肺炎球菌による鼻腔内コロニー形成時の炎症反応の特徴

この手順には、肺炎球菌による鼻咽頭のコロニー形成と、その後のコロニー形成細菌、および接着細胞または動員細胞の抽出が含まれます。これは、最初にS肺炎の細菌接種物を調製することによって達成されます。興味の株。

次いで、生きた細菌を麻酔マウスに鼻腔内投与するが、マウスは拘束装置内にいる間に、所望のコロニー形成期間の後、マウスは安楽死させ、露出した気管をカニューレで流し、NASを通じて内容物を洗い流すことによって鼻洗浄を行う。鼻洗浄液中に存在する細菌の数は、微生物学的手法を用いて定量化することができます。あるいは、免疫応答は、フローサイトメトリー技術を使用してリクルートされた細胞を表現型化するか、定量的PCR技術を使用してアッセイすることができます。

開始前に目的の発現mRNAのレベルを測定するには、手技の鼻腔内コロニー形成部分にはマウス拘束具を、鼻洗浄にはカニューレ針を準備する必要があります。マウスレストレインは、50ミリリットルのファルコンチューブの先細りの先端を切り落とすだけで作製できます。絞りを作成したら、はさみを使用して鋭い端を磨いてください。

カニューレ針の調製には、内径0.38ミリメートルの次のPE20ポリエチレンチューブが必要になります。1ミルの注射器は、26本と3本の8ゲージの斜角針、一対の鋭く細かい虹彩、はさみ、および一対の鉗子で蓋が付けられています。PE 20チューブを細いハサミで約2.5センチメートル(1インチの長さ)に切断し、両端の先端が斜めになるようにします。

鉗子を使用して、これらのピースの1つを針の先端に慎重にスライドさせます。チューブ側に穴を開けるのを避けて、カニューレ針は必要になるまで70%エタノールに保ち、使用前にPBSで直接洗い流すことができます。S pmoを用いたマウスの鼻腔内コロニー形成には、10マイクロリットルで送達される1ミルあたり9コロニー形成単位に10〜10の濃度を使用することをお勧めします。.

10から7 CFUの最終用量については、接種物を使用直前まで氷上に保ち、各コロニー形成の間に攪拌するようにしてください。接種材料に加えて、P 10またはP 20ピペット滅菌ピペットチップとマウス拘束具も必要になります。個々のマウスを尻尾で隔離し、事前に準備したマウス拘束装置に入れて拘束します。

マウスを拘束具に向けるのに問題がある場合は、マウスをマウスの前と上に配置して、動物が上向きに這うことができるようにすると役立つ場合があります。マウスがレストレインの内側に入ったら、マウスの体の付け根でしっかりと固定し、鼻がレストレインの先細りの端から出てくるように、マウスを優しく上に押し上げます。P 10またはP 20ピペットを使用して、調製した培養物を10マイクロリットル沈殿させることにより、各マウスに接種し、両マウスに均等に分配します。ネアーズ。

マウスが接種物を吸い込むのに必要な時間をかけて、接種液をパルス化して、接種液を鼻に滴下させます。マウスは鼻から接種物の一部をくしゃみすることがありますが、これは予想されます。この手順では、細菌が鼻咽頭に局在し、下気道に広がらないように、マウスに麻酔をかける必要があることに注意してください。

このデモンストレーションでは、PBSを接種していますが、生きた細菌を扱うときは、研究所が承認したガイドラインに従って手順を実施してください。たとえば、ほとんどの機関では、バイオセーフティレベル2のフードでコロニー形成を行う必要があります。エンドポイントモニタリング方法の一部として体重指標を利用する場合、コロニー形成直後のMAは、無気力、フリルの毛皮、体重減少などの臨床症状について12〜24時間ごとにマウスを監視します。

マウスがコロニーを形成したら、必要な期間保持します。この期間の終わりに、マウスは安楽死させられ、頸部脱臼が気管を損傷する可能性があるため、鼻洗浄が行われます。この安楽死の方法は避けなければなりません。

鼻洗浄を行う前に、次のものが手元にあることを確認してください。事前に調製したカニューレ針、70%水性エタノール、一対の鉗子、一対の鋭利な細い虹彩はさみ、リン酸塩、緩衝生理食塩水、RNA溶解緩衝液、および1ミルのアイノールチューブ。準備ができたら、動物を仰向けに平らに置き、70%の水性エタノールを使用して、毛皮の前面、特に首の部分を滅菌します。

エタノールが鼻孔にアクセスできないように注意してください。動物の首の正中線に沿って縦方向に1つの切り込みを入れ、気管を想像するための開口部を作成できるようにします。皮膚を慎重に両側に剥がし、その下の首の組織を露出させます。

この時点で、気管は両側の縦方向の筋肉に囲まれて見えるはずです。これらを慎重に切り取って、気管自体がはっきりと見えるようにし、周囲の血管系を切断しないように注意してください。誤って血管系を切断し、進行する前にその領域に血液が存在してしまった場合。

出血が止まるのを待ってから、滅菌PBSを調剤し、滅菌ガーゼを使用して余分な水分をやさしく吸収することにより、その領域を数回洗浄します。気管が適切に露出したら、気管の約半分に半月横切込みを入れます。滅菌PBSをカニューレ付きシリンジに滴下します。

カニューレを鼻に向かって気管に挿入し、斜めの端を下に向けたままにして、挿入を容易にします。カニューレが所定の位置に配置されたら、180度回転させ、軽い抵抗を感じるまでゆっくりと上向きにプローブします。サンプル採取用に指定されたEENDDPHチューブをマウスの鼻のすぐ下に置きます。

最小限の量のPBS洗浄液を分注することにより、カニューレの正しい配置をテストします。これに続いて、カニューレが正しく配置されている場合、マウスのNASの周りに液体の滴が形成されるはずです。テストPBSが動物の口から直接出てきた場合は、カニューレを引き戻し、非常にわずかな抵抗が感じられるまでゆっくりと前方に探り、再び位置を変えます。

カニューレを鼻口蓋を通り過ぎて口腔に移動するため、カニューレをこの抵抗を超えて押しすぎないように注意してください。カニューレが正しく配置されていることを確認したら、200マイクロリットルのPBSを迅速に分注して、最大量の細胞を置換して収集します。内容物はマウスの鼻孔を通って収集チューブに流れ出る必要があります。

サンプルをすぐに氷の上に置きます。これらのサンプルは、その後、細菌負荷と細胞動員についてアッセイできます。RNA分析用のサンプルを採取するには、500マイクロリットルのRNA溶解バッファーを含む別のカニューレ針を使用して、二次鼻洗浄を行います。

RNA溶解バッファーは上皮を剥離し、周囲の組織を破壊することに注意してください。そのため、肺などの臓器との接触を避けるように注意する必要があります。鼻咽頭細菌負荷を定量化するためにこれらの組織の保持が必要な場合は、次のものが必要になります。

エピコールチューブ、三連祭壇画大豆卵を含む微生物プレートには、5%の羊の血液が補充されています。ボルテックスミキサー、PBS滅菌ピペットチップ、P20およびP200ピペット。まず、BSL 2フードで作業し、各みりん鼻洗浄サンプルの段階希釈シリーズを準備します。

一般に、鼻咽頭における肺炎球菌の濃度は、0 から 10 から 4 CFU の間であると予想できます。したがって、10倍の段階希釈を3回行い、10マイクロリットルのきれいな鼻洗浄サンプルを最初のチューブに10マイクロリットルの濃度で加え、1ミルあたりマイナス1CFUの濃度まで追加し、各希釈の間に3つのサンプルを過度に渦巻いて希釈するまで下降を続けます各希釈の間に完全に渦巻く。このビデオはデモンストレーションのみを目的としていることに注意してください。

dilu間でピペットチップを交換することを含む適切なラボ手法は、常にシャーピーを使用して論理プレートに戻し、それを論理プレートに戻し、対応する希釈で象限にラベルを付けてメッキする必要があります。各希釈液の10マイクロリットルのサンプルを3滴、寒天プレートにプレートアウトします。これらを蓋をせずに15〜30分間乾燥させてから、プレートを覆い、肺炎球菌の成長に最適な条件(通常は摂氏37度、CO2の5%)で細菌インキュベーターに逆さまに置きます。

これらのプレートを24〜48時間インキュベートします。この期間が経過したら、プレートを取り外し、プレート上に形成されたコロニーを平均化して、コロニーを形成する細菌の数を決定します。希釈するたびに、アニモコロニーは、その独特のベージュ色、各コロニーの周りの小さなハローであるアルファ溶血のゾーンによって識別でき、寒天中の血液サプリメントの細菌消化によって作成されます。

そして最後に、各コロニーの中心にある小さなくぼみによって、赤血球の外観を与えます。このビデオを見た後、鼻咽頭es pmoを確立する方法、マウスのコロニー形成、コロニー形成後にマウスの鼻咽頭から細菌と細胞を分離する方法、鼻洗浄液を使用する方法、および微生物学的手法を使用して対応する細菌負荷を定量化する方法についてしっかりと理解しているはずです。このビデオで説明されている方法が、コロニー形成の鼻腔内モデルを使用して、この研究が進んでいない地域の状況で病原体に対する宿主の応答を研究することを奨励することを願っています。