トリプシン消化プロトコルモデルマウスの網膜血管系を分析する

この手順の全体的な目標は、網膜血管網を分離することです。これは、最初に分離された網膜で一連の水洗浄を行うことによって達成されます。第2ステップでは、網膜は、網膜のサイズに応じて、摂氏37度のトリプシンで約1〜1時間半

次に、血管系は、追加の水洗浄と顕微鏡下での解剖によって分離されます。最終的には、微小動脈瘤、毛細血管変性、異常な内皮細胞対寄生虫比などの病的な血管変化を可視化することができます。したがって、網膜フラットマウントの準備などの既存の方法に対するtry and digestの主な利点は、血管ネットワーク全体を非常に明確に強調表示できることです。

一般的に、この方法に不慣れな人は、技術的に困難で、一貫して実行するのが難しいため、苦労します。この方法は、血管分離のステップを言葉だけで学ぶのが難しいため、視覚的にデモンストレーションすることが重要です。これは、糖尿病性網膜症などの一部の疾患など、網膜血管生物学の研究を行っている研究室で非常に価値のあるツールであり、この手法を実証するのは、私の研究室の才能ある医学生であるジョナサン・チョウです。

除核したマウスの眼と10%中性緩衝ホルミンを24時間固定した後、眼をペトリ皿に入れ、少量の水で覆います。解剖はさみを使用して、角膜に最初の切り込みを慎重に行うことから解剖を開始します。次に、まっすぐな鉗子で切断領域を保持しながら、はさみを使用して角膜と角膜を取り除く強膜の境界に沿って切断します。

次に、細い、湾曲した、まっすぐな鉗子を使用します。強膜と脈絡膜を網膜から視神経に向かってゆっくりと慎重に剥がします。次に、レンズと余分な虹彩と破片を網膜から取り除き、神経網膜層を血管から分離します。

約500マイクロリットルの45マイクロメートルで24ウェルプレートにろ過された水を入れ、網膜をウェルに入れ、室温で4〜5時間静かに振とうし、30〜60分ごとに水を交換します。網膜を水で一晩中穏やかに振って洗い続けます 翌日、室温で水を取り除き、3%トリプシンで顕微鏡でチェックして、井戸に破片が見つからないことを確認します。血管系が付着するのを防ぐために、組織を摂氏37度で1〜1時間半穏やかに振るまたは振とうせずにインキュベー

組織が崩壊の兆候を示し始めたら、プレートを顕微鏡ステージに置き、網膜を避けます。トリプシンを慎重に取り除き、血管系を分離します。まず、鉗子を使用して網膜にろ過した水を追加します。

薄く透明な層として現れる内部の制限膜をはがします。軽く攪拌しながらプレートを振ってください。5分後、プレートを顕微鏡ステージに再度置き、網膜への損傷を避けて慎重に水を交換し、付着した網膜組織から血管のネットワークを解放します。

最後の洗浄後、水中に破片がほとんどまたはまったく残らなくなるまで、示したように網膜を洗浄します。したがって、通常、すべての非血管組織を切除することは、手順の最も難しい部分です。次の技術は、順番に、または個別に使用することができます 血管ネットワークの分離を容易にするために、1つの重要なヒントは、網膜を操作する前にすべてのツールとトリプシンを浸すことです。

これにより、組織が機器に付着するのを防ぐことができます。200マイクロリットルのマイクロピペットチップに予約済みのトリプシンをコーティングし、次に網膜血管に隣接して網膜血管に向かって水を慎重に上下にピペットで動かし、穏やかに攪拌します。非血管組織がまだ抵抗性の中心にある場合は、視神経でトリプシンコーティングされたマイクロピペットチップと、血管ネットワーク全体を慎重に上下にピペットで動かして、非血管組織を分解するのに役立ちます。

最後に、大丈夫です。鉗子を使用して、血管系を水からそっと持ち上げ、付着した非血管成分を取り除くことができます。最終結果は、無傷の破片のない網膜血管系ネットワークになるはずです。

血管系を視覚化するには、まずきれいなスライドに水滴を置きます。次に、スコープチェックの下で消化された容器を水に移します。VAのフラップマウントを折りたたんだり広げたりすると、容器が折りたたまれると視界が悪くなります。

染色後、組織が折りたたまれている場合は、さらに水を加え、スライドを静かに振って広げやすくします。次に、マイクロピペットを使用して、余分な水分をゆっくりと取り除きます。成功した手順の最終製品は、マウス網膜血管系のネットワーク全体をフラットマウントし、構造を維持し、ヘマット、トイン、およびエオインで染色することです。

このように、この画像に見られるように、網膜では内皮細胞と周皮細胞との明確な分化が観察できます。白い矢印で示されているように、内皮細胞の核は楕円形または細長く、完全に血管壁の内側にあります。寄生虫の核は黒矢印で示されており、小さく、球形で密に染色されており、一般に毛細血管壁に沿って突出した位置にあります。

トリプシンと消化物は、糖尿病動物モデルで血管の病理を分析するために使用される一般的な手順です。この画像は、2型糖尿病のモデルであるDB DBマウスで観察された白い矢印で示された毛細血管変性の例を示しています。この手順はマウスの網膜に最適化されていますが、ラットの網膜でも同様の結果が得られます。

これらの画像に示されているように、ラットの網膜はマウスの網膜よりも大きく、24枚ではなく12枚のプレートが必要であることに注意することが重要です。ラット網膜の血管系ネットワークも、マウスの網膜よりも脆弱ではありません。非血管組織をできるだけ多く除去することは非常に重要です。

残骸があると、非特異的な染色につながり、血管系の視覚化が不十分になります。この画像では、例えば、非血管組織全体の除去の失敗が観察できます。同様に、血管系の視覚化を改善するために、取り付け時に網膜を広げることも重要です。

この画像は、血管フラットマウントの展開が失敗したことを示しています。この技術的に難しい手順をマスターした後。トリップとダイジェストは、血管ネットワーク全体を詳細に視覚化できる非常に価値のある方法です。

マウスの眼でこの技術を改善することにより、研究者は遺伝子操作されたマウスを利用して、網膜血管系を制御できるさまざまな経路を研究し、さまざまな網膜疾患の病態生理学を理解することができます。これにより、糖尿病性網膜症などの疾患の病理に対する理解を深めることができます。DVDBマウスのようなマウスモデルを研究することで、最終的には網膜血管系を標的とする新たな治療的介入の可能性を見つける機会を得ることができます。