肺炎球菌による鼻腔内コロニー形成時の炎症反応の特徴

この手順では、マウスの鼻咽頭にstreptococcus pneumoniaを定着させ、その後、定着した細菌ならびに付着または動員された細胞を回収します。まず、目的のS pneumonia株の細菌接種液を調製することから始めます。

次に、拘束器具に入れた麻酔状態のマウスの鼻腔内に生菌を投与します。目的の定着期間を経た後、マウスを安楽死させ、露出させた気管にカニューレを挿入し、鼻腔内を洗浄して内容物を回収することで、鼻腔洗浄液を採取します。鼻腔洗浄液中の細菌数は、微生物学的手法を用いて定量できます。あるいは、集積した細胞の表現型を解析するフローサイトメトリー法や、定量PCR法を用いて免疫応答を評価することも可能です。

開始前に目的のmRNAの発現レベルを測定するために、手順の経鼻定着部分に使用するマウス拘束具と、鼻腔洗浄用のカニューレ付き針を準備する必要があります。マウス拘束具は、50 mLのファルコンチューブの先細りの先端部分を切り取ることで簡単に作成できます。開口部を作成したら、必ずハサミを使用して鋭利な端を滑らかに整えてください。

カニューレ針を準備するために、内径0.38 millimetersのPE 20ポリエチレンチューブ、26-3/8ゲージの斜辺針を装着した1 mLシリンジ、鋭利で細いアイリス剪刀、およびピンセットを用意します。細い剪刀を使用して、PE 20チューブを長さ約2.5 centimeters（1インチ）に切り分け、各端が斜辺状になっていることを確認してください。

ピンセットを使用して、これらの断片の1つを慎重に針先にスライドさせます。チューブ側を突き刺さないように注意してください。カニューレ付き針は、使用時まで70% ethanolに浸して保存し、使用直前にPBSでフラッシュすることができます。マウスへのS pmoの鼻腔内定着には、10⁹ colony forming units/mLの濃度で10 µL投与することを推奨します。

最終投与量を10⁷ CFUとするため、接種液は使用直前まで氷上に保持し、各コロナイゼーションの間に必ず撹拌してください。接種液に加えて、滅菌済みピペットチップを装着したP10またはP20ピペット、およびマウス拘束具が必要です。マウスの尾を掴んで個体を分離し、あらかじめ準備したマウス拘束装置に入れて固定します。

マウスを保定器に入れるのに苦労する場合は、保定器をマウスの前方かつ上方に配置し、動物が上に向かって這い上がれるようにすると有効です。マウスが保定器に入ったら、体の付け根部分で固定し、鼻先が保定器のテーパー状の端から出るように、ゆっくりと押し上げます。P 10またはP 20ピペットを用いて、調製した培養液を10 µLずつ、両鼻孔に均等に分注し、接種します。

接種液をゆっくりとパルス状に滴下し、マウスが接種液を吸い込むのに十分な時間をかけながら、鼻腔内へ滴下させます。マウスが接種液の一部をくしゃみで排出することがありますが、これは想定内の反応です。細菌が鼻咽頭に留まり、下気道へ広がらないようにするため、この操作ではマウスを麻酔させる必要があることに注意してください。

本デモンストレーションではPBSを用いて接種しますが、生きた細菌を扱う際は、必ず機関が承認したガイドラインに従って手順を実施してください。例えば、多くの機関では、定着操作をバイオセーフティレベル2のフード内で行うことが義務付けられています。エンドポイントモニタリングの手法として体重指標を利用する場合、定着直後にマウスの体重を測定し、その後12〜24時間ごとに、嗜眠、被毛の乱れ、体重減少などの臨床症状がないかマウスを観察してください。

マウスに定着させた後、任意の期間維持します。この期間の終了時にマウスを安楽死させ、鼻腔洗浄を行います。頸椎脱臼は気管を損傷させる可能性があるため、この安楽死方法は避けなければなりません。

鼻腔洗浄を行う前に、以下のものを準備してください。事前に準備したカニューレ針、70% aqueous ethanol、ピンセット、先みの細かいアイリス剪刀、リン酸緩衝生理食塩水、RNA lysis buffer、および1 mL エッペンドルフチューブです。準備が整ったら、動物を仰向けに寝かせ、70% aqueous ethanol を使用して前身の毛、特に頸部周辺を滅菌します。

エタノールが鼻腔に入らないよう注意します。動物の頸部の正中線に沿って縦方向に1回切開し、気管を確認できる開口部を作ります。皮膚を慎重に両側に剥離し、下にある頸部組織を露出させます。

この時点で、気管が左右の縦走筋に囲まれて見えているはずです。周囲の血管を切断しないように注意しながら、これらの筋肉を慎重に切り取り、気管自体を明確に視認できるようにします。誤って血管を切断し、次へ進む前にこの領域に血液が存在する場合は、適切に処置してください。

止血後、滅菌PBSを注ぎ、滅菌ガーゼを用いて余分な水分を優しく吸い取る操作を数回繰り返し、患部を洗浄します。気管が適切に露出したら、気管の中ほどに横方向の半月状の切開を加えます。その後、カニューレ付きシリンジに滅菌PBSを入れます。

挿入しやすくするため、斜辺を下に向けたまま、カニューレを鼻の方に向かって気管に挿入します。カニューレが所定の位置に収まったら、180度回転させ、軽い抵抗を感じるまでゆっくりと上方に進めます。サンプル回収用のEEND DPHチューブをマウスの鼻のすぐ下に配置します。

少量のPBS洗浄液を注入し、カニュラの設置位置が正しいか確認します。カニュラが正しく設置されていれば、マウスのNAS周囲に液滴が形成されるはずです。テストに使用したPBSが動物の口から直接流出した場合は、カニュラを一度引き戻し、わずかな抵抗を感じるまでゆっくりと前方へ挿入して、再度位置を調整してください。

カニューレをこの抵抗感を超えて押し込みすぎないように注意してください。押し込みすぎると、鼻口蓋を通り越して口腔腔まで到達してしまいます。カニューレが正しく配置されていることを確認したら、200 µLのPBSを急速に投与し、最大限の細胞を追い出して回収してください。内容はマウスの鼻孔から流れ出し、回収チューブに入ります。

サンプルを直ちに氷上に置きます。これらのサンプルを用いて、その後、細菌量および細胞動員を測定できます。RNA解析用のサンプルを回収するには、500 µLのRNA溶解バッファーが入った別のカニュレーション針を使用して、2回目の鼻腔洗浄を行います。

RNA溶解バッファーは上皮を剥離させ、周囲の組織を破壊することに注意してください。そのため、肺などの臓器に接触しないよう慎重に操作する必要があります。鼻咽頭の細菌量を定量するためにこれらの組織の保持が必要な場合は、以下が必要となります。

Epicorチューブ、および5%羊血を添加したトリプチカ・ソイ・エッグ・酵母（Tryptic Soy Egg）含有微生物用プレートを用意します。また、ボルテックスミキサー、滅菌済みPBS、ピペットチップ、およびP 20およびP 200ピペットを使用します。まず、BSL-2フード内で、各鼻腔洗浄検体について段階希釈系列を調製します。

一般的に、鼻咽頭における S pneumoniae の濃度は 0 から 10⁴ CFU の間であると予想されます。したがって、10倍段階希釈を3回行います。まず、未希釈の鼻腔洗浄検体 10 µL を1本目のチューブに加え、濃度を 10⁻¹ CFU/mL とし、3つのサンプルを十分に希釈するまでこの操作を繰り返します。各希釈の間には、十分にボルテックスにかけてください。なお、このビデオはデモンストレーション目的であることをご了承ください。

希釈段階ごとにピペットチップを交換するなど、適切な実験手技を常に遵守してください。油性ペンを使用して、元のロジカルプレートを4等分に区切り、各区画にプレートに塗布する対応する希釈倍率を記入します。各希釈試料を 10 µL ずつ3滴、アガープレートに分注します。蓋を開けたまま 15 ～ 30 分間乾燥させた後、プレートに蓋をし、肺炎球菌の増殖に最適な条件（通常は 37 °C、5% CO2）に設定された細菌培養インキュベーターに倒立して保管します。

これらのプレートを24〜48時間インキュベートします。この期間の後、プレートを取り出し、プレート上に形成されたコロニー数を平均して、定着細菌数を決定します。各希釈段階において、animoコロニーは、その特徴的なベージュ色と、寒天培地中の血液サプリメントを細菌が消化することによって各コロニーの周囲に形成される小さなハローであるα溶血帯によって識別できます。

そして最後に、各コロニーの中心に小さな陥凹があり、それが赤血球のような外観を与えます。このビデオを視聴することで、マウスにおける鼻咽頭の定着を確立する方法、定着後の鼻腔洗浄を用いてマウスの鼻咽頭から細菌および細胞を分離する方法、そして微生物学的手法を用いて対応する細菌量を定量する方法について、十分な理解を得られたはずです。このビデオで説明した手法が、この研究が進んでいない領域における病原体への宿主応答を研究するための、経鼻定着モデルの利用を促進することを願っています。