプシンを塗り、網膜血管に隣接して血管方向に向かって慎重に水をピペッティングし、穏やかに撹拌させます。非血管性組織が依然として中心部で除去しにくい場合は、視神経にトリプシンを塗布したマイクロピペットチップを当て、血管ネットワーク全体を慎重に上下にピペッティングして、非血管性組織の分解を促進します。最後に、ピンセットを用いて血管系を水から静かに持ち上げ、血管以外の付着物を除去します。最終的に、破片のない完全な網膜血管ネットワークが得られるはずです。血管系を可視化するには、まず清潔なスライドガラスの上に水滴を1滴落とします。次に、顕微鏡で確認しながら、消化した血管を水滴の中へ移します。VAのフラップマウントが折りたたまれているか開いているかを確認してください。血管が折りたたまれていると、視認性が低下します。染色時に組織に折り畳みがある場合は、水をさらに加え、スライドを静かに揺らして広げやすくします。その後、マイクロピペットを使用して、余分な水をゆっくりと取り除きます。手順が成功すると、マウス網膜血管ネットワーク全体の構造が維持されたまま平坦に展開され、ヘマトキシリン・エオジン（H&amp;E）染色された最終産物が得られます。ここで示されているように、またこの画像に見られるように、網膜において内皮細胞とペリサイトの明確な分化が観察されます。白矢印で示される内皮細胞の核は卵形または長楕円形で、完全に血管壁の内部に位置しています。黒矢印で示される寄生虫の核は小さく球形であり、濃染しており、一般に毛細血管壁に沿って突出した位置にあります。トリプシン消化法は、糖尿病動物モデルにおける血管病変を解析するために一般的に用いられる手法です。この画像は、2型糖尿病モデルであるDB DBマウスで観察された毛細血管変性の例を白矢印で示しています。この手法はマウスの網膜用に最適化されていますが、ラットの網膜においても同様の結果を得ることができます。これらの画像に示されているように、ラットの網膜はマウスの網膜よりも大きく、24ウェルプレートではなく12ウェルプレートが必要であることに注意してください。また、ラット網膜の血管ネットワークは、マウスのそれよりも脆弱ではありません。非血管組織を可能な限り多く除去することが極めて重要です。残留物があると非特異的な染色が起こり、血管系の可視化が不十分になります。例えば、この画像では、非血管組織の除去が不完全であった様子が確認できます。同様に、血管系の可視化を向上させるためには、封入時に網膜を十分に展開させておくことも重要です。この画像は、血管フラットマウントの展開に失敗した例を示しています。この技術的に困難な手順を習得すれば、トリップス（切断）および消化法は、血管ネットワーク全体を詳細に可視化できる極めて有用な手法となります。マウスの眼において本手法を改良することで、研究者は遺伝子改変マウスを活用して、網膜血管系を制御し得るさまざまな経路を研究でき、さまざまな網膜疾患の病態生理を理解することが可能になります。その結果、糖尿病網膜症などの疾患の病理に対する理解を深めることができます。DVDBマウスのようなマウスモデルを研究することにより、最終的には網膜血管系を標的とした新たな潜在的治療介入法を見出す機会を得られる可能性があります。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

げっ歯類の網膜は、長い脳へのアクセス可能なウィンドウとして認識されている。この技術的な論文では、虚血性損傷後の中枢神経系内の血管再生の故障につながるメカニズムを研究するために、酸素誘発性網膜症のマウスモデルを採用しているプロトコルを提供する。説明したシステムはまた、網膜およびCNS内の機能の血管の成長を促進するための戦略を探求するために利用することができる。...

マウス網膜を使用してCNSにおける血管再生の評価

多くのビジョンを脅かす眼疾患は、網膜血管の機能不全に関連付けられます。したがって、網膜血管応答の測定は、根本的な病態生理学的メカニズムを調査することが重要です。この記事では、マウスの網膜細動脈の分離と血管作動性物質の血管径に及ぼす影響を評価するために準備のための詳しいプロトコルについて説明します。...

マウス網膜細動脈Ex Vivoでの反応性の測定の準備手順

このプロトコルは、マウス網膜フラットマウントの調製および免疫蛍光染色および分析のための詳細な方法を記載する。マウスの仔に対するフルオレセイン眼底造影(FFA)の使用および画像処理についても詳細に説明されている。...

酸素誘発網膜症マウスモデルにおける網膜血管の動的成長のモニタリング

ここで説明する、商業バイオアナライザを用いた ex vivo...

Ex Vivoのレティナル組織サンプルにおけるミトコンドリア呼吸と解糖の測定

糖尿病性網膜症は、失明の主な原因の1つです。組織学、血液網膜関門破壊アッセイ、および蛍光血管造影は、網膜の病態生理学を理解するための貴重な技術であり、糖尿病性網膜症に対する効率的な薬物スクリーニングをさらに強化することができる。...

ラットモデルにおける網膜病態生理学的評価

この記事では、実装網膜製剤全体に対する確立された再現性のあるレクチン染色アッセイと、増殖性および不拡散性網膜症において頻繁に変化する血管パラメータの定量的測定に必要なプロトコルについて説明する。...

不拡散性網膜症を有するマウスの全型網膜における血管パラメータの定量化

ここでは、複雑な組織における機能的に関連するカスパーゼを同定、検証、標的化するための詳細な免疫組織化学プロトコルを示します。...

網膜組織における免疫染色カスパーゼ-9の定量

マウスモデルは、網膜色素上皮(RPE)の生物学を調べるための有用なツールとなり得る。マウスは一連のRPE病理を発症する可能性があることが確立されています。ここでは、光、透過電子、および共焦点顕微鏡を使用してマウスのRPE病理を解明および定量化するための表現型プロトコルについて説明します。...

加齢黄斑変性症マウスモデルにおける網膜色素性上皮病変を評価および定量化するためのプロトコル

酸化ストレスやサイトカインなどの糖尿病/糖尿病性網膜症関連の侮辱による死に対する網膜血管系の回復力を監視するために、保護アッセイが開発されました。...

マウスの糖尿病関連死からの網膜血管系の保護を検出するためのアッセイ

私たちは最近、糖尿病に関連する網膜機能障害の新しいパラダイムとして網膜毛細血管硬化を特定しました。このプロトコルでは、網膜内皮培養物からマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスを単離する手順を詳しく説明し、続いて原子間力顕微鏡を用いた剛性測定技術について説明します。...

原子間力顕微鏡を用いた剛性測定のためのマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスの単離

蛍光トマトレクチンの眼窩後注射後、血小板由来成長因子受容体βによる免疫蛍光染色により、網膜血管系の周皮細胞を調べました。標識された網膜をさらに組織透明化法で処理し、共焦点顕微鏡下で網膜血管系を取り巻く周皮細胞の3次元ビューを視覚化するために全体をマウントしました。...

免疫染色によるマウス網膜血管周皮細胞の3D可視化 

学ぶトリプシン消化法によるマウス網膜血管網の分離と可視化技術。病理変化を明確に観察し、糖尿病性網膜症などの血管性疾患の病態理解に貢献する研究方法です。

トリプシン消化プロトコルモデルマウスの網膜血管系を分析する

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